Штамм lactobacillus paracasei subsp. paraсasei, пищевой продукт и натуропатический препарат, содержащие этот штамм

 

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской и пищевой промышленности. Штамм Lactobacillus paracasei