Способ количественной оценки прямого мембранотропного действия глюкокортикоидов на плазматическую мембрану клетки

 

Изобретение относится к медицине, а именно к биофизике клеточных мембран человека, и может быть использовано для исследования клеточных мембран при различных патологических процессах, в частности при заболеваниях, требующих использования глюкокортикоидов и сопровождающихся стреоидорезистентностью. Способ представляет собой флуоресцентное зондирование мембраны эритроцита, в котором прямое мембранотропное действие глюкокортикоида оценивают по коэффициенту, соответствующему изменению микровязкости липидного бислоя мембраны после инкубации с гормоном. Способ обеспечивает простоту и доступность оборудования, высокую информативность, расширение диагностических возможностей исследования.

Изобретение относится к медицине, а именно к биофизике клеточных мембран человека, и может быть использовано для исследования клеточных мембран при различных патологических процессах, в частности при заболеваниях, требующих использования глюкокортикоидов и сопровождающихся стреоидорезистентностью.

Известны способы изучения реактивности различных клеточных мембран после взаимодействия со стероидньми гормонами, в том числе применение флуоресцентных зондов для изучения взаимодействия стероидных гормонов с мембранами [1], оценка влияния глюкокортикоидных гормонов на структуру мембран с помощью метода спиновых меток [3].

Однако в первом случае исследователями использованы флуоресцентные зонды, не позволяющие оценить влияние стероидов на липидный бислой, а во втором методика отличается значительной трудоемкостью и дороговизной.

Наиболее близкой к предлагаемому способу может рассматриваться методика, заключающаяся в измерении флуоресценции анилиннафталинсульфоната в микросомах до и после добавления стероидных гормонов, что позволяет количественно оценить влияние гормонов на область белок-липидного взаимодействия в мембранах эндоплазматического ретикулума [2].

Недостатками указанного способа являются ограниченные диагностические возможности количественной регистрации способности глюкокортикоидов связываться с липидами плазматической мембраны клетки и оценки прямого (не опосредованного цитозольными рецепторами) воздействия гормонов на микровязкость липидного бислоя.

Целью изобретения является расширение диагностических возможностей и повышение информативности оценки мембранотропного действия синтетического глюкокортикоида - преднизолона при исследовании прямого воздействия глюкокортикоида, не связанного с цитозольными рецепторами.

Цель решается за счет того, что в способе, заключающемся во флуоресцентном зондировании клеточных мембран, прямое мембранотропное действие глюкокортикоидов на плазматическую мембрану клетки оценивают по коэффициенту, представляющему собой отношение микровязкости липидного бислоя мембраны эритроцита, определенной по степени эксимеризации пирена, в двух инкубированных пробах - с добавлением и без добавления в суспензию мембран глюкокортикоида.

Использование мембраны эритроцита для изучения мембранотропного действия глюкокортиокидов обусловлено отсутствием в этих клетках внутриклеточных мембранных образований и органелл, что позволяет оценить действие гормона непосредственно на плазматическую мембрану. Отсутствие в эритроците ядра и цитозольных рецепторов к глюкокортиокидам позволяет выявить прямое, рецепторнеопосредованное действие стероида. В качестве флуоресцирующего зонда использован пирен, так как этот липидотропный зонд, встраиваясь в глубокие слоя бислоя, позволяет однозначно оценить микровязкость мембраны. Преднизолон, обладая достаточной липофильностью, является наиболее широко используемым в клинике глюкокортикоидом с хорошо известной фармакодинамикой, фармакокинетикой, лечебными и побочными эффектами.

Способ осуществляют следующим образом: 400 мкл цельной крови гемолизируют в 4 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин, после чего гемолизат сливают, а осадок вновь отмывают в 4 мл дистиллированной воды (посредством ресуспензирования и центрифугирования при 8000 об/мин - 15 мин). Для придания суспензии мембран однородности осадок ресуспензируют в 4 мл 0.9%-ного раствора NaCl и центрифугируют при 1500 об/мин - 5 мин, после чего отбирают 2 мл надосадочной жидкости.

Выделенную суспензию мембран помещают в 2 пробирки - по 300 мкл в каждую. Затем в 1 пробирку добавляют 5 мкл 3%-ного раствора преднизолона натрий фосфата. Обе пробирки инкубируют при 18-20^oС 15 мин. После инкубации в каждую пробирку добавляется по 30 мкл раствора пирена (концентрация пирена 100 мкмоль/л).

Каждую пробу спектрофлуориометрируют при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны поглощения 400-500 нм, после чего подсчитывают коэффициент мембранотропного действия преднизолона (Km) по формуле: Km=(Pir2p/Pir1p)/(Pir2/Pir1), где Pir1 - флуоресценция мономеров пирена в пробе без преднизолона, Pir2 - флуоресценция эксимеров пирена в пробе без преднизолона, Pir1p - флуоресценция мономеров пирена в пробе с преднизолоном, Pir2p - флуоресценция эксимеров пирена в пробе с преднизолоном. Результат выражают в относительных единицах (ОЕ).

Высокие значения коэффициента Km будут свидетельствовать о выраженном мембранотропном действии предизолона на плазматическую мембрану клетки, соответственно низкие значения - о недостаточном рецепторнеопосредованном эффекте стероида.

Проведено определение чувствительности мембран эритроцитов к преднизолону у детей, страдающих атопическим дерматитом и атопической бронхиальной астмой.

Исследованы эритроцитарные мембраны 29 детей, страдающих атопическим дерматитом, 8 детей, больных атопической бронхиальной астмой, и 10 детей, имеющих оба эти заболевания (всего 47 детей). В качестве контроля обследовано 7 детей, не имевших аллергических заболеваний.

Во всех случаях инкубация суспензии мембран с преднизолоном приводила к повышению отношения Pir2/Pir1: среднее для всех обследованных детей значение Pir2/Pir1 до инкубации - 1,00±0,03 ОЕ, после инкубации 2,01±0,06 ОЕ (р<0,001). Однако степень такого повышения, рассчитанная по предложенной формуле, оказалась различной.

Оказалось, что мембранотропное действие преднизолона на мембрану эритроцита достоверно снижено у детей, имеющих полиорганные проявления аллергии (сочетание бронхиальной астмы и атопического дерматита), по сравнению с контролем: 1,74±0,10 ОЕ и 2,81±0,41 ОЕ соответственно (р<0,05).

Стас С., возраст 7 лет, клинический диагноз: Бронхиальная астма средней степени тяжести, пылевая сенсибилизация, ремиссия. Атопический дерматит, локализованный, обострение. Аллергический ринит, круглогодичная форма. Клиническое течение характеризуется слабым ответом на применение топических глюкокортикоидов. Результат определения коэффициента мембранотропного действия преднизолона: 1,34 ОЕ при норме 2,81±0,41 ОЕ. Вывод: в комплексную терапию атопических заболеваний у данного ребенка требуется включение мембраностабилизирующих препаратов для повышения эффективности топических глюкокортикоидов.

Предлагаемый способ позволяет расширить диагностические возможности и повысить информативность исследования биологических эффектов глюкокортикоидов в отношении их прямого мембранотропного действия.

Источники информации 1. Денисов Ю. П. Физико-химические механизмы взаимодействия стероидных гормонов с биологическими мембранами: Автореф. дис.... канд. мед. наук, М., 1974.

2. Сергеев П. В., Сейфулла Р.Д., Халилов Э.М., Образцов Н.В. Изменения флуоресценции анилиннафталинсульфоната в микросомах в присутствии стероидных гормонов.// Биофизика.-1975.-Вып.4.-С.736.

3. Сергеев П.В. Стероидные гормоны.- М.: Наука.-1985, -239 с.

Формула изобретения

Способ количественной оценки прямого мембранотропного действия глюкокортикоидов на плазматическую мембрану клетки, заключающийся во флуоресцентном зондировании клеточной мембраны, отличающийся тем, что прямое мембранотропное действие глюкокортикоидов оценивается по коэффициенту, представляющему собой отношение микровязкости липидного бислоя мембраны эритроцита, определенной по степени эксимеризации пирена, в двух инкубированных пробах - с добавлением и без добавления в суспензию мембран глюкокортикоида.