Консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: alcaligenes denitrificans, alcaligenes eutrophus, pseudomonas maltophila, используемый для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке нефтяных загрязнений. В состав консорциума входят штаммы Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2070D, Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2071D, Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2072D, Alcaligenes eutrophus ВКМ В-2074D и Pseudomonas maltophila ВКМ В-2073D. Консорциум выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами. Окислительная активность консорциума по конечному продукту окисления составляет 2086 мг СО₂ за 30 суток. Преимущество консорциума заключается в способности расти на обедненной питательной среде, а также с высокой скоростью окислять нефть и нефтепродукты.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке нефтяного загрязнения почв, почвогрунтов и вод на территориях нефтебаз, нефтепромыслов, промышленных предприятий и других объектах.

Известен консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes denitrificans, Bacillus species, Pseudomonas putida, Aeromonas species, предназначенный для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности и выделенный из почв, загрязненных нефтепродуктами, прибрежной зоны юга Дальнего Востока. Окислительная способность консорциума составляет 1981 мг CO₂ за 30 суток (патент РФ N 2115629, кл. С 02 F 3/34, публ. 1998).

Недостатком консорциума является низкая окислительная способность.

Известен консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Aeromonas species, Alcaligenes denitrificans, Arthrobacter species, предназначенный для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности и выделенный из почв, загрязненных нефтепродуктами, прибрежной зоны юга Дальнего Востока. Окислительная способность консорциума составляет 2041 мг СО₂ за 30 суток (патент РФ N 2127310, кл. С 12 N 1/20, публ. 1999).

Недостатком консорциума является низкая окислительная способность.

Задача изобретения - получение консорциума штаммов микроорганизмов-деструкторов для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефтяного загрязнения и остаточной замазученности.

Для решения поставленной задачи выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, прибрежной экосистемы юга Дальнего Востока (морской торговый порт г. Находки) консорциум микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-5 (КММ НФ - коллекция морских нефтеокисляющих микроорганизмов), Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-6, Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-16, Alcaligenes eutrophus КММ НФ 7-13, Pseudomonas maltophila КММ НФ 7-1.

Это природные ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов, которые сформировались в почве в результате длительного воздействия нефтепродуктов на почвенную биоту.

Выделенные штаммы микроорганизмов депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, где им присвоены номера ВКМ В-2070 D, ВКМ В-2071 D, ВКМ В-2072 D, ВКМ В-2074 D, ВКМ В-2073 D соответственно.

Штаммы микроорганизмов берут в следующих количествах: Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-5 - 22 %, Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-6 - 23 %, Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-16 - 23%, Alcaligenes eutrophus КММ НФ 7-13 - 23%, Pseudomonas maltophila КММ НФ 7-1 - 9%.

Характеристика штамма Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-5.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные палочки размером 0,8 х 1,2 мкм, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, выпуклые, гладкие, блестящие, слизистые колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы.

Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, твин-80, желатин не гидролизуют. Сорбозу, раффинозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4-30^oC, pH 7,0-7,5, непатогенен.

Характеристика штамма Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-16.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные палочки размером 0,8 х 1,5 мкм, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, гладкие не пигментированные колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, твин-80, желатин не гидролизуют. Сорбозу, раффинозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют, способны окислять углеводороды нефти, температура роста 4-30^oC, pH 7,0-7,5, непатогенен.

Характеристика штамма Alcaligenes eutrophus КММНФ 7-13.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные палочки размером 1,0 х 1,8 мкм, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, гладкие блестящие, полупрозрачные, слизистые колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, агар-агар, желатин не гидролизуют. Твин-80 гидролизуют. Арабинозу, рибозу, сорбозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4-30^oС, pH 7,0-7,5, непатогенен.

Характеристика штамма Pseudomonas maltophila КММ НФ 7-1.

Морфолого-культуральные признаки. Палочки размером 0,5 х 1,2 мкм, монотрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют слизистые, выпуклые, прозрачные колонии, сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Крахмал, твин-80, желатин гидролизуют. В специальных факторах роста не нуждаются. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4-37^oC, pH 7,0-7,2, непатогенен.

Предлагаемый консорциум микроорганизмов хорошо растет на жидкой среде Ворошиловой - Диановой следующего состава, г/л: NH₄NO₃ - 1,0, K₂HPO₄ - 1,0, MgSO₄ - 0,2, CaCl₂ - 0,02, FeCl - 2 капли концентрированного раствора, вода дистиллированная - 1000 мл. В качестве единственного источника углерода добавляют 10 мл нефтепродукта. Оптимальная температура роста 25-30^oC, pH 7,0-7,2.

Интенсивный рост консорциума наблюдается при использовании среды следующего состава, г/л: K₂HPO₄ - 10,0, KH₂PO₄ - 1,0, NH₄NO₃ - 2,0, вода дистиллированная - 1000 мл, нефтепродукт - 10 мл.

Активному нарастанию биомассы консорциума способствует среда, состоящая из 0,3% водного раствора нитроаммофоски, где азот, фосфор и калий сбалансированы по 17%.

Заявленный консорциум был выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, путем высева почвенного образца на агаризованную и жидкую питательные среды. Чтобы повысить активность выделенных нефтеокисляющих микроорганизмов к повышенным концентрациям нефтепродуктов, проводят их адаптацию путем частых пересевов на свежую питательную среду. Это позволяет выделить наиболее устойчивые, физиологически активные особи нефтеокисляющих микроорганизмов и получить активный консорциум штаммов микроорганизмов. Математически устанавливают, что в данном консорциуме микроорганизмы рода Alcaligenes составляют подавляющее большинство - 91 %.

Из них Alcaligenes denitrificans относится к типично доминирующим видам - 69%, a Alcaligenes eutrophus к типично часто встречаемым - 23%. Pseudomonas maltophila относится к случайным видам - 8%.

Окислительную активность консорциума определяют по конечному продукту окисления, т.е. по выделению СО₂.

В колбы емкостью 500 мл, соединенные последовательно герметично, вносят поглотитель углекислоты BaOH. В колбу с инокулянтом вносят 250 мл среды Ворошиловой - Диановой, 2,5 мл нефтепродукта и 5 мл трехсуточной культуры консорциума с содержанием 1,0 х 10⁵ кл/мл. С помощью дозатора со скоростью 34 мл/мин подают атмосферный воздух. Для того чтобы в колбу с инокулянтом не поступал СО₂, воздух пропускают через 2 колбы с поглотителем СО₂ и аэрация инокулянта проходит без углекислоты. После окисления нефтепродуктов аэрируемый воздух дополнительно проходит через две колбы с поглотителем СО₂, затем BaOH оттитровывают HCl и определяют окислительную способность по количеству выделенного углекислого газа.

Для установления чистоты опыта одновременно ставят при таких же условиях еще 2 контроля. Один - с реактивами без консорциума и нефтепродуктов, другой - с реактивами, нефтепродуктами, но без консорциума. В контроле содержание СО₂ не обнаружено. Длительность опыта 30 суток. Окислительная способность консорциума составляет 2086 мг СО₂.

Таким образом, предлагаемый консорциум штаммов микроорганизмов обладает высокой скоростью окисления нефтепродуктов.

Применение консорциума. Для очистки нефтяного пятна на почве размером 20 х 4,0 м, глубиной загрязнения 0,1 - 0,2 м с содержанием нефтепродуктов 22% берут 0,7 кг минерального удобрения нитроаммофоски, в котором азот, фосфор и калий сбалансированы по 17%, растворяют в 200 л воды и поливают участок из расчета 1 л на 1 м² за 2 дня до вспашки. После вспашки через 2 дня вновь вносят раствор на участок из расчета 1 л/м². Это необходимо для активизации как сапрофитной, так и аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. Через неделю после внесения минеральных удобрений вносят инокулянт консорциума (водный раствор). Титр 1,0 х 10¹² клеток в 1 мл. Норма полива 1 л/м². Через месяц содержание нефтепродукта в почве составляет 10%, через 2 месяца - 4%, через 3 месяца нефтепродуктов в почве не обнаружено.

Преимуществом предлагаемого консорциума штаммов микроорганизмов является способность расти на обедненной питательной среде, а также высокая скорость окисления нефти и нефтепродуктов, что позволяет эффективно использовать его при биологической очистке почв, почвогрунтов и вод, загрязненных нефтепродуктами и остаточной замазученностью.

Формула изобретения

Консорциум штаммов микроорганизмов - деструкторов Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2070D, Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2071D, Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2072D, Alcaligenes eutrophus ВКМ В-2074D и Pseudomonas maltophila ВКМ В-2073D, используемый для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности.