Штамм бактерий bacillus subtilis для получения препарата против фитопатогенных грибов

 

Использование: сельскохозяйственная микробиология, получение средств защиты растений от фитопатогенных грибов и касается нового штамма бактерий для получения указанного средства. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus subtilis выделен из зоокомпоста. Депонирован в коллекции чистых культур ВИЗР под N 10. Препарат против фитопатогенных грибов получают путем культивирования вышеуказанного штамма бактерий на жидкой среде, содержащей 3% культурного экстракта, 1,5% мелассы и воду, в течение 3-х суток при 27-29^oC с последующей лиофильной сушкой культуральной жидкости. Выход сухой биомассы - 40 г/л с титром 5-10⁹ спор/г. 3 табл.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый штамм бактерии, являющейся антагонистом по отношению к ряду фитопатогенных грибов. Штамм B.subtilis депонирован в коллекции ВИЗР под N 10. Идентификацию штамма проводили по "Кратному определителю бактерий Берги", М. Мир, 1980 г.

В последние годы количество применяемых фунгицидов резко ограничено из-за их высокой токсичности.

В настоящее время в защите растений от микозов используют микробиологические препараты на основе штаммов антагонистов: фитолавин на основе Streptomyces Lavendulae и триходермин на основе Trichoderma Lignorum/ "Список химических и биологических средств борьбы в вредителями, болезнями растений и сорняков и регулятором роста растений, разрешенных для применения в с/х на 1986-1990 г. М. 1987, с. 95-96/.

Основной недостаток этих препаратов низкая биологическая эффективность и узкий спектр заболеваний.

Наиболее близким предлагаемому является штамм Bacillus subtilis ИПМ-15, являющийся продуцентом бактофита /бацифита/ препарата для защиты от мучнистой росы огурцов, вертициллезного вилта хлопчатника, корневых гнилей и овощных и зерновых культур /Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений. М. 1989, с.253, 257-295/.

Недостатком указанного штамма является его недостаточно высокая эффективность.

Штамм Bacillus subtilis N 10 обладает высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра возбудителей микозов растений и является продуцентом биопрепарата алирин Б. Штамм выделен из зоокомпоста в Ленинградской области.

Культуральные и морфологические признаки.

Предлагаемый штамм B.subtilis 10-ВИЗР имеет следующие морфологические и культуральные признаки: палочки обладают шириной 0,7-1,0 мкм, длиной 1,7-3,0 мкм, споры шириной 0,7-0,9 мкм, длиной 1,1-1,9 мкм. Форма спор эллиптическая, преобладающее положение спор центральное, раздутия спорангия нет. Для изучения культурально-морфологических свойств штамма культуру выращивают при 28±2^oC в течение 3-5 суток на твердых питательных средах следующего состава: Картофельный агар: Очищенный картофель 200 г Вода 1 л /после 20 мин кипения отвар процеживают, объем доводят до 1 л, добавляют агар/ Агар 20 г стерилизуют при 1 атм. 20 мин.

Агаризованная кукурузно-мелассовая среда: Кукурузный экстракт 30 г Меласса 15 г Агар 20 г Вода водопроводная До 1 л
pH 7,2
стерилизуют при 1 атм. 20 мин.

Мясопептонный агар с глюкозой:
Мясопептонный бульон 1 л
Глюкоза 10 г
Агар 20 г
стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.

На всех твердых питательных средах вначале роста наблюдаются мелкие колонии неправильной формы белесоватого цвета. К 48 ч роста на картофельном агаре вырастают крупные матовые плоские колонии с неровными краями белесоватого цвета, которые в дальнейшем становятся блестящими, слегка утолщаются и приобретают бежевый цвет. На агаризованной кукурузно-мелассовой среде наблюдаются разрастающиеся колонии с неровными краями, плоские, середина колонии с мелкими складками, цвет бежевый. Через неделю края колонии становятся блестящими, цвет немного темнеет. На мясопептонном агаре с глюкозой разрастающиеся плоские белесоватые колонии с неровными краями, матовой поверхностью, середина колонии блестящая, почти прозрачная. Через неделю колонии становятся блестящими, приобретают бежевый цвет, слегка утолщаются.

Физиологические признаки: гидролизирует крахмал, не гидролизирует гиппурат, обладает нитротредуктазной активностью, не растет в анаэробных условиях, максимальная температура роста 45-50^oC, минимальная - 10-15^oC.

Как и большинство бактерий хорошо растет на искусственных питательных средах. МПБ, Сабуро, МПА, средах с различными источниками азота: пептоном, казеином, аминокислотами, белками и их гидролизатами, гидролизатами дрожжей и тд. Утилизируют глюкозу, сахарозу, арабинозу, декстрозу, ксилозу, маннит, крахмал.

Способ биосинтеза.

А. Посевная среда:
Меласса 1,5%
Кукурузный экстракт 3,0%
pH Нейтральный
Б.Ферментационная среда аналогична инокуляционной.

Культивирование проводят в глубинных условиях при 26-25^oC в течение 3 суток. Время выращивания инокулюма 24 ч. Культуральную жидкость сушат лиофильно или распылительно.

Способ хранения штамма: лиофилизация в ампулах культуры на среде Чапека. Перезакладка в ампулы через 5 лет.

Антагонистические свойства: подавляет рост фитопатогенных грибов, не подавляет рост бактерий. Для определения антагонистического спектра действия штамм выращивали в течение 72 ч на среде, содержащей 3,0% кукурузного экстракта и 1,5% мелассы. Антагонистическую активность определяли в культуральной жидкости, экстракте биомассы и фильтрате культуральной жидкости методами лунок, блоков и бумажных дисков. Зоны задержки роста определяли через 3-5 суток в зависимости от скорости роста тест-культур.

Зоны задержки роста /радиус в мм/ тест-микробов
Fusarium graminearum 25-30
F.oxysporum 20-30
F.culmorum 25-30
F.sporotrichiella 25-30
F.sambucium 20- 25
Alternaria brassicicolae 10-15
Colletotrichum atrawenta 10
Verticillium dahliae 8-10
Sclerotinia sclerotiorum 5-7
Bipolaris sorokiniana 5 -7
Ascochyta melonis 10-12
Пример 1. Штамм Bacillus subtilis 10-ВИЗР выращивали на среде следующего состава: кукурузный экстракт 3% меласса 1,5% остальное водопроводная вода, pH до стерилизации 7,0. Длительность культивирования 3 суток на качалке при 28± 1^oC. Культуральную жидкость сушили лиофильно. Получили выход сухой биомассы 40 г/л с титром 5·10⁹ спор/г. Полученный биопрепарат /алирин Б/ на основе предлагаемого штамма испытывали в защите от фузариозной корневой гнили огурца и вертициллезного увядания. Порошок вносили в лунки при высадке рассады в пленочной производственной теплице совхоза "Детскосельский" в количестве 0,3 г/л /0,1 г на растение/. Прототип-биопрепарат бактофит на основе штамма Bacsllus subilis вносили также в рекомендованном количестве /0,2 г на растение/. Кроме того, в качестве эталона был использован биопрепарат триходермин на основе Trichoderma lignorum, широко применяемый в защите овощей от корневых гнилей. Норма внесения 1 г под растение. В течение вегетационного периода наблюдали за развитием растений, урожаем, а также за развитием заболеваний. Учет опыта проводили в конце вегетации. Учет распространенности и развития корневой гнили огурца оценивали в период ликвидации растений по 5 балльной шкале:
0 здоровый корень,
1 отдельно углубленные коричневые пятна или слабое побурение центрального корня,
2 мацерация пораженной ткани,
3 центральный корень, корневая шейка, корешки бурые, мацерацией охвачено до 1/2 корня,
4 корень бурый, боковых корешков нет, размочалено более 1/2 корня, растение отмирает.

Развитие болезни /в/ рассчитывали по формуле
,
где
R развитие болезни,
(a^ob) сумма произведений числа больных растений /а/ на соответствующий балл (b) поражения;
n общее число учтенных растений, шт.

с высший балл шкалы.

Распространенность болезни /в/ подсчитывали по формуле

где
P распространенность,
n число больных растений, шт.

N общее число учтенных растений, шт.

Данные представлены в табл. 1 и свидетельствуют, что внесение в почву биопрепарата на основе предлагаемого штамма снижает развитие вертициллезного увядания в 2,5 раза, распространенность и развитие фузариозной корневой гнили в 3-3,5 раза по сравнению с контролем. В то время внесение бактофита на основе штамма- прототипа, а также триходермина, было значительно менее эффективным, несмотря на значительно более высокие нормы внесения /0,6 и 3,0 г/м по сравнению с 0,3 г/м/. Увядание снизилось на 30-40% а корневая гниль на 40-50%
Пример 2. Биопрепарат на основе B.subtilis вносили в почву при высадке рассады астр в количестве 1 г/м. Бактофит /прототип/ и триходермин вносили в том же количестве. Учет увядания, вызванного грибами из родов Fusarium Verticillium и Botrytis проводили в течение июля и августа. Данные представлены в табл. 2.

Пример 3. Биопрепарат на основе штамма B.subtilis нарабатывали согласно примеру 1. Выращенную биомассу сушили распылительно, получили выход сухой биомассы 35,9 г/л с титром1,2·10¹⁰ сп/г.

Оценку эффективности штамма в отношении фузариоза колоса проводили на делянках яровой пшеницы, искусственно зараженных F.graminearum. Заражение проводили суспензией конидий гриба /10⁶ конидий/мл/ путем опрыскивания колосьев/ 0,2 мл/колос/ в стадии формирования зерновки /водяная спелость/. Обработку биопрепаратами на основе предлагаемого штамма /алирин Б/ и штамма прототипа /бактофит/ проводили опрыскиванием 0,1%-ной суспензией за 24 ч заражения. В качестве химического эталона был применен фоликур. Данные представлены в табл. 3.

Как видно из таблицы, применение биопрепарата на основе предлагаемого штамма более эффективно по сравнению с прототипом и позволяет снизить развитие заболевания по основным показателям в 2 раза.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют, что предлагаемый штамм B. subtilis обладает высокой антагонистической активностью в отношении комплекса фитопатогенных грибов и может быть продуцентом биопрепарата для защиты с/х культур от микозов.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus Subtilis ВИЗР N 10 для получения препарата против фитопатогенных грибов.

РИСУНКИ

Рисунок 1