Природный криопротектор

 

Изобретение относится к химии природных соединений, используемых для криоконсервации биологических объектов. Установлен многокомпонентный состав природного антифриза, вырабатываемого Aporia crataegi L. , в период зимней диапаузы. Криопротекторное соединение состоит из трех важнейших компонентов: глицерина, α-каротина и соединения пептидной природы, которые находятся в определенных соотношениях по отношению друг к другу: глицерин : α-каротин : пептид = 19 : 1 : 16,5. Данный криопротектор обладает хорошим криопротекторным потенциалом в процессе криоконсервации различных биологических объектов при -15-20^oС без использования жидкого азота и более эффективен по сравнению с чистым глицерином при многократном размораживании - оттаивании. 2 табл.

Изобретение относится к области химии природных соединений, предназначенных для криопротекции различных биологических объектов.

Известны природные криопротекторные соединения полиольной природы, вырабатываемые различными холодоустойчивыми организмами. Многие из известных криопротекторов содержат в качестве основного компонента глицерин (1 - 4). Данные вещества способствуют понижению точки переохлаждения организма, препятствуют процессу кристаллизации и деструкции клеток в период зимней диапаузы.

Оценка эффективности таких криопротекторов на различных биологических системах, а также практическое их использование до сих пор является сложной методической задачей, и она практически не решена.

Прототипом предлагаемого изобретения является криопротектор, вырабатываемый Ceratophyllus idius (1). Основным его криопротекторным компонентом является глицерол. В качестве, по-видимому, сопутствующих компонентов криопротектора обнаружены сорбитол и карбогидраты, выполняющих, как известно, обезвоживающую функцию. Криозащитный эффект данного природного антифриза был изучен in vivo. В частности, показано, что глицериновый компонент способствует понижению точки переохлаждения Ceratophyllus idius до - 30^oC.

Недостаток прототипа.

К сожалению, неизвестно какое количество криопротектора содержится в организме одной особи Ceratophyllus idius. Нет сведений и о его криозащитной эффективности по отношению к различным биологическим системам. Однако хорошо известны криопротекторные свойства химического глицерина (5, 6). Глицерин в концентрации 5-30% в той или иной степени позволяет сохранять жизнеспособность многим клеткам, тканям, культурам при 2-х и 3-х кратном замораживании при условии низкотемпературного замораживания (-196^oC). Очевидно, что глицерин биогенной природы имеет аналогичный криопротекторный эффект по отношению к биологическим системам. Известно, что концентрации 15-20% глицерина являются, как правило, токсичными, они влияют на осмотическое давление клеток. Более низкие концентрации глицерина не дают эффективной криозащиты. Использование глицерина в концентрации 15-20% предусматривает громоздкую процедуру отмывания замораживаемых объектов. Проявление высокоэффективного криозащитного эффекта при супернизких температурах ограничивает область применения.

Технической задачей изобретения является получение природного криопротектора, обладающего способностью криозащиты биологических объектов при температурах (-15)-(-20)^oC с целью использования этого вещества для криоконсервации различных клеточных культур в условиях экспедиционных работ, когда использование супернизких температур является недоступным.

В качестве источника природного криопротектора были выбраны диапазирующие гусеницы боярышницы (Aporia crataegi L), зимующие открыто в листовых гнездах, подвешенных на кустарниках на территории Якутии, где температура воздуха в наиболее холодный зимний период (декабрь-январь месяцы) достигает (-50)-(-55)^oC. Из диапазирующих гусениц боярышницы методом спиртовой экстракции получена многокомпонентная смесь, обладающая криопротекторными свойствами. В качестве экстрагирующего раствора использовали этиловый спирт в соотношении 1: 12 по отношению к весу гусениц.

Метод тонкослойной хроматографии (в качестве сорбента использовали силикагель) в системе ацетон - вода = 40: 1 позволил выявить три основных компонента: 1) глицерин (идентифицирован методом ИК-спектроскопии, полосы поглощения наблюдались в области 3100 - 3500, 2880 - 2920, 1050, 1075 - 1100, 1125 - 1030, 850, 925, 990, 1630 и 1670 см^-1); 2) α-каротин (обнаружен методом VIS -спектрофотометрии, максимумы поглощения находятся в области 446 и 473 нм); 3) соединение пептидной природы, состоящее из пролина, аспарагиновой кислоты, серина, треонина, глутаминовой кислоты (идентифицированы нингидриновым методом на аминокислотном анализаторе) с преимущественным содержанием пролина и глутаминовой кислоты.

Соотношение отдельных компонентов в пептиде следующее: Pro - Glu - Thr - Ser - Asp 1: 0,56: 0,04: 0,06 Аспарагиновая кислота содержится в незначительном количестве.

Все три компонента образуют довольно гомогенную смесь темно-коричневого цвета, вязкую по консистенции, n_d близок к n_d глицерина и составляет 1,472.

Сущность изобретения заключается в том, что из зимующих гусениц боярышницы (Aporia crataegi L. ) методом химической экстракции получен природный глицеринсодержащий антифриз многокомпонентного состава (табл. 1).

Для определения криопротекторной эффективности полученного природного антифриза были проведены эксперименты по замораживанию лимфоцитов крови человека. Лимфоциты получали из периферической крови здоровых людей по известной методике (7). Принцип выявления лимфоцитов основывается на их неспособности окрашиваться раствором трипаном голубым в отличие от неживых лимфоцитов, у которых вследствие нарушения проницаемости плазматической мембраны краситель легко проникает во внутрь.

Этот принцип был использован для подсчета оставшихся в живых лимфоцитов после каждого этапа замораживания. Жизнеспособность лимфоцитов, замороженных в присутствии биологического криопротектора, оценивали в сравнении с жизнеспособностью лимфоцитов, замороженных в присутствии химического глицерина. Условия замораживания во всех случаях были одинаковыми (t замораживания: -20^oC), табл. 2.

Представленные результаты показывают, что однократное замораживание лимфоцитов в отсутствии каких-либо криопротекторов приводит к почти тотальной потере жизнеспособности этих клеток. При увеличении концентрации как химического глицерина, так и биологического криопротектора количество выживших клеток повышается и в этом отношении наиболее эффективны 16% концентрации криопротекторов. При повторном замораживании наблюдается заметное падение потенциала жизнеспособности лимфоцитов, что наблюдается в исчезновении защитного эффекта криопротектора в 1% концентрации. Количество выживших лимфоцитов, защищенных 5% и 16% концентрациями криопротекторов падает. При трехкратном замораживании картина выглядит еще более драматично. На лицо резкое падение выживаемости клеток при всех используемых концентрациях криопротекторов. Однако на этом этапе замораживания и последующего оттаивания более заметным становится защитный эффект биологического криопротектора, особенно при использовании его в 16% концентрации (более чем в 3 раза).

Тот факт, что биологический криопротектор является многокомпонентным и глицерин составляет только около половины его состава, свидетельствует о том, что защитный эффект обусловлен также и другими его компонентами.

Существенный вклад в повышение его эффективности вносит α-каротин, способный смягчать разрушительное воздействие свободнорадикальных процессов, имеющих место при оттаивании клеток, а также пептидный компонент, большую часть которого составляет пролин, аминокислота, обуславливающая устойчивость к низким температурам (8).

Наши исследования показали, что фракция α-каротина и пептидная фракция находятся в тесном взаимодействии с глицерином и удаление хотя бы одного компонента из этой смеси приводит к полному изменению консистенции исследуемого вещества и резкому понижению его криопротекторной способности.

На основе данных по качественному составу и количественному соотношению компонентов природного криопротектора его можно получать искусственным путем.

Преимущество предлагаемого криопротектора по сравнению с прототипом (химическим глицерином) заключается в следующем: 1) является многокомпонентным по составу, что обеспечивает более комплексную защиту биологических объектов от деструктивного влияния низких температур; 2) имеет более высокий криопротекторный потенциал по сравнению с химическим глицерином, хотя концентрация глицеринового компонента криопротектора примерно в 2 раза меньше, чем концентрация химического глицерина. Это позволяет использовать биологический криопротектор в концентрации 16%, не опасаясь увеличения осмотического давления в клетках и не используя громоздкой процедуры отмывания клеток от криопротектора после окончания процедуры замораживания; 3) данный криопротектор позволяет проводить криоконсервацию клеток в экспедиционных условиях без использования супернизких температур (-196^oC) и жидкого азота.

Источники информации
1. Douglas P. , Schelhaas and Omer R. Larson. Cold hardiness and winter survival in the bird flea, Ceratophyllus idius, J. Insect Physiology, vol. 35, N 2, pp. 149 - 153, - прототип
2. Baust J. G. , Rojas R. R. Review - insect cold harduness: facts and fancy. J. Insect Physiology, vol. 31, N 10, pp. 755- 759.

3. Khlebovich V. V. On various types of antifreezes in active and resting stages oforganisms, Hydrobiologia, 320, N 1-3, pp. 81-82, 1996.

4. Каранова М. В. , Байкова Э. Э. , Долгачева Л. П. Молекулярная природа антифризной активности гемолимфы гаммариуса Gammarius lacustris, Ж. Биофизика живой клетки, N 6, с. 74-76, 1995.

5. Пушкарь Н. С. и др. Криопротекторы, Киев, 1978.

6. Белоус А. М. , Гордиенко Е. А. , Розанов Л. Ф. Замораживание и криопротекция М. , 1987.

7. Натвиг Дж. Б. , Перлманн П. , Вигзель X. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика, М. 1950 г.

8. Бритиков Е. А. Биологическая роль пролина, изд. Наука, М. , 1975.

Формула изобретения

Природный криопротектор многокомпонентного состава, отличающийся тем, что в качестве многокомпонентного состава содержит спиртовой экстракт зимующих гусениц боярышницы (Aporia crataegi L).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2