Биспецифическая молекула антитела для лизиса опухолевых клеток, способ получения f(ab') 2 фрагмента биспецифической молекулы антитела, моноклональное антитело (варианты), фармацевтический препарат, фармацевтический набор для лизиса опухолевых клеток (варианты), способ лизиса опухолевых клеток ex vivo при аутогенной трансплантации костного мозга

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биспецифической молекуле антитела, которая узнает антиген лимфоцитов CD2 и любой вариабельный опухолевый антиген. Кроме того, изобретение касается двух новых моноклональных антител, обозначенных AICD2.М1 и AICD2.М2. Комбинация этих антител, по меньшей мере одно из которых представляет собой биспецифическую молекулу антитела, может успешно применяться в фармацевтическом препарате или наборе для терапии и диагностики опухолей. 8 с. и 5 з.п.ф-лы, 7 ил., 1 табл.

Изобретение касается новых биспецифических фрагментов антител, которые узнают антиген CD2 лимфоцитов и любой вариабельный опухолевый антиген. В качестве опухолевого антигена предпочтительно применяют антигенную детерминанту рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R). Кроме того, изобретение касается двух новых моноклональных антител, обозначенных AICD2.M1 и AICD2. M2, и комбинированного положительного действия на лизис опухолей, причем по меньшей мере одно из них представляет собой биспецифический фрагмент антител. Эти антитела и фрагменты антител могут успешно применяться в терапии и диагностике опухолей.

Т-лимфоциты, по-видимому, являются наиболее эффективными компонентами иммунной системы при элиминировании опухолевых клеток. Однако большинство раковых больных не имеет большого количества цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), специфически реактивных по отношению к их опухолевым клеткам (например, Knuth et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81, 3511). Для активации полного литического потенциала CTL все эти клетки должны быть направлены на опухолевые клетки, к которым они не имеют природной специфичности. Связывание моноклональных антител с определенными мембранными антигенами на поверхности Т-клеток может активировать пролиферацию Т-клеток, секрецию цитокинов и цитолитическую активность.

Было показано, что биспецифические антитела (ВАb), узнающие ассоциированные с опухолями антигены при помощи одного связывающего плеча и маркеры Т-клеток при помощи другого, соединяют моноспецифические CTL и злокачественные клетки (например, Staerz et al. 1985, Nature 314, 628).

Активация Т-клеток этими синтетическими антителами может происходить через комплекс рецептор Т-клеток (TCR)/CD3, в котором TCR ответственен за узнавание антигена, а эпитоп CD3 за трансдукцию сигналов, генерируемых взаимодействием TCR с антигеном (например, см. обзорную статью Н.Nelson, Cancer Cells, May 1991, 163 и цитированные в ней ссылки).

Активация эффекторных клеток может происходить также через антиген CD2, гликопротеин, присутствующий на Т-лимфоцитах и природных клетках-убийцах (NK) (например, et al. 1987, Nature 326, 298). CD2 способствует взаимодействию эффекторной клетки с природным лигандом LFA3 (CD58) на целевой клетке. На CD2 были идентифицированы три функционально важных эпитопа (T11.1, T11.2 и Т11.3). В противоположность антигену CD3, который подвергается модуляции при связывании антител, пока не было сообщений о модуляции CD2 после взаимодействия CD2 с антителом. В более ранней работе с применением антител против CD2 для активации было показано, что реалистичной является двухступенчатая активация через антиген CD2. Антитела, такие как анти-Т11.2 плюс анти-Т11.1 или анти-Т11.2 плюс анти-Т11.3, обладали синергически действующими специфичностями против CD2 при использовании их для активации. Сообщалось, что Т11.3 является критическим эпитопом, который становится доступным после активации при помощи анти-Т11.2. Большинство применяемых до сих пор антител конкурирует за связывание с природным лигандом CD2 LFA-3 (например, Bolhius et al. 1991, Cancer Immunol. Immunther, 34, 1, и цитированные ссылки).

Таким образом, целью данного изобретения было получение новых биспецифических антител, происходящих из противоопухолевых антител и пары синергически действующих антител против CD2, которые способны передавать цитотоксичность после двухступенчатой активации, не влияя на нормальную пресс-реактивность клеток через CD2/LFA3.

Было обнаружено, что новые биспецифические антитела, согласно данному изобретению, имеют следующие положительные свойства: обладают сильной авидностью к опухолевой клетке, сильной авидностью к Т-клеткам и NK-клеткам, не конкурируют с LFA3, не обнаруживают синергизма с LFA3, не модулируют рецептор, обладают высокой специфичностью в отношении NK- и Т-клеток, эффективны только после двухступенчатой активации, что означает, что одно BAb per se не влияет на активацию Т-клеток и, соответственно, на лизис опухолевых клеток.

Таким образом, объектом данного изобретения является биспецифическая молекула, применимая для лизиса опухолевых клеток, содержащая первый сайт связывания с эпитопом опухолевой клетки и второй сайт связывания с эпитопом антигена CD2 и имеющая обозначение BAb<X, AICD2.M1>Y или ВАb<Х, AICD2.M2>Y, где Ваb - биспецифическое антитело, X - детерминанта антител, узнающая опухолевый антиген, AICD2.M1, AICD2.M2 - моноклональные антитела, узнающие антиген CD2, Y - часть целого антитела.

AICD2.M1 и AICD2.M2 - новые моноклональные антитела, которые были получены иммунизацией мышей генно-инженерным антигеном CD2 и выделением и очисткой антител из подходящих мышиных гибридомных клеток (детали см. в примерах) и которые обладают высокой специфичностью в отношении CD2 антигена Т-- и NK-клеток.

Таким образом, объектом данного изобретения является моноклональное антитело, обозначаемое AICD2. M1, узнающее CD2 антиген, полученное путем выделения из клеточной линии 1 Н 10, депонированной под DSM ACC2118.

Объектом данного изобретения является также моноклональное антитело, обозначаемое AICD2.M2, узнающее CD2 антиген, полученное из клеточной линии 7 D 3, депонированной под DSM ACC2119.

Эти новые клеточные линии, продуцирующие названные антитела, были депонированы в "Deutsche Sammlung Mikroorganismen" (DSM, Braunschweig, FRG) согласно Budapest Treaty 23 февраля 1993.

Изобретение также касается моноклональных антител, которые являются природными или синтетическими вариантами или мутантами AICD2.M1 и AICD2.M2, в том числе генетическим модифицированными или сконструированными, предпочтительно "очеловеченными" и химерными вариантами.

Биспецифическая молекула согласно изобретению содержит плечо связывания AICD2. M1 или AICD2. M2 и другое плечо связывания антител, которые узнают любой опухолевый антиген. Выбор противоопухолевого антигена не оказывает значительного влияния на эффективность биспецифического антитела в отношении активации Т-клеток и лизиса опухолевых клеток. В предпочтительном варианте изобретения второе плечо связывания представлено плечом связывания моноклонального противоопухолевого антитела МАb 425, МАb 361 или МАb 15, в том числе согласно изобретению модифицированных, предпочтительно "очеловеченных" или химерных вариантов и генетически сконструированных минимальных фрагментов.

Таким образом, объектом данного изобретения является обеспечение биспецифического фрагмента антитела, описанного выше и в формуле изобретения, где Х - детерминанта антитела, происходящая из моноклональных антител МАb 425, МАb 361 или МАb 15.

МАb 425 представляет собой мышиное моноклональное антитело, образующееся против хорошо известной линии клеток человеческой А431 карциномы (АТСС CRL 1555), связывается с полипептидным эпитопом наружного домена человеческого рецептора эпидермального фактора роста EGF-R и ингибирует связывание EGF. Было обнаружено, что МАb 425 (АТСС НВ 9629) медиирует опухолевую цитотоксичность in vitro и подавляет рост опухолевых клеток клеточных линий, полученных из эпидермоида и колоректальной карциномы in vitro (Rodeck et al. 1987, Cancer Res. 47, 3692). "Очеловеченные" и химерные варианты МАb 425 были описаны в WO 92/15683.

МАb 361 представляет собой IgG2a мышиное моноклональное антитело (АТСС НВ 9325) и связывается специфически с GD2 антигеном и GD3 антигеном ганглиозида. Такими ганглиозидами сильно обогащены меланомные опухоли (ЕР 0280 209, US SN 016902).

МАb 361 обнаруживает высокий уровень цитотоксичности in vitro в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих GD2 антиген (Thurin et al. 1987, Cancer Res. 47, 1229).

МАb 15 представляет собой IgG1 мышиное моноклональное антитело, генерируемое в результате иммунизации клеткой ТКВ-2 мелкоклеточного рака легких человека (Endo et al. 1986, Cancer Res. 46, 6369). Это антитело узнает антиген ранней дифференциации.

Биспецифические антитела данного изобретения являются фрагментами целых антител, например, F(ab')2 молекулами или мини-антителами (Fv молекулами), предпочтительно F(ab')2 молекулами. В противоположность целым антителам такие фрагменты, как F(ab')2, и мини-антитела могут более легко проникать в массу твердых опухолей и проявлять свою цитотоксичность и силу внутри опухоли. Кроме того, F(ab')2 молекулы и мини-антитела, происходящие из мышей, обычно обнаруживают пониженную ответную реакцию человека на антитела против мышей (НАМА).

Таким образом, предпочтительным объектом данного изобретения является обеспечение биспецифического фрагмента антитела, описанного выше, отличающегося тем, что Y - F(ab')2 молекула. Особенно предпочтительные варианты выбраны из группы: ВАb<425, AlCD2.M1>F(ab')2, BAb<425, AICD2.M2>F(ab')2, BAb<361, AICD2.M1>F(ab')2, BAb<361, AICD2.M2>F(ab')2, BAb<15, AICD2.M1>F(ab')2, BAb<15, AICD2.M2>F(ab')2.

Были описаны различные способы получения биспецифических антител, основанные на полных антителах или фрагментах (например, см. обзорную статью Brissinck et al. 1992, Drugs of the Future 17(11), 1003). Одним из путей конструирования биспецифических фрагментов антител является превращение целых антител в (моноспецифические) F(ab')2 молекулы путем протеолиза, расщепляющего эти фрагменты на Fab' молекулы и рекомбинация Fab' молекул с разной специфичностью в биспецифические F(ab')2 молекулы (см., например, ЕР 0179872 В1).

Таким образом, объектом данного изобретения является обеспечение способа получения биспецифического F(ab')2 фрагмента антител, применимого для лизиса опухолевых клеток, имеющего первый сайт связывания с эпитопом опухолевой клетки и второй сайт связывания с эпитопом CD2 антигена, при помощи ферментативного превращения двух различных моноклональных антител, каждое из которых содержит две идентичные L (легкая цепь) - Н (тяжелая цепь) полумолекулы, соединенные одной или несколькими дисульфидными связями, в две F(ab')2 молекулы, расщепления каждой F(ab')2 молекулы при восстанавливающих условиях на Fab' тиолы, дериватизации одной из Fab' молекул каждого антитела активирующим тиол агентом и комбинирования активированной Fab' молекулы, несущей опухолевую специфичность, с неактивированной Fab' молекулой, несущей специфичность к лейкоцитам, или наоборот, для получения целевого биспецифического F(ab')2 фрагмента антитела. Способ отличается тем, что в качестве антител, узнающих антиген лейкоцитов, применяют моноклональные антитела AICD2.M1 и AICD2.M2.

В качестве ферментов, пригодных для превращения антитела в его F(ab')2 молекулы, можно применять пепсин и папаин. В некоторых случаях пригодны трипсин или бромелин. Однако в способе данного изобретения предпочтительно применять пепсин. Превращение дисульфидных связей в свободные SН-группы (Fab' молекулы) можно проводить при помощи восстанавливающих соединений, таких как дитиотреитол (ДТТ), меркаптоэтанол и меркаптоэтиламин. Активирующими тиол агентами, которые предотвращают рекомбинацию тиоловых полумолекул, являются 5, 5'-дитиобис- (2-нитробензойная кислота) (DTNB), 2,2'-дипиридиндисульфид, 4,4'-дипиридиндисульфид или тетратионат/сульфит натрия (см. также Raso et al, 1982, Cancer Res. 42, 457 и цитируемые ссылки). В способе данного изобретения предпочтительно применяют DTNB.

Обработку активирующим тиол агентом проводят только с одним из двух Fab' фрагментов. В принципе безразлично, какая из двух Fab' молекул превращается в активированный Fab' фрагмент (например, Fab'-TNB). Однако, как правило, тиолактивирующим агентом модифицируется более лабильный Fab' фрагмент. В данном случае фрагменты, несущие противоопухолевую специфичность, немного более лабильны и, следовательно, предпочтительно применяются в данном способе. Конъюгирование активированного Fab' производного со свободными SH-группами второй Fab' молекулы для образования бивалентного F(ab')2 антитела происходит спонтанно при температурах между 0 и 30^oС. Выход очищенного F(ab')2 антитела составляет 20-40% (от целых антител).

Как упомянуто выше, изобретение касается также биспецифических мини-антител. Мини-антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие два одноцепочечных F_V фрагмента (scFv фрагменты обычно генетически соединены либо в виде V_H-линкер-V_L, либо в виде V_L-линкер-V_H), которые соединяются путем аутоагрегации или путем слияния каждого из них на С-конце с шарнирным участком (иногда) для обеспечения гибкости и/или с амфипатической спиралью для достижения димеризации. Спираль может быть взята из конструкции четырехспирального пучка или из лейциновой "молнии" (например, Pack and 1992, Biochem 31, 1579). Получение мини-антител, описанных выше, представлено, например, в WO 93/0082.

Биспецифические фрагменты антител были тестированы in vitro/ex vivo в отношении следующих свойств: способности связываться со специфическими опухолевыми и Т-клетками, иммуномодуляции (пролиферации Т-клеток) и цитотоксичности (лизиса опухолевых клеток). Эти тесты описаны per se в стандартной литературе. Детали и результаты даны в примерах.

Биспецифические фрагменты антител данного изобретения могут вводиться больным для терапии. Таким образом, объектом изобретения является обеспечение фармацевтического препарата, содержащего в качестве активного ингредиента по меньшей мере один биспецифический фрагмент антител, как описано выше и в формуле изобретения, соединенный с одним или несколькими фармацевтическими приемлемыми носителями, наполнителями или разбавителями.

Как правило, фрагменты антител данного изобретения должны вводиться внутривенно или парентерально. Обычно диапазоны доз для введения биспецифических фрагментов антител достаточно велики для получения желаемого подавления опухоли и лизирующего действия. Доза зависит от возраста, состояния, пола и степени заболевания больного и может варьировать от 0,1 до 200 мг/кг, предпочтительно от 0,1 до 100 мг/кг на дозу, вводимую один раз или в несколько приемов в день в течение одного или нескольких дней.

Препараты для парентерального введения могут быть в виде стерильных водных или неводных растворов, суспензий и эмульсий. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, например оливковые масла, и пригодные для инъекций органические эфиры, например этилолеат, и другие растворители, известные в данной области, которые пригодны для этих целей. Биспецифические антитела могут применяться в композиции, содержащей физиологически приемлемый носитель. Примерами таких носителей являются физиологический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS), раствор Рингера или содержащий лактак раствор Рингера. В фармацевтических препаратах могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие как антибиотики, антиоксиданты и хелатирующие агенты. Биспецифические фрагменты антител могут быть также конъюгированы при помощи известных способов с цитокинами, такими как интерлейкин-2, для поддержания их цитотоксичности.

Фармацевтические препараты данного изобретения пригодны для лечения всех типов опухолей, в том числе меланом, глиом и карцином, а также опухолей кровеносной системы и твердых опухолей. Предпочтительные препараты содержат биспецифический фрагмент антител, в котором одно плечо связывания несет сайты связывания моноклональных антител МАb 425, МАb 361 и МАb 15.

Данное изобретение описывает очень эффективную двухступенчатую активацию лейкоцитов путем введения двух различных антител или биспецифических фрагментов антител, соответственно.

Следовательно, объектом изобретения является обеспечение фармацевтического набора частей (А), содержащего первый фармацевтический препарат (I), описанный выше и в формуле изобретения и содержащий биспецифический фрагмент антител ВАb<Х, AICD2. M2>Y, и второй отдельный фармацевтический препарат (II), содержащий МАb AICD2.M1 или MAb<AICD2.M1>Y или ВАb<Х, AICD2.M1>Y, где X, Y имеют указанное значение. В этом фармацевтическом наборе препарат (I) основан на МАb AICD2.M2, а препарат (II) на MAb AICD2.M1.

Альтернативно, изобретение касается набора частей (В), отличающегося тем, что препарат (I) основан на MAb AICD2.M1, тогда как препарат (II) основан на MAb AICD2.M2. Таким образом, следующим объектом данного изобретения является обеспечение фармацевтического набора частей, содержащего первый фармацевтический препарат, содержащий биспецифический фрагмент антител BAb<X, AICD2.M1>Y и второй отдельный фармацевтический препарат (II), содержащий MAb AICD2. M2 или MAb<AICD2.M2>Y или BAb<X, AICD2.M2>Y, где X, Y имеют указанное значение.

Различия между композициями (А) и (В) не очень значительны. В случае MAb 425 можно видеть, что композиция (В), в которой препарат (I) основан на MAb AICD2.M1, работает лучше.

Различия в опухолевых сайтах связывания внутри композиции (А) или (В) также не очень значительны. Эффективность фармацевтических наборов относительно связывающей способности, иммуномодуляции (пролиферации лейкоцитов) и цитотоксичности зависят, однако, от воздействия сайтов связывания биспецифических фрагментов антител, которые происходят из антител AICD2.M1 и AICD2. M2. Таким образом, предпочтительные варианты этого изобретения обнаруживают сходные свойства.

Различия в терапевтическом действии относительно препарата (II) (альтернативно, целые антитела, фрагмент моноспецифических антител или ВАb) также не очень значительны. Однако предпочтительны препараты (II), содержащие подходящий фрагмент моноспецифических антител.

Фармацевтический набор частей применяют следующим образом. Лечение начинают инъекцией препарата (I) одного из фармацевтических наборов больному. Биспецифическое антитело не только связывается согласно его специфичности с поверхностью опухоли, но вследствие его малых размеров, может также проникать в массу твердой опухоли. Введение фрагмента биспецифического антитела согласно данному изобретению дает обогащение инъецированным иммуноглобулином в локальной зоне опухоли, но еще не приводит к значительному иммунному ответу. После индивидуального периода времени (зависящего от степени заболевания, типа опухоли, состояния, пола и возраста больного) от нескольких часов до нескольких дней вводят препарат (II), что вызывает немедленные иммунные ответы. Препараты (I) и (II) вводят предпочтительно в эквимолярных количествах. Эксперименты ex vivo показывают, что аутогенные и аллогенные инфильтрующие опухоль лимфоциты (TIL_S), которые обычно не способны индуцировать значительную цитотоксичность против опухоли (лизис клеток), могут сильно активировать в результате такого способа (фиг.6А, 6B, 7).

При помощи фармацевтического набора данного изобретения можно также очистить ех vivo до опухолевых клеток препараты костного мозга. Для усиления цитотоксического действия можно добавить экзогенные Т-лимфоциты.

Следовательно, объектом данного изобретения является, наконец, обеспечение способа удаления опухолевых клеток ех vivo при аутогенной трансплантации костного мозга при помощи фармацевтического набора частей, описанного выше и в формуле изобретения, иногда в присутствии добавленных Т-лимфоцитов. Способ предусматривает обработку клеток препаратом (I) с последующей обработкой препаратом (II), иногда с последующей обычной стадией очистки. Способы очистки ex vivo костного мозга известны per se.

Краткое описание чертежей Фиг.1 - синтез ВАb (схема).

Фиг.2 - ПААГ-ДС-Na фрагментов антител и ВАb: дорожка 1: маркер мол. массы, дорожка 2: MAb<AICD2.M1>F(ab')2 перед восстановлением ДТТ,
дорожка 3: MAb<425> F(ab')2 перед восстановлением ДТТ,
дорожка 4: MAb<AICD2. M1>F(ab') 2 после восстановления ДТТ и дериватиэации DTNB,
дорожка 5: MAb<425>F(ab')2 после восстановления ДТТ и дериватизации DTNB,
дорожка 6: ВАb перед,
дорожка 7: ВАb после очистки.

Фиг.3 - хроматографический профиль BAb<425, AICD2.M1> F(ab')2 на гидроксилапатите:
левая вертикальная ось: оптическая плотность OD при 280 нм, правая вертикальная ось: концентрация фосфатного буфера (рН 7,0), горизонтальная ось: время элюирования (мин). Биспецифический фрагмент антител представлен пиком II. Пики I и II - минорные примеси.

Фиг.4 - конкурентное связывание ВАb/МАb с EGF-R:
вертикальная ось: % поглощения при 490 нм, горизонтальная ось: концентрация фрагментов антител в моль/л (логарифмическая шкала), меченные биотином МАb 425 применяли для конкуренции с немечеными MAb<425>F(ab') 2 или ВАb за связывание с EGF-R;
• ВАb< 425, AICD2.M1>F(ab')2,
▿ BAb< 425, AICD2.M2>F(ab')2,
□ MAb<425>F(ab')2.

Фиг.5 - пролиферация лейкоцитов периферической крови человека (PBL):
вертикальная ось: % включения ³H-тимидина, горизонтальная ось: концентрация фрагментов антител (мкг/мл);
• ВАb< 425, AICD2.M1>F(ab')2 + МАb <AICD2.M2>F(ab')2,
▿ BAb< 425, AICD2.M2>F(ab')2 + MAb<AICD2.M1>F(ab')2,
MAB<AICD2.M2>F(ab")2,
□ MAb<AICD2.M1>F(ab")2,
▪ MAb<425>F(ab')2.

Фиг. 6А - индуцированный ВАb лизис опухоли: аллогенные TIL в качестве эффекторных клеток:
вертикальная ось: % цитотоксичности, горизонтальная ось:
1 =BAb<425.AICD2.M1>F(ab')2+
MAb<AICD2.M2>F(ab')2,
2 = MAb<AICD2.Ml>F(ab')2,
3 = MAb<AICD2.M2>F(ab')2,
4 = MAb<425>F(ab')2.

Фиг. 6B - индуцированный ВАb лизис опухоли: аутогенные TIL в качестве эффекторных клеток:
вертикальная ось: % цитотоксичности, горизонтальная ось:
1 = BAb<425, AICD2.M1>F(ab')2+ MAb<AICD2.M2>F(ab')2,
2 = BAb< 425, AICD2.M2>F(ab')2 + MAb<AlCD2.M1>F(ab')2,
3 = MAb<AICD2.M1>F(ab')2,
4 = MAb<AlCD2.M2>F(ab')2,
5 = MAb<425>F(ab')2.

вертикальные линии на верхней части столбцов: среднее отклонение.

Фиг.7 - медиированное ВАb попадание Т-клеток в мишень и лизис опухолевых клеток:
Фиг.7А и В показывают совместную культуру инфильтрующих опухоль лимфоцитов (TIL) и аутогенных злокачественных клеток при отношении эффектор/мишень 40/1. Совместную культуру инкубировали 4 ч без (фиг.7А, контроль) и в присутствии
ВАb< 425, AICD2.M1>F(ab')2 + MAb<AICD2.M2>F(ab')2
(20 мкг/мл каждого) (фиг.7В). В присутствии CD2 ВАb многочисленные Т-лимфоциты слипаются с аутогенными опухолевыми клетками, впоследствии убивая клетки меланомы. Стрелка на фиг. 7В указывает конъюгат TIL с разрушенной клеткой меланомы. Совместное культивирование TIL и клеток меланомы проводили на 24 планшетах с ячейками в культуральной среде, содержащей 10% FSC. Микроснимки были получены при помощи модифицированного фазово-контрастного микроскопа, увеличение оригинала 100.

Следующие примеры описывают изобретение в деталях.

Пример 1
Получение MAb AICD2.M1 и AICD2.M2
Мышей Balb/С иммунизировали 4 раз в течение двух недель генетически сконструированным CD2. Последовательность ДНК человеческого CD2 и его клонирование было описано Sayre et al. 1987, Proc. Natl. Acad. USA 84, 2941. Экспрессию гена CD2 проводили в систему бакуловируса по способам, известным в литературе (Fraser 1992, Current Topics in Microbiol. Immunol. 158, 131 и цитированные ссылки).

Клетки селезенки иммунизированных мышей выделяли и сливали с линией клеток миеломы (Аg8.653, АТСС CRL 1580). Гибридомы подвергали скринингу на образование специфических моноклональных антител путем испытания супернатантов растущих гибридом на человеческих Т-лимфоцитах (CD2 положительных) при помощи клеточного сортера с активацией флуоресценции (FACS). Положительные гибридомы извлекали клонированием способом серийных разведении. Супернатанты отобранных гибридом исследовали при помощи иммунопреципитации и Вестерн-блот анализа. Выделение отобранных моноклональных антител было достигнуто очисткой культур супернатантов по Еу et al. 1978, Immunochemistry, 15, 429.

Функциональный анализ CD2 антигена, направленного к антителам, проводили при помощи теста пролиферации (включения ³H-тимидина). Для антитела, отобранные из ряда моноклональных антител, реагирующих с CD2 антигеном, сильно индуцировали пролиферацию Т-клеток. Эти моноклональные антитела были обозначены как AICD2.M1 и AICD2.M2 и депонированы в Deutsche Sairanlung Mikroorganismen.

Были использованы стандартные способы. Многие из них описаны, например, в "Antibodies, a Laboratory Manual", Harlow and Lane, 1988, Cold Spring Harbor и цитированных здесь ссылках.

Пример 2
Синтез BAb<425, AICD2.M1>F(ab') 2
Синтез начинали с 10 мг антитела AICD2.M1 и 10 мг антитела МАb 425. Антитела обрабатывали для предактивации папаином (10 мг/мл) в цитратном буфере, 3 мМ ЭДТА, рН 5,5. После протеолиза F(ab')2 извлекали из элюата колонки protein A sepharose. Выход F(ab')2 был, как правило, близок к 100%. Оба фрагмента F(ab')2 отдельно превращали в Fab' фрагмент обработкой 0,5 мМ ДТТ в течение 40 мин при 30^oС. После восстановительной стадии избыток ДТТ удаляли и Fab' извлекали при помощи гель-фильтрации (Superdex® 200). В данном способе производное Fab'-TNB получали обработкой МАb 425 фрагмента 0,5 мМ реагента Эллмана (5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота) (DTNB) при 4^oС в течение 60 мин. Избыток DTNB удаляли гель-фильтрацией. 6 мг каждого из партнеров конъюгации (Fab'-AICD2.M1 и Fab'-TNB МАb 425) применяли для конечной стадии конъюгации, проводимой при перемешивании смеси при 4^oС в течение 18 ч. Биспецифические антитела извлекали из реакционной смеси гель-фильтрационной хроматографии (Superdex® 200). Выход синтетического препарата F(ab')2 был в диапазоне 3-4 мг (≈30%). Последовательности операций синтеза Ваb суммированы в фиг.1.

Пример 3
Синтез ВАb<361, А1СР2.М1>F(аb')2
Биспецифическое антитело получали соответственно примеру 2, исходя из МАb AICD2.M1 и МАb 361. Выход ВАb был приблизительно 34%.

Пример 4
Синтез ВАb<15, AICD2.M1>F(ab') 2
Биспецифическое антитело получали согласно примеру 2, исходя из МАb AICD2.M1 и МАb 15. Выход ВАb был приблизительно 23%.

Пример 5
Синтез BAb<425, AICD2.M2>F(ab') 2
Биспецифическое антитело получали согласно примеру 2, исходя из МАb AICD2.М2 и МАb 425. Выход ВАb был приблизительно 30%.

Пример 6
Синтез ВАb<425, AICD2.М1>(scFv)2
Два одноцепочечных белка, состоящих из VL и VH доменов AICD2.M1 и МАb 425, получали молекулярной инженерией (Winter et al. 1991, Nature 349, 293-299). Экспрессирующие плазмиды были получены из pHEN1 (Hoogenboom et al. Nucleic Acid Res. 19, 4133-4137), которая содержит структурные гены для VL и VH доменов, происходящие либо из мышиной гибридомы против EGF-R (МАb 425), либо из мышиной гибридомы против CD2 (AICD2.M1). Лидерную последовательность ре1В применяли для медиирования периплазматической секреции в E.coli. scFVs очищали при помощи аффинной хроматографии и применяли для конструирования биспецифического scFv. Химическое перекрестное сшивание EGF-R и СD2-специфических scFvs проводили при помощи реагента 2-Иминотиолана и гетеробифункционального кросс-линкера SPDP. Исходя из 10 мг MAb<425>scFv мы достигли статистического включения одной молекулы 2-пиридилдисульфида на молекулу scFv через SPDP. Очистку этого производного проводили при помощи гель-фильтрационной хроматографии. Реактивную -3Н-группу вводили в MAb<AICD. M1>scFv при помощи дериватизации 10 мг scFv 2-Иминотиоланом. Очистку этого производного проводили при помощи гель-фильтрационной хроматографии. Эквимолярные количества активированного 2-пиридилсульфидом MAb<425>scFv и модифицированного 2-Иминотиоланом MAb<AICD2.M1>scFv связывали вместе при нейтральном рН. Реакция связывания сопровождалась выделением пиридин-2-тиона. Конечный биспецифический продукт извлекали гель-фильтрационной хроматографией с выходом приблизительно 5%.

Пример 7
Характеристика биспецифических антител
Отдельные стадии синтеза ВАb прослеживались при помощи ПААГ-ДС-Na согласно обычным известным способам. Полупродукты химического синтеза и конечные биспецифические продукты представлены на фиг.2. Кроме анализа в ПААГ-ДС-Na, чистота и гомогенность ВАЬ оценивались при помощи хроматографии на колонке гидроксиапатита. Элюирование ВАb проводили градиентом фосфатного буфера (рН 7,0, 0-0,3 ммоль/л). Фиг.3 показывает хроматографический профиль BAb<425, AICD2. M1>F(ab')2. BAb представлено основным пиком II, меньшие пики I и III являются минорными примесями.

