Способ получения плазмид из стрептомицетов

 

Использование: генетическая инженерия микроорганизмов, техническая микробиология. Сущность: получение новых плазмид psCH2 и psCH3 из streptomyces chrysomallus ВКМ Ас-1355 и его белого варианта. Плазмиды отличаются делецией в 1,7 килобаз, расположенной между сайтами рестрикции для эндонуклеаз KpnI и Eco 147 1. 2 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, и может быть использовано в генно-инженерных, молекулярно-биологических и микробиологических исследованиях.

Известны способы выделения плазмид из различных видов стрептомицетов /EP, заявка 0006692 C 12 N 15/00, 1980; EP заявка 0038156, C 12 N 15/00, 1981/. Задача изобретения заключается в том, чтобы выделить новые плазмиды стрептомицетов с новыми свойствами, определить их размер, обнаружить уникальные сайты рестрикции и построить рестрикционную карту.

В качестве ближайшего аналога изобретение рассматривает способ получения плазмид из Streptomyces coelicolor, S. lividans и S. Parvulus/ EP, заявка 0006692, C 12 N 15/00, 1980/. Изобретение отличается от ближайшего аналога тем, что для выделения плазмид используют штамм Streptomyces chpysomallus ВКМ Ас-1355 и его белый вариант.

Сущность изобретения заключается в том, что культуры штаммов выращиваются в питательной среде, затем лизируют клетки мицелия с помощью додецилсульфата натрия (SDS) и путем центрифугирования выделяют новые плазмиды pSCH2 и pSCH3 соответственно.

На фиг. 1 приведена рестрикционная карта плазмиды pSCH2, а на фиг. 2 - рестрикционная карта плазмиды pSCH3.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример.

Культуры штамма Streptomyces chrysomallus BKM АС-1355 и его белого варианта засевают по отдельности в 100 мл стерильной среды YEME /1/ следующего состава: дрожжевой экстракт 3 г/л бакто-пептон 5 солодовый экстракт 3 глюкоза 10 содержащую также 34% сахарозы, 0,005 M MgCl₂ и 0,5% глицина. Культивируют на качалке при интенсивном перемешивании 48 ч при 28^oC.

Мицелий осаждают центрифугированием при 2.000 об/мин/ затем промывают 0,3 M сахарозой. Мицелий непосредственно используют для выделения плазмид или хранят при -20^oC. В основу процедуры выделения плазмид положен метод щелочного лизиса /2/. Выделение плазмид осуществляют следующим образом.

1. Мицелий суспендируют в среде выделения при pH 7,4/10 мл среды на 1 г сырого мицелия/ следующего состава: 0,3 М сахароза, 25 мМ трис -HCl, 25 мМ ЭДТА, лизоцим (1 мг/мл среды) 2. Инкубируют 5-15 мин при 37^oC.

3. Добавляют два объема щелочного раствора SDS/1% SDS, 0,2 М NaOH/ и выдерживают 10 мин при 0^oC.

4. Добавляют уксуснокислый натрий в количестве 1,5 первоначального объема /3М, pH, 4.8/, выдерживают 1 ч при 0^oC, центрифугируют при 18000 об/мин в течение 20 мин.

5. К супернатанту добавляют изопропанол в количестве 0,6 первоначального объема, выдерживают 15 мин при комнатной температуре, центрифугируют при 2500 об0/мин, в течение 20 мин, осадок высушивают и растворяют в 10 мл ТЕ-буфера /10 мМ тис-HCl, pH 7,4; 1мМ ЭДТА, pH 8,0/.

6. К раствору ДНК добавляют равный объем 4 М LiCl, выдерживают 1 ч при 0^oC и центрифугируют в течение 20 мин при 2000 об/мин.

7. К супернатанту добавляют 2 объема этанола, выдерживают 1 ч при 0^oC, центрифугируют в течение 20 мин при 2500 об/мин, осадок высушивают и растворяют в 0,5 мл ТЕ-буфера.

8. К раствору ДНК добавляют раствор РНКазы /предварительно прогретый/ до конечной концентрации 100 мкг/мл, инкубируют в течение 10 мин при 37^oC.

9. Добавляют 0,1 объема ацетата натрия и экстрагируют раствор ДНК одним объемом хлороформа /хлороформ: изоамиловый спирт, 24:1/.

10. К раствору ДНК добавляют 2 объема этанола, выдерживают 1 ч при 0^oC, центрифугируют в течение 20 мин при 2500 об/мин, осадок промывают 70-ным этанолом, высушивают и растворяют в 0,1 мл бидистиллята.

Таким образом из лизата культур Streptomyces chrysomallus BKM Ас-1355 и его белого варианта выделяют две плазмиды pSCH2 и pSCH3, имеющие соответственно размеры 13,4 и 15,1 килобаз.

Плазмиды характеризуются следующими признаками: 1. Имеют три уникальных сайта рестрикции для эндонуклеаз Pvu 11, Kpn 1, Eco 147 1 (Stu 1).

2. Имеют по три сайта рестрикции для эндонуклеазы Bam H1.

3. Отличаются делецией в 1,7 килобаз, расположенной между сайтами рестрикации для эндонуклеаз Kpn1 и Eco 147 1.

Источники информации: 1. Hopvood D.A. Bibb M.J. Chater K.F. et al. 1985. Genetic manipulations of Streptomyces. A laboratory manual.

2. Birnboim H.C. Doly 1979. A rapid al Kaline extraction procedure for screening recombination plasmid DNA. Nucleic Acid. Rec. v. 7, p. 1513.4

Формула изобретения

Способ получения плазмид из стрептомицетов, предусматривающий их культивирование, лизис мицелия и осаждение плазмидных ДНК, отличающийся тем, что из стрептомицетов используют штамм Streptomyces chrysomallus ВКМ Ас-1355 и его белый вариант и выделяют соответственно плазмиду pSCH₂ с мол.м. 13,4 килобаз с картой рестрикции, приведенной на фиг. 1, и плазмиду pSCH₃ мол.м. 15,1 килобаз с картой рестрикции, приведенной на фиг. 2.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2