Способ приготовления диагностикума для детекции противобруцеллезных антител в сыворотках крови методом дот- иммуноанализа

 

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к лабораторной диагностике. Способ осуществляется путем приготовления золя серебра и добавления полученного золя к водному раствору белковополисахаридного антигена бруцелл. Далее полученную смесь стабилизируют внесением фосфатного буфера, содержащего сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия. Способ приготовления диагностикума дешев, технологичен, доступен, позволяет отказаться от дорогостоящего оснащения, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность результатов дот-иммуноанализа.

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для приготовления диагностикума, с помощью которого в дот-иммуноанализе исследуются сыворотки крови на наличие противобруцеллезных антител.

В настоящее время в клинической лабораторной практике для обнаружения противобруцеллезных антител традиционно используют реакции Хеддльсона (РХ), Райта (РА), пассивной гемагглютинации (РПГА), связывания комплемента (РСК), Кумбса (Пинигин А.Ф., Петухова О.С. Методические рекомендации по бруцеллезу. - Иркутск, 1978. - 49 с.). Однако эти реакции недостаточно чувствительны и специфичны, с их помощью выявляется приблизительно 2/3 больных животных или людей. В связи с этим актуальными остаются вопросы совершенствования существующих и разработка новых, более информативных диагностических тест-систем.

Наиболее близким к предлагаемому является способ приготовления диагностикума для обнаружения противобруцеллезных антител в сыворотках крови с помощью белковополисахаридного антигена бруцелл, меченного коллоидным золотом (Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Марков Е.Ю., Есина Н.Л., Голубинский Е.П. Использование белковополисахаридного антигена бруцелл, меченного частицами коллоидного золота, для обнаружения специфических антител методом дот-иммуноанализа // Клиническая лабораторная диагностика. - 1999. - 3. - С. 39-41). Однако широкое применение этого маркера ограничивается необходимостью использования дорогостоящих золотохлористоводородной кислоты, лактата серебра и ультрацентрифуги для приготовления диагностикума.

Цель изобретения - удешевление, повышение технологичности и доступности способа приготовления диагностикума.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве золя коллоидного металла используют золь серебра, который готовят обработкой раствора азотнокислого серебра равным объемом раствора боргидрида натрия. Созревший золь дробно, в три приема с интервалами по 10 мин, добавляют к водному раствору белковополисахаридного антигена бруцелл. Через 30 мин после добавления последней порции золя реакционную смесь стабилизируют внесением равного объема фосфатного буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что в качестве золя коллоидного металла используют золь серебра, который готовят, восстанавливая серебро из 0,02%-ного водного раствора азотнокислого серебра равным объемом 0,05%-ного водного раствора боргидрида натрия при комнатной температуре и легком встряхивании, через 10-15 мин созревший золь добавляют к раствору белковополисахаридного антигена бруцелл в соотношении по объему 10:1 соответственно, дробно, в три приема с интервалами по 10 мин, через 30 мин после добавления последней порции золя реакционную смесь стабилизируют внесением равного объема фосфатного буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна".

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторы не нашли способ приготовления диагностикума для дот-иммуноанализа на основе бруцеллезного белковополисахаридного антигена, меченного коллоидным серебром, который бы использовался для обнаружения специфических антител. Предлагаемые режимы конструирования диагностикума позволяют достичь поставленной цели - удешевление, повышение доступности и технологичности способа приготовления диагностикума для детекции противобруцеллезных антител в сыворотках крови методом дот-иммуноанализа. При этом не используются дорогостоящие реактивы и оборудование (ультрацентрифуга). Данный диагностикум может производиться и применяться в клинических, ветеринарных и научно-исследовательских лабораториях, занимающихся диагностикой бруцеллеза.

Таким образом, предлагаемый способ приготовления диагностикума для детекции противобруцеллезных антител в сыворотках крови методом дот-иммуноанализа соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".

Предлагаемый способ приготовления диагностикума для обнаружения противобруцеллезных антител выполняется следующим образом: к 0,0001 г азотнокислого серебра, растворенного в 5 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем 0,05%-ного водного раствора боргидрида натрия. Смесь перемешивают 15 мин при комнатной температуре для созревания золя серебра. К 1 мл водного раствора белковополисахаридного антигена (БПА) концентрацией 4 мг добавляют дробно, в три приема, приготовленный золь серебра с интервалами по 10 мин и постоянном легком перемешивании в количестве 5 мл, 3 мл и 2 мл соответственно. Через 30 мин после добавления последней порции золя реакционную смесь стабилизируют внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 2% БСА, 20% телячьей фетальной сыворотки и 0,04% азида натрия.

Пример. К 0,0001 г азотнокислого серебра, растворенного в 5 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем 0,05%-ного водного раствора боргидрида натрия. Смесь перемешивают 15 мин при комнатной температуре для созревания золя серебра. К 1 мл водного раствора БПА концентрацией 4 мг добавляют дробно, в три приема, приготовленный золь серебра с интервалами по 10 мин и постоянном легком перемешивании в количестве 5 мл, 3 мл и 2 мл соответственно. Через 30 мин после добавления последней порции золя реакционную смесь стабилизируют в течение 30 мин внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 2% БСА, 20% телячьей фетальной сыворотки и 0,04% азида натрия. Полученный диагностикум использован в дот-иммуноанализе для детекции противобруцеллезных антител в сыворотках крови больных людей и животных. Отмечена высокая чувствительность и специфичность диагностикума, приготовленного по предлагаемой методике. Сыворотки считаются положительными, если специфические антитела в них выявляются в разведении ≥1:400.

Предлагаемая методика получения диагностикума легко воспроизводима, экономична, технологически проста, не требует специального дорогостоящего оснащения, доступна. Использование диагностикума в дот-иммуноанализе позволяет быстро и качественно осуществлять детекцию противобруцеллезных антител в сыворотках крови.

Диагностикум, приготовленный данным способом, апробирован в дот-иммуноанализе при исследовании 200 сывороток крови людей и животных. Во всех случаях у больных людей и животных с установленным диагнозом острого, хронического или резидуального бруцеллеза обнаружены специфические антитела. При исследовании сывороток крови здоровых людей или животных, а также гетерологичных сывороток противобруцеллезные антитела обнаружены не были, что указывает на высокую специфичность приготовленного диагностикума. Аналогичные результаты получены при параллельном исследовании указанных сывороток в дот-иммуноанализе с БПА, меченным коллоидным золотом. Однако диагностикум на основе серебра дешевле, технологичнее, доступнее, позволяет отказаться от использования дорогостоящих импортных реактивов и оборудования (ультрацентрифуги).

Формула изобретения

Способ приготовления диагностикума для детекции противобруцеллезных антител в сыворотках крови методом дот-иммуноанализа, включающий приготовление золя коллоидного металла и адсорбцию на нем белковополисахаридного антигена бруцелл, отличающийся тем, что в качестве золя коллоидного металла используют золь серебра, который готовят, восстанавливая серебро из 0,02%-ного водного раствора азотнокислого серебра равным объемом 0,05%-ного водного раствора боргидрида натрия при комнатной температуре и легком встряхивании, через 10-15 мин созревший золь добавляют к раствору белковополисахаридного антигена бруцелл в соотношении по объему 10:1, соответственно, дробно, в три приема с интервалами по 10 мин, через 30 мин после добавления последний порции золя реакционную смесь стабилизируют внесением равного объема фосфатного буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия.