Штамм бактерий mycobacterium species иж 4, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов

 

Использование: для получения препарата, пригодного для очистки нефтепродуктов в очистных сооружениях, при биологической очистке промышленных сточных вод, при разливах нефти на поверхности водоемов и почв. Сущность изобретения: выделен новый штамм бактерий Mycobacterium species ИЖ 4 из накопительной культуры микроорганизмов-деструкторов нефтепродуктов, полученных из пробы ила с территории нефтебазы Архангельской области. Данный штамм утилизирует нефтепродукты в качестве единственного источника углерода в широком диапазоне температур и в относительно короткие сроки. 3 табл.

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

Известен штамм Pseudomonas aerugenosa PAO, содержащий плазмиды Cam, Oct, Nah, Sal, которые утилизируют отдельные углеводороды из состава нефти (патент США N 3813316, кл. 195-28, 1974 г.). Недостатком его является низкая скорость утилизации сырой нефти.

Известен штамм Pseudomonas aerugenosa 121, способный утилизировать октан (коллекция музея лаборатории внехромасомной наследственности ИБФМ АН СССР, 1976 г.).

Недостатком штамма является невысокая скорость и узкий спектр утилизируемых нефтепродуктов.

Широко применяется штамм Pseudomonas putida 36 (a.c. CCCP N 1076446, C 12 N 15/00, 1984 г.), обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов. Однако недостатком этого штамма является то, что он растет и утилизирует нефтепродукты лишь при сравнительно высокой температуре (28 30^oC). Процент утилизации нефти у Pseudomonas putida 36 составляет 68 74 на 30-е сутки. Недостатком данного штамма является и то, что при 4^oC он вообще не растет и утилизирует нефть только при высоких температурах.

Задачей изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в широком диапазоне температур в относительно короткие сроки.

Полученный штамм Mycobacterium sp ИЖ 4 выделен из пробы ила, загрязненной нефтепродуктами пос. Ижма Архангельской области.

Штамм депонирован Центральной коллекцией микроорганизмов Государственного концерна "Биопрепарат", коллекционный номер ЦКМ В-60Б.

Полученный штамм имеет следующие морфолого-культуральные и физиолого-биохимические признаки. Грамположительные прямые, изогнутые палочки 0,2 0,6 х 1,0 10 мкм, кислото- и щелочеустойчивые, неподвижные.

На мясопептонном агаре (МПА) через 48 часов дает мелкие, выпуклые, круглые с ровным краем, мелкозернистые колонии оранжевого цвета. По консистенции колонии пастообразные, не прозрачные, блестящие, легко снимаются петлей с агара.

В мясопептонном бульоне (МПБ) растет в виде осадка на дне, слабое помутнение среды, с образованием пристеночного кольца.

Культура растет на минеральной среде, используя в качестве источника углерода нефть и нефтепродукты.

Физиолого-биохимические свойства.

Углеводы не окисляет и не сбраживает за исключением глюкозы. Использует в качестве источника углерода цитраты и малонаты. Отношение к источникам азота: нитраты не восстанавливает, денитрификация отсутствует, фенилалонины не дезаминирует. В дополнительных факторах роста не нуждается. Протолитической активностью не обладает. Каталозоположительна, оксидазоотрицательна, обладает слабой уреазной активностью.

Факультативный аэроб, растет в температурном диапазоне от 4^oC до 40^oC оптимум 28^oC, оптимум рН 7,0.

Штамм не вирулентный, не токсичный, проверка проведена на белых мышах.

Условия хранения в лиофилизированном виде в ампулах при 4^oC. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на минеральной среде 8Е с нефтью и нефтепродуктами, а также на полноценной среде.

Пример 1. Штамм Mycobacterium sp ИЖ 4 выращивают в 250 мл колбах, содержащих 50 мл стерильной минеральной среды. Среды готовят на водопроводной воде, используя в качестве минеральной основы двузамещенный фосфат аммония в концентрации 0,75 г/л. Стерильную нефть и нефтепродукты вносят строго по весу с точностью до 0,05 мг. Концентрация углеводородного субстрата составляет 1% Среду инфицируют двухсуточной агаровой культурой из расчета 10 ⁷кл/мл.

В качестве контроля используют неинфицированную колбу со средой и нефтью. Колбы экспонируют при температуре 10^oC и 26^oC в течение 7 суток на качалке (80 об/мин). Параллельно ставят такую же колбу со средой и нефтепродуктами и клетками Pseudomonas putida 36 для сравнения их утилизирующей способности в одинаковых условиях. По истечении 7 суток долю утилизированного субстрата определяют весовым методом после экстракции нефтепродуктов элороформом в опытной и контрольной колбах.

Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, утилизирующая способность штамма Mycobacterium sp ИЖ 4 по многим нефтепродуктам выше, чем у Pseudomonas putida 36 при температуре 26^oC. А при низких температурах Pseudomonas putida 36 нефть и мазут вообще не утилизирует.

Пример 2. Штамм Mycodasterium sp ИЖ 4 выращивают в 100 мл колбах, содержащих 50 мл стерильной минеральной среды. Среду готовят на пресной и морской воде, используя в качестве минеральной основы двузамещенный фосфат аммония в концентрации 0,75 г/л. Стерильную нефть (уд. вес 888) и мазут вносят строго по весу с точностью до 0,05 мг. Концентрацию углеводородного субстрата варьируют от 0,5 до 1,0% Среду инфицируют двухсуточной агаровой культурой из расчета 10⁷ кл/мл. В качестве контроля используют неинфицированную колбу со средой и нефтью. Колбы экспонируют при температуре 10^oC и 25^oC в течение 7 14 суток в условиях стационара. Долю утилизированного субстрата определяют весовым методом после экстракции нефти хлороформом в опытной и контрольной колбах.

Результаты опытов по очистке поверхности воды от нефтезагрязнений представлены в таблице 2.

Пример 3. Штамм Mycobasterium sp ИЖ 4 выращивают в 500 мл цилиндрах, содержащих 400 мл стерильной минеральной среды (водопроводная вода с добавлением 0,75 г/л двузамещенного фосфата аммония). Стерильные нефтепродукты добавляют по весу. Среду инфицируют двухсуточной культурой, предварительно выращенной на минеральной среде с 1%-й нефтью. С помощью аквариумного компрессора АЭН-3 осуществляют подачу воздуха в цилиндры со скоростью 0,1 л/мин. В качестве контроля используют не инфицированные цилиндры со средой и нефтепродуктами. Цилиндры экспонируют при комнатной температуре 20 22^oC в течение двух недель. Долю утилизированного субстрата определяют весовым методом после экстракции нефтепродуктов хлороформом в опытном и контрольном цилиндрах.

Результаты представлены в таблице 3.

Данные таблицы 3 показывают, что за две недели инкубации количество нефтепродуктов, утилизируемых штаммом Mycobacterium sp ИЖ 4, достигает 67 - 80% Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является еще и то, что он растет даже на обедненной среде, при этом не снижая способность утилизировать нефтепродукты, что позволяет использовать его при биологической очистке воды и почвы от нефтепродуктов.

Формула изобретения

1 Штамм бактерий Mycobacterium species ЦКМК "Б" ЦКМ В-60 Б, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

РИСУНКИ

Рисунок 1