Способ выделения высокодисперсных фрагментов пурпурных мембран, содержащих бактериородопсин

 

Использование: в биотехнологии и фотохимической и электронной промышленности, в научно-исследовательской практике при изучении фото- и электрохромных превращений, для приготовления биологического фоторегистрирующего материала многоразового использования. Сущность изобретения: продукт: фрагменты пурпурных мембран, содержащих бактериородопсин; выход от 1 до 1,6 г из 100 г биомассы; средний размер частиц пурпурных мембран от 59 до 390 нм; стандартное отклонение распределения частиц по размерам от 31 до 115 нм; индекс 1(280/560) = 1,91-2,05. Способ предусматривает выделение пурпурных мембран из биомассы галофильных бактерий методом циклической экструзии под давлением от 10 до 150 МПа при количестве циклов от 1 до 5, а последующую процедуру центрифугирования и отмывки в бидистиллированной воде осуществляют при 25000-100000 в течение 30 мин каждая до тех пор, пока отношение оптических плотностей суспензии фрагментов пурпурных мембран при длинах волн 280 нм и 560 нм становится равным от 1,9 до 2,1. 1 з.п. ф-лы, 5 ил.

Изобретение относится к микробиологии и касается способа выделения белков, а именно бактериородопсина (БР), из микроорганизмов и может быть использовано в биотехнологии и химической промышленности, в научно-исследовательской практике при изучении фото- и электрохромных превращений, а также для приготовления биологического фоторегистрирующего материала многоразового использования.

Кроме того, изобретение может быть использовано в микробиологической промышленности для дезинтеграции микроорганизмов с целью получения из них других различных ферментов.

Внутриклеточные ферменты являются важным сырьем для различных наукоемких технологий. Получить их можно в результате разрушения клеток дезинтеграции. Дезинтеграция применяется также и для последующей фрагментации внутриклеточных структур. Дезинтеграция является центральной технологической процедурой для многих промышленных процессов и производств современной биотехнологии, связанных с получением внутриклеточных ферментов. Существуют различных методы дезинтеграции микроорганизмов: осмотический, баллистический, экструзионный, криоэкструзионный и т.п.

Изобретение относится к методам выделения белка бактериородопсина (БР) из микроорганизмов вида Halobacterium halobtum методом экструзионной дезинтеграции.

В начале 70-х годов в США были проведены эксперименты с БР, выделенным из галофильных бактерий вида Halobacterium halobtum, которые показали, что БР является фотоэлектрическим преобразователем энергии [1] На основе БР стало возможным изготовление светочувствительных бессеребряных фотоматериалов. Хотя пленки на основе БР имеют светочувствительность на 3-4 порядка хуже, чем галогенсеребряные фотоматериалы, им присуща высокая стабильность свойств во времени, возможность многократного использования, высокая плотность записи информации. БР является весьма перспективным носителем информации и может быть применен в вычислительной технике, использующей лазерную форму записи информации. БР может быть использован в качестве преобразователя световых сигналов высокой до 10⁵ МГц частоты и для получения голографических изображений при низких температурах.

Микроорганизмы рода Halobacterium представляют собой в основном палочки диаметром порядка 0,5-1,0 мкм и длиной 3-10 мкм. Среда обитания галобактерий сильно засоленные водоемы, расположенные в районах с жарким климатом и значительной солнечной радиацией. Для промышленных целей микроорганизмы рода Halobacterium искусственно культивируются.

Клеточная оболочка состоит из клеточной мембраны и двух наружных белковых слоев. Клеточная стенка имеет размер 17-18 нм и состоит в основном из гликопротеина и частиц белковой природы. Бактериальная мембрана имеет толщину 5-7 нм и состоит из белоклипидного бислоя со специфическими участками. Эти участки состоят из так называемых пурпурных мембран (ПМ), содержащих сотни тысяч молекул БР. Молекулы БР упакованы в гексагональные структуры. Понижение концентрации хлористого натрия в окружающей среде до 2 М ведет к осмотической дезинтеграции обоих белковых слоев и гибели микроорганизма в результате осмотического шока. Это явление часто используется для выделения БР. При выделении ПМ из клеток методом осмотического шока они сохраняют свой размер и структуру. Толщина ПМ постоянна и не превышает 5 нм, а размер их варьируется от долей до единиц микрона и зависит от режима культивирования клеток. ПМ содержат 75% БР и 25% липидов. Молекулы БР практически пронизывают ПМ насквозь и строго ориентированы в ней.

При создании ориентированных мономолекулярных пленок БР для фоторегистрирующего материала многоразового использования большое значение имеют средний размер фрагментов БР и величина их разброса относительно среднего размера. Уменьшение среднего размера фрагментов БР и уменьшение разброса (стандартного отклонения) увеличивает однородность фоторегистрирующего материала многоразового использования.

Для получения ПМ из клеточного материала производится культивирование галобактерий, например Halobacterium halobtum, причем культивирование осуществляется одним из известных способов и при условиях, способствующих образованию ПМ, например низком содержании кислорода в среде и на свету [1] После соответствующего времени культивирования клетки собирают известным способом в клеточную биомассу, которая и служит исходным продуктом для выделения фрагментов ПМ, содержащих БР.

Из научно-технической и патентной литературы известно, что излечение РБ из клеток микроорганизмов основано на следующих трех основных этапах: 1) дезинтеграции клеток микроорганизмов; 2) осаждение ПМ центрифугированием; 3) многократной очистке БР.

При этом дезинтеграция клеток микроорганизмов проводится с помощью следующих операций: а) осмотический шок и лизис клеточной стенки ДНКазой [1, 2, 3, 4] б) осмотический шок без ДНКазы [3] в) ультразвуковая (УЗ) обработка [6] В результате дезинтеграции образуются фрагменты ПМ различного размера, содержащие БР.

После дезинтеграции микроорганизмов необходимо осадить фрагменты все ПМ. Это производится, согласно литературным источникам, путем центрифугирования.

После центрифугирования и концентрации фрагментов ПМ их необходимо очистить от сопутствующих фрагментов, таких как каротиноиды. По литературным данным, это делается с помощью следующих операций: а) диализ [1]
б) центрифугирование в градиенте плотности сахарозы [2]
в) центрифугирование и отмывка деионизированной водой [4]
г) сочетание диализа и центрифугирования [1, 2, 3]
д) гельфильтрационная колоночная хроматография [5]
Чистоту препарата, содержащего БР, проверяют согласно литературным публикациям, по спектрам поглощения при длинах волн 280 и 560 нм. Отношение оптических плотностей D_λ при этих длинах волн (индекс 1(280/560) не зависит от концентрации БР и может служить критерием чистоты препарат БР. При этом известно, что индекс 1(280/560) должен быть в пределах 1,9-2,1.

Широко известен способ получения БР, описанный в [1]
Этот метод получения БР является классическим и большинство других способов являются его модификацией.

Согласно D.Oesterhelt и W.Stoeckenius, ПМ могут быть получены путем разрушения клеточной стенки осмотическим шоком, осаждением ПМ и их центрифугированием в градиенте плотности сахарозы 0,5-1,5 М от 30 до 50 мас. сахарозы.

В этом способе клетки галобактерий после культивирования осаждают в биомассу при 20000 g и дезинтегрируют осмотическим шоком под действием воды или низкоконцентрированного раствора хлористого натрия. При этом выделяющиеся нити клеточной ДНК препятствуют процессу разрушения осмотическим шоком. Поэтому приходится применять для расщепления клеточной ДНК дорогостоящий фермент ДНКазу (цена по каталогу фирмы SERVA 1991 г, $55-62 за 5 мг). При этом расход ДНКазы составляет 5 мг на объем суспензии биомассы от 200 мл до 2 л.

Полученный таким образом лизат центрифугируют и промывают водой несколько раз. Затем центрифугируют в градиенте сахарозы.

Выход БР составляет 50 мл БР из 4 л суспензии клеток галобактерий. Расход ДНКазы составляет 2,5 мг/л суспензии биомассы.

Оценка качества очистки БР проводится оптическим методом по индексу I D₂₈₀/D₅₆₀, который изменяется для хорошо очищенных суспензий в пределах 2,0 до 2,1. Средний размер фрагментов ПМ, содержащих БР составляет 500-700 нм.

Широко известной модификацией орисанного метода является способ [2]
В этом способе лизат, полученный после осмотического шока с присутствием ДНКазы, подвергают диализу против воды или низкоконцентрированного раствора NaCl. Очистку БР проводят путем центрифугирования ПМ в ступенчатом градиенте сахарозы со ступенями 4, 40, 38, 36 и 16 мас. сахарозы.

Оценка чистоты БР проводится также оптическим методом по индексу I D₂₈₀/D₅₆₀.

Известен способ, являющийся модификацией метода B.M.Becher и J.Y.Cassim, в котором дезинтеграцию проводят осмотическим шоком без присутствия ДНКазы [3] В остальном способ принципиально не отличается от описанных выше способов.

В известном способе [4] дезинтеграцию проводят осмотическим шоком, при этом клеточную ДНК также расщепляют добавлением фермента ДНКазы. Затем лизат центрифугируют 5 мин при 300 об/мин для удаления примесей и посторонних клеточных мембран. После этого лизат разливают в плоские тонкостенные сосуды и освещают белым светом с диапазоном длин волн 530-700 нм в течение 1-2 ч в присутствии кислорода, что сокращает процедуру выделения БР с 22 до 5 ч. При этом выход БР составляет 50 мг на 1 г биомассы. Расход ДНКазы составляет 2,5 мг/мл суспензии биомассы.

Чистоту препарата проверяют по спектру поглощения в области 570 нм.

Известен способ получения ПМ, содержащих бактериородопсин [5] который отличается тем, что
а) получают известным способом клеточные мембраны клеток галобактерий и
б) для выделения ПМ из клеточных мембран используется гельфильтрационная хроматография.

Для получения клеточных мембран проводится культивирование галобактерий, например Halobacterium halobium, причем культивирование осуществляется известным способом при условиях, способствующих образованию ПМ, например низком содержании кислорода в среде и на свет [1] После соответствующего времени культивирования клетки собирают, например, с помощью клеточной массы известным способом получают клеточные мембраны. Предпочтителен метод диализа против деионизированной воды с последующим собиранием клеточных мембран путем центрифугирования. Затем мембранная фракция, содержащая эти ПМ промывается, желательно деионизированной водой.

Согласно изобретению, эти фракции клеточных мембран наносят на хроматографическую колонку, наполненную гельфильтрационным материалом, который имеет предел по молекулярному весу предпочтительно 2-10⁶ до 10⁹, особенно 10⁷-10⁹ и элюируются предпочтительно водой с удельной проводимостью 0,05-5 mS/см,, особенно 0,1 до 1,0 μS/см и значением рН предпочтительно от 6,0 до 7,5, особенно от 6,3 до 6,7 при температуре преимущественно от 1 до 30^oС, особенно от 4 до 10^oС.

Длина и диаметр хроматографической колонки могут быть различными; эти параметры зависят от количества очищаемых клеточных мембран. Так, например, для массы в 10-100 mg клеточных мембран оказались наиболее приемлемыми колонки длиной 50-100 см и диаметром 1,5-5 см.

Количество используемого разделяющего материала составляет 5-15 мл на мг подлежащих очистке клеточных мембран, наиболее предпочтительны массы от 9 до 11 мл/кг.

Желательно, чтобы скорость элюирования составляла 0,25-16 см/г, наиболее оптимальная скорость 0,5-6 см/г, причем в диапазоне давлений 0-5 бар создается сверхдавление, особенно предпочтительно сверхдавление в 0-500 мбар.

Рекомендуется использовать гельфильтрационные материалы с величиной частиц 20-150 мкм.

В соответствии с изобретением используются обычные гельфильтрационные материалы. Рекомендуется использовать сетчатые или несетчатые декстран, производные агарозы или сополимеры олигоэтиленгликоля, глицидилметакрилата и пентаэритролдиметакрилата.

Особенно рекомендуются в качестве гельфильтрационных материалов Sephacryl S1000 (речь идет о зарегистрированном торговом знаке фирмы Pharmacia АВ, Унсала, Швеция), BioGel А 150 (зарегистрированный товарный знак фирмы Biorad Laboratories, Ричмонд, Калифорния, США) и Fractogel TSK HW 75 (зарегистрированный товарный знак фирмы Merck, Дармштадт, ФРГ).

Вышеописанные методы имеют следующие недостатки:
1) высокие затраты на аппаратуру и ДНКазу;
2) использование ДНКазы или других детергентов ведет к некоторой потере нативности БР;
3) приготовление градиента сахарозы и удаление использованной сахарозы из полученных ПМ являются процедурами, занимающими большое количество времени;
4) малая производительность методов делает невозможным значительное увеличение массы очищенного БР;
5) фрагменты ПМ получаются крупным (D≥ 500 нм) и не подвергаются затем диспергированию и гомогенизации.

Во всех вышеописанных методах фрагменты ПМ, содержащие БР, не подвергаются специальному дроблению и гомогенизации.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемому результату является способ получения БР [6] взятый за прототип.

В этом способе выращивание бактерий вида Halobacterium halobium ЕТ-1001 и выделение фракций ПМ проводили по стандартной методике (см. D.Oesterhelt и W.Stoeckenius, Methods in Enzymology, 1974, v.31, Part A. p.667-678). Однако после выделение суспензию ПМ подвергали ультразвуковому (УЗ) диспергированию с целью уменьшения размеров фрагментов ПМ.

Диспергирование водной суспензии ПМ (концентрация белка 03, мг/мл) проводили в течение 1 ч на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при частоте 22 кГц и максимальной мощности в режиме: 5 мин озвучивания 1 мин отключения прибора. Температуру образца поддерживали около 0^oС. БР в исследованных дезинтегрированных фрагментах ПМ не теряет обычных спектральных и фотохимических свойств. УЗ метод позволяет получать мелкие (D≅ 30 нм) фрагменты, кластеры молекул БР в которых остаются целостными в структурно-функциональном отношении.

Однако этот метод имеет следующие недостатки:
1) большая продолжительность процесса УЗ диспергирования;
2) выделение большого количества тепла, для отвода которого необходимо интенсивное охлаждение;
3) малая производительность процесса;
4) воздействие чрезвычайно больших усилий сдвига на фрагменты ПМ в результате их кавитационного разрушения;
5) возможная потеря нативности БР от чрезвычайно больших усилий сдвига;
6) отсутствие возможности регулирования среднего размера фрагментов от величины УЗ воздействия.

Изобретение позволяет увеличить производительность процесса при его одновременном удешевлении. При этом возможно регулируемое уменьшение величины среднего размера частиц фрагментов ПМ, содержащих БР и стандартного отклонения их распределения по размерам.

Это достигается тем, что предлагаемый способ получения фрагментов ПМ размером от 50 до 400 нм, содержащих БР, предусматривает выделение ПМ из биомассы галофильных бактерий методом циклической экструзии под давлением от 10 до 150 МПа при количестве циклов от 1 до 5, а последующую процедуру центрифугирования и отмывки в бидистиллированной воде осуществляют при 25000 - 100000 g в течение 30 мин каждая до тех пор пока отношение оптических плотностей суспензии фрагментов ПМ при длинах волн 280 и 560 нм становится равным от 1,9 до 2,1. При этом возможен вариант, когда процедуру центрифугирования и отмывки в бидистиллированной воде осуществляют в два этапа, сначала при 25000 g в течение 30 мин, а затем при 100000 g в течение 30 мин попеременно.

Для осуществления предлагаемого способа были использованы микроорганизмы вида Halobacterium halobium штамма 353-П, которые после выращивания и сбора их в биомассу были дезинтегрированы на гомогенизаторе "Донор-1" при различных давлениях. При дезинтеграции биомасса помещалась в бидистиллят в концентрации около 10 мас. и циклически пропускалась от 1 до 5 раз через гомогенизирующий клапан при постоянном заданном давлении. Гомогенизирующий клапан имеет специальную конструкцию. Гомогенизирующее устройство снабжено камерой охлаждения, которая с помощью хладагента (воды), поступающего из внешнего контура, позволяет эффективно отводить избыточное тепло, образующееся в процессе дезинтеграции.

Анализ среднего диаметра липосом производился с помощью лазерного фотонного корреляционного анализатора "Coulter N 4". Метод заключается в том, что измеряют коэффициент диффузии в разведенной водной суспензии липосом в проходящем лазерном луче и путем корреляции коэффициента диффузии, определяемого по броуновскому колебанию частиц, определяют средний диаметр частиц и стандартное отклонение распределения диаметров частиц.

Центрифугирование дезинтеграта производилось на центрифуге УП-65.

Анализ оптической плотности суспензии фрагментов ПМ производился на спектрофотометре "Specord" (ГДР) на длинах волн от 210 до 700 нм.

На фиг.1 приведена схема последовательности выполнения операций выделения фрагментов ПМ, содержащих БР.

На фиг.2 показаны кривые зависимости среднего размера частиц фрагментов ПМ от давления дезинтеграции до (кривая 1) и после (кривая 2) центрифугирования и отмывки суспензии ПМ (g 100000). Видно, что центрифугирование и отмывка позволяют осадить и удалить посторонние клеточные фрагменты и собрать мелкие (до 100 нм) фрагменты ПМ.

На фиг.3 показаны кривые зависимости среднего размера частиц фрагментов ПМ от давления дезинтеграции для различных режимов центрифугирования и отмывки суспензии ПМ. Кривая 1 центрифугирование при g 25000 в течение 30 мин, кривая 2 g 100000 в течение 30 мин. Видно, что при большем значении величины гравитационной постоянной удается осадить и собрать более мелкие фрагменты ПМ.

На фиг.4 показаны кривые зависимости среднего размера частиц фрагментов ПМ от давления дезинтеграции (кривая 1) и стандартного отклонения распределения частиц фрагментов ПМ от давления дезинтеграции (кривая 2). Видно, что с увеличением давления распределение частиц фрагментов ПМ становится более узким, что говорит о большей однородности суспензии ПМ.

На фиг. 5 показана кривая зависимости отношения оптических плотностей суспензии фрагментов ПМ при длинах волн 280 и 560 нм (индекс 1(280/560) от среднего размера частиц фрагментов ПМ. Видно, что индекс 1(280/560), показывающий качество суспензии БР, практически не зависит от среднего размера частиц фрагментов ПМ.

Ниже приведены примеры конкретного выполнения предлагаемого способа.

Пример 1. Культуру галофильных бактерий Halobacterium halobium штамм 353-П культивировали известным способом. 40 л культуры клеток собирали в биомассу на проточной центрифуге С-44 при 17000 об/мин (30000 g) в течение 2 ч. Затем некоторое количество биомассы, например 100 г, переносили в стакан и разбавляли 1 л бидистиллята и перемешивали механической (магнитной) мешалкой в течение 10 мин. Получившийся сгусток клеточной биомассы заливали в расходную емкость гомогенизатора "Донор-1" и производили дезинтеграцию при давлении 150 МПа при количестве циклов дезинтеграции N 1. Дезинтеграт центрифугировали для осаждения крупных частиц и частиц механического загрязнения при 10000 g в течение Т 10 мин. Получившуюся однородную суспензию клеточных фрагментов центрифугировали для выделения высокодисперсных фрагментов ПМ, содержащих БР в течение Т 30 мин при 100000 g, супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в бидистилляте до исходного объема и вновь центрифугировали до тех пор, пока отношение оптических плотностей суспензии фрагментов ПМ при длинах волн 280 и 560 нм (индекс 1(280/560) не становилось больше или равно 2. После этого выделенную высокодисперсную фракцию ПМ, содержащую БР, ресуспендировали до нужной концентрации и измеряли средний размер фрагментов ПМ на фотонном корреляционном спектрометре "Coulter N4". Выход ПМ, содержащих БР, составил 1 г из 100 г биомассы или 1 г из 40 л культуральной жидкости. Средний размер частиц ПМ равен 106 нм, а стандартное отклонение распределения частиц по размерам равно 37 нм. Индекс 1(280/560) 1,98.

Пример 2. Способ выделения фрагментов ПМ, содержащих БР, повторяли по примеру 1, но дезинтеграцию проводили при давлении 10 МПа при количестве циклов дезинтеграции N 5. Дезинтеграт центрифугировали для осаждения крупных частиц и частиц механического загрязнения при 10000 g в течение Т 10 мин. Получившуюся однородную суспензию клеточных фрагментов центрифугировали для выделения высокодисперсных фрагментов ПМ, содержащих БР, в течение Т 30 мин при 100000 g, супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в бидистилляте до исходного объема и вновь центрифугировали до тех пор, пока отношение оптических плотностей суспензии фрагментов ПМ при длинах волн 280 и 560 нм (индекс 1(280/560) не становилось больше или равно 109. После этого выделенную высокодисперсную фракцию ПМ, содержащую БР, ресуспендировали до нужной концентрации и измеряли средний размер фрагментов ПМ на фотонном корреляционном спектрометре "Coulter N4". Выход ПМ, содержащих БР, составил 1,3 г из 100 г биомассы или 1,3 г из 40 л культуральной жидкости. Средний размер частиц ПМ равен 380 нм, а стандартное отклонение распределения частиц по размерам равно 112 нм. Индекс 1(280/560) 1,91.

Пример 3. Способ выделения фрагментов ПМ, содержащих БР, повторяли по примеру 1. Дезинтеграцию проводили при давлении 150 МПа при количестве циклов дезинтеграции N 1. Дезинтеграт центрифугировали для осаждения крупных частиц и частиц механического загрязнения при 10000 g в течение Т 10 мин. Получившуюся однородную суспензию клеточных фрагментов центрифугировали для выделения высокодисперсных фрагментов ПМ, содержащих БР в течение Т 30 мин при 25000 g, супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в бидистилляте до исходного объема и вновь центрифугировали до тех пор, пока отношение оптических плотностей суспензии фрагментов ПМ при длинах волн 280 и 560 нм (индекс 1(280/560) не становилось больше или равно 2. После этого выделенную высокодисперсную фракцию ПМ, содержащую БР, ресуспендировали до нужной концентрации и измеряли средний размер фрагментов ПМ на фотонном корреляционном спектрометре "Coulter N4". Выход ПМ, содержащих БР, составил 1,1 г из 100 г биомассы или 1,1 г из 40 л культуральной жидкости. Средний размер частиц ПМ равен 390 нм, а стандартное отклонение распределения частиц по размерам равно 115 нм. Индекс 1(280/560) 1,987.

Пример 4. Способ выделения фрагментов ПМ, содержащих БР повторяли по примеру 1. Дезинтеграцию проводили при давлении 150 ПМа при количестве циклов дезинтеграции N 1. Дезинтеграт центрифугировали для осаждения крупных частиц и частиц механического загрязнения при 10000 g в течение Т 10 мин. Получившуюся однородную суспензию клеточных фрагментов центрифугировали для выделения высокодисперсных фрагментов ПМ, содержащих БР сначала при 25000 g в течение Т 30 мин, а затем при 100000 g в течение Т 30 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в бидистилляте до исходного объема и вновь центрифугировали до тех пор, пока отношение оптических плотностей суспензии фрагментов ПМ при длинах волн 280 и 560 нм (индекс 1(280/560) не становилось больше или равно 2. После этого выделенную высокодисперсную фракцию ПМ, содержащую БР, ресуспендировали до нужной концентрации и измеряли средний размер фрагментов ПМ на фотонном корреляционном спектрометре "Coulter N4". Выход ПМ, содержащих БР, составил 1,6 г из 100 г биомассы или 1,6 г из 40 л культуральной жидкости. Средний размер частиц ПМ равен 275 нм, а стандартное отклонение распределения частиц по размерам равно 91 нм. Индекс 1(280/560) 2,01.

Пример 5. Способ выделения фрагментов ПМ, содержащих БР, повторяли по примеру 4. Однако дезинтеграцию проводили при количестве циклов дезинтеграции N 5. Выход ПМ, содержащих БР, составил 1,6 г из 100 г биомассы или 1,6 г из 40 л культуральной жидкости. Средний размер частиц ПМ равен 59 нм, а стандартное отклонение распределения частиц по размерам равно 31 нм. Индекс 1(280/560) 2,05.

Предлагаемый способ позволяет получать более однородные и мелкие суспензии ПМ, содержащих БР, причем режим дезинтеграции позволяет регулировать средний размер частиц фрагментов ПМ и сам является более "мягким", чем УЗ дезинтеграция, где при кавитации развиваются давления 200-300 МПа и выделяется большое количество тепла.

Предлагаемый способ не предусматривает использование дорогостоящей ДНКазы. Он имеет большую производительность, чем предшествующие способы, и может быть автоматизирован.

Формула изобретения

1. Способ выделения высокодисперсных фрагментов пурпурных мембран, содержащих бактериородопсин, из галофильных бактерий методом дезинтеграции, путем многократных процедур центрифугирования, промывки осадка и ресуспендирования в бидистилляте или солевых растворах, отличающийся тем, что дезинтеграцию водной суспензии биомассы микроорганизмов проводят методом циклической экструзии под давлением 10 150 МПа от 1 до 5 циклов, а центрифугирование и отмывку осуществляют при 25000 100000 g в течение 30 мин каждая до тех пор, пока отношение оптических плотностей суспензии фрагментов пурпурных мембран при длинах волн 280 и 560 нм становится равным 1,9 2,1.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование и отмывку в бидистиллированной воде осуществляют в два этапа, сначала при 25000 g в течение 30 мин, а затем при 100000 g в течение 30 мин, чередуя этапы попеременно.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5