Пример 8
Связывающие свойства BAb<425, AICD2.M1>F(ab') 2 в отношении EGF-R
Связывающие свойства этого биспецифического антитела сравнивали при помощи конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа ELISA. Вкратце: меченные биотином МАb 425 применяли для конкуренции с немечеными антителами или BAb за связывание с EGF-R, EGF-R выделяли из А 431 клеток (АТСС CRL 1555) известными способами. А 431 клетки CD2 отрицательны. Детектирование проводили после инкубирования с POD-конъюгированным стрептавидином и субстратом. На основании этих данных строили кривые ингибирования (фиг.4). Кривые ингибирования для обоих BAb были сдвинуты вправо, что свидетельствует о потере аффинности, вызываемой изменением двухвалентного связывания на моновалентное.

Пример 9
Связывающие свойства ВАb<МАb 425, МАb AICD.M2>F(ab')2 в отношении EGF-R
Связывающие свойства этого биспецифического антитела исследовали согласно примеру 8 (фиг.4). Оба BAb имели сравнимую авидность в отношении их антигена-мишени.

Пример 10
Связывающие свойства биспецифических и моноспецифических фрагментов антител в отношении CD2 антигена
Jurkat клетки (острый Т-клеточный лейкоз человека, CD2, CD3 - положительные, EGF-R - отрицательные; АТСС TIB 152) инкубировали (1•10⁶ клеток на пробу) с логарифмическими разведениями биспецифического/моноспецифического фрагмента антител в течение 15 мин при 4^oС. Затем клетки промывали и инкубировали с козьими анти-мышиными-каппа-FITC в качестве антисыворотки второй стадии. Клетки снова промывали и анализировали иммунофлуоресценцию при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции FACStar plus®. FACStar plus® с одиночным лазерным возбуждением и реестровым способом сбора информации был применен для анализа скрещивания антител живых клеток. Были определены удельные интенсивности флуоресценции всей клеточной популяции и процент реагирующих с антителами клеток. Распределения флуоресценции клеток, окрашенных антисывороткой второй стадии, служили в качестве отрицательных контролей.

В таблице указаны полунасыщающие концентрации (конц._{1/2 нас.} ) как мера связывающей силы различных биспецифических/ моноспецифических фрагментов антител на клетках Jurkat. Величины для конц._{1/2 нас.} были взяты с кривых титрования (интенсивность флуоресценции/линейное воспроизведение) по отношению к концентрации антител), и, следовательно, представляют собой лишь грубые оценки.

Пример 11
Пролиферация лейкоцитов
Мононуклеарные лейкоциты периферической крови культивировали вместе с освещенной (30Gy) аутогенной опухолевой клеткой в среде (RPMI 1640) с добавлением Il-2 (интерлейкина-2) (20 Е/мл) и Il-4 (1000 Е/мл). Клетки-респондеры слабо ре стимулировались аутогенными опухолевыми клетками.

Свежеприготовленные лейкоциты периферической крови человека (huPBL) из здоровых доноров крови или больных с меланомой культивировали на микротитровальных планшетах с плоским дном и с 96 ячейками в конечном объеме 200 мкл при плотности 1•10⁵ клеток на ячейку. Клетки инкубировали с моноспецифическими или моноспецифическими+биспецифическими фрагментами антител в указанных концентрациях. Через 72 часа клеткам давали 0,5 мкКи ³H-тимидина, инкубировали в течение ночи и собирали. Включение ³H-тимидина измеряли путем сцинтиляционного β-plate счета и результаты выражали в виде средних величин имп/мин. Результаты для фрагментов антител, полученных из МАb 425, можно видеть в деталях на фиг.5. Подобные результаты были получены с использованием фрагментов антител, полученных из МАb 361 и МАb 15. Комбинированное введение фрагментов антител вызывает значительную индукцию пролиферации в каждом из этих случаев.

Пример 12
Индуцированный ВАb лизис опухолей
Клеточная линия С8161, высокоинвазивная и спонтанно метастатическая, EGF-R - положительная линия меланомных клеток человека (Welch et al. 1991, Int. J. Cancer 47, 227 и цитированные ссылки) была применена в качестве мишени для EGF-R - зависимой доставки к ней аллогенных и аутогенных инфильтрующих опухоль Т-лимфоцитов (TIL). Можно применять также и другие EGF-R - положительные линии меланомных клеток человека. Исходная культура TIL была исходно получена из образца меланомы. Условия культивирования опухолевых клеток и TIL были описаны ранее (например, Shimizu et al. 1991, Cancer Res. 51, 6153).

Получение стабильных CTL клонов проводили с применением MLTC клеток-респондеров при условиях способа серийных разведении, MTLC Т-клетки-респондеры высевались (одна клетка на ячейку) на планшеты с 96 ячейками в среду с добавлением Il-2 и Il-4 вместе с аутогенными стимуляторными клетками и аутогенными В-клетками, трансформированными EBV, в качестве питающих клеток.

Т-лимфоциты из свежих опухолевых биопсий активировали иммобилизованными антителами против CD3 и увеличивали в объеме в RPMI с добавлением Il-2 и Il-4.

Тесты на цитотоксичность in vitro проводили с применением ⁵¹Сr меченых опухолевых клеток. Клетки-мишени метили ⁵¹Сr (100 мКи/10⁷ клеток) в течение 1 ч и промывали 3 раза. Константное число меченых клеток (2•10³ на ячейку) инкубировали вместе с моноспецифическим или биспецифическим антителом или их сочетанием вместе с эффекторными TIL при отношении эффектор/мишень 7/1. CTL были серийно разведены в трех повторностях в 100 мл среды на микротитровальных планшетах с 96 ячейками. После добавления меченых клеток-мишеней планшеты инкубировали 4 ч при 37^oС в 10% CO₂. Тесты останавливали центрифугированием. Супернатанты собирали и радиоактивность измеряли в g-счетчике. Процент удельного высвобождения ⁵¹Сr рассчитывали по формуле:
% удельного ⁵¹Cr-выcвoбoждeния = 100 (экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение) (максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение)
Результаты для фрагментов антител, полученных из МАЬ 425 можно видеть в деталях на фиг.6A, 6B и фиг.7. Подобные результаты были получены с применением фрагментов антител, полученных из МАb 361 и МАb 15. Комбинированное введение фрагментов антител вызывало значительную индукцию лизиса опухоли в каждом из этих случаев.

Формула изобретения

1. Биспецифическая молекула антитела для лизиса опухолевых клеток, включающая в себя первый сайт связывания с эпитопом антигена опухолевой клетки, второй сайт связывания с эпитопом антигена СD2 и имеющая формулу BAb<Х, АICD2. М1>Y или BАb<Х, АICD2.М2>Y, где BАb - биспецифическое антитело, Х - детерминанта антитела, выбранная из группы моноклональных антител МАb 425, МАb 361, МАb 15, Y - F (аb')2-фрагмент, АICD2.М1 или АICD2.М2 - антитела, специфичные к антигену СD2.

2. Биспецифическая молекула антитела по п.1, отличающаяся тем, что она выбрана из группы
BАb<425, АICD2.М1>F(аb')2
BАb<425, АICD2.М2>F(аb')2
BАb<361, АICD2.М1>F(аb')2
BАb<361, АICD2.М2>F(аb')2
BАb<15, АICD2.М1>F(аb')2
BАb<15, АICD2.М2>F(аb')2
3. Способ получения фрагмента F (ab')2 биспецифической молекулы антитела по п. 1, используемой для лизиса опухолевых клеток, содержащего первый сайт связывания с эпитопом опухолевой клетки и второй сайт связывания с эпитопом антигена СD2, путем ферментативного превращения двух различных моноклональных антител, каждое из которых содержит две идентичные L (легкая цепь)-Н (тяжелая цепь)-полумолекулы, соединенные одной или несколькими дисульфидными связями, в две молекулы F(ab')2, расщепления каждой из F (ab')2-молекул при восстанавливающих условиях на Fab'-тиолы, дериватизации одной из Fab'-молекул каждого антитела активирующим тиол агентом и комбинирования активированной Fab'-молекулы, несущей опухолевую специфичность, с неактивированной Fab'-молекулой, несущей специфичность к лейкоцитам, или наоборот, с получением биспецифического F(ab')2-фрагмента антитела, отличающийся тем, что в качестве антитела, узнающего антиген СD2, используют моноклональное антитело АICD2.М1 или АICD2.М2.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве антитела, узнающего антиген опухолевой клетки, используют МАb 425, МАb 361 или МАb 15.

5. Моноклональное антитело АICD2.М1, узнающее антиген СD2, продуцируемое клеточной линией 1 Н 10, депонированной под регистрационным DSM ACC2118.

6. Моноклональное антитело АICD2.М2, узнающее антиген СD2, продуцируемое клеточной линией 7 D 3, депонированной под регистрационным DSM АСС2119.

7. Фармацевтический препарат для лизиса опухолевых клеток, содержащий антитело, охарактеризованное в любом из пп.1 и 2, соединенное с одним или несколькими носителями, наполнителями или разбавителями.

8. Фармацевтический набор для лизиса опухолевых клеток, содержащий первый фармацевтический препарат, охарактеризованный в п.7, содержащий антитело ВAb<X, АICD2. М2>Y, и второй фармацевтический препарат, содержащий антитело МAb АICD2. М1 или Мab< АICD2.М1>Y или ВAb< АICD2.М1>Y, где Х и Y имеют указанные в п.1 значения.

9. Фармацевтический набор для лизиса опухолевых клеток, содержащий первый фармацевтический препарат по п.7, содержащий антитело BAb<X, АICD2.М1>Y, и второй фармацевтический препарат, содержащий антитело Маb АICD2.М2 или Маb<X, АICD2. М2>Y или ВAb<X, АICD2.М2>Y, где Х и Y имеют указанные в п.1 значения.

10. Фармацевтический набор для лизиса опухолевых клеток по п.9, отличающийся тем, что первый фармацевтический препарат содержит антитело
ВAb<425, АICD2.М1>F(аb')2 или
ВAb<361, АICD2.М1>F(аb')2 или
ВAb<15, АICD2.М1>F(аb')2,
а второй фармацевтический препарат содержит
МAb<АICD2.М2>F(аb')2.

11. Способ лизиса опухолевых клеток ex vivo при аутогенной трансплантации костного мозга, включающий в себя обработку опухолевых клеток последовательно первым и вторым фармацевтическими препаратами из фармацевтического набора по любому из п.8 или 10.

12. Способ по п.11, включающий в себя обработку опухолевых клеток в присутствии Т-лимфоцитов.

13. Способ по любому из пп.11 и 12, включающий в себя последующую стадию доочистки.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8