Способ получения сорбента

 

Использование: в области хроматографии гликопротеинов. Сущность: агарозный гель обрабатывают диглицидиловым эфиром этиленгликоля, м-аминофенилборной кислотой и раствором нитрита натрия. Способ позволяет получить сорбент с высокой емкостью и стабильными свойствами.

Изобретение относится к области получения сорбентов, в частности сорбентов для отделения и определения гликопротеинов. Сорбенты могут быть использованы, например, для хроматографического определения гликозилированного гемоглобина в крови.

Известен сорбент, представляющий собой привитую аминофенилборную кислоту на кремнеземном носителе, используемый для определения гликозилированного гемоглобина, и способ его получения, включающий модификацию кремнезема γ -глицидооксипропилтриэтоксисиланом и прививку активных групп аминофенилборной кислоты в количестве 80 - 100 мкмоль на 1 грамм сорбента /RU, патент N 2040963, B 01 J 20/10, 1995/.

Известен способ получения сорбента на основе агарозных производных аминофенилборной кислоты общей формулы (US, патент N 4572251, 1985).

Вышеуказанный способ является трудоемким из-за его многостадийности, при этом активность полученных производных оценивается от 5 до 20 экв/мл.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения сорбента для гликопротеинов, включающий обработку агарозного носителя диглицидиловым эфиром двухатомных спиртов жирного ряда, промывку, обработку раствором, содержащим м-аминофенилборную кислоту и промывку /US, патент N 4269605, 1981/.

Конкретный способ, приведенный в указанном патенте, предусматривает обработку Сефарозы 6В диглицидиловым эфиром 1,4 бутандиола, промывку, обработку раствором м-аминофенилборной кислоты в щелочной среде /pH 11-12/ и промывку дистиллированной водой. При этом количество привитой м-аминофенилборной кислоты составило 20 мг на 1 мл сорбента /100 мкмоль/мл/.

Однако при проверке полученного известным способом сорбента для выделения глинозилированного гемоглобина его емкость составила 54 мг HbA₁ на 1 мл сорбента /0,65 мкмоль/мл/, что свидетельствует о неполном использовании емкости сорбента.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения сорбента на основе агарозного геля с привитой м-аминофенилборной кислотой, обладающего повышенной емкостью и стабильностью при хранении.

Поставленная задача решается описываемым способом получения сорбента, используемого для выделения гликопротеинов, включающим обработку агарозного носителя диглицидиловым эфиром этиленгликоля, промывку, обработку раствором, содержащим м-аминофенилборную кислоту, промывку привитого сорбента и обработку раствором нитрита натрия в хлористо-водородной кислоте.

Полученный сорбент можно представить следующей структурной формулой: Предложенное изобретение предполагает использование диглицидилового эфира этиленгликоля, как наиболее эффективного спейсера, сшивающего носитель с модификатором /аминофенилборной кислотой/ через цепочку из 8 атомов углерода. При этом дополнительная обработка сорбента нитритом натрия экранирует NH-группу при бензольном кольце, что не позволяет гидроксогруппе аминофенилборной кислоты соседней цепочки вступать во взаимодействие с NH-группой бензольного кольца. По нашему мнению, подобное взаимодействие приводит к снижению емкости сорбента-прототипа.

Пример конкретного осуществления способа.

Сефарозу 6B /агарозный гель/ промывают дистиллированной водой и фильтруют под вакуумом. Промытый гель суспендируют в щелочном растворе диглицидилового эфира этиленгликоля при комнатной температуре. Затем гель отфильтровывают и промывают дистиллированной водой при 5 - 10^oC. Промытый продукт подвергают обработке раствором м-аминофенилборной кислоты при pH 11-12 в течение 24 часов при 35 - 40^oC. В результате получают сорбент с привитой м-аминофенилборной кислотой.

Далее 5 мл полученного сорбента суспендируют в 15 мл дистиллированной воды. К суспензии приливают 0,5 мл раствора нитрита натрия с концентрацией 69 мг/мл и 10 мл 0,1N HCl. Смесь выдерживают в течение 30-40 минут, отфильтровывают, промывают твердую фазу 10-кратным объемом дистиллированной воды.

Полученный сорбент помещают в раствор консерванта /NaN₃/ и хранят в темном месте при 4 - 8^oC.

Емкость полученного по вышеизложенному примеру образца была определена при выделении гликозилированного гемоглобина и составила 79 мг HbA₁ на 1 мл сорбента, в то время как емкость контрольного образца /по прототипу/ составила 54 мг HbA₁ на 1 мл сорбента.

Кроме того, образцы, полученные по способу-прототипу, т.е. без дополнительной обработки нитритом натрия, с течением времени темнели и теряли емкость. Сорбенты, полученные в соответствии с заявленным изобретением, стабильны и сохраняют свои свойства при длительном хранении.

Формула изобретения

Способ получения сорбента, используемого для выделения гликопротеинов, включающий обработку агарозного носителя диглицидиловым эфиром двухатомных спиртов жирного ряда, промывку, обработку раствором, содержащим м-аминофенилборную кислоту, промывку сорбента с привитой м-аминофенилборной кислотой, отличающийся тем, что носитель обрабатывают диглицидиловым эфиром этиленгликоля, а после промывки сорбента с привитой м-аминофенилборной кислотой его дополнительно обрабатывают раствором нитрата натрия в хлористоводородной кислоте.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 16.12.2003

Извещение опубликовано: 20.11.2004        БИ: 32/2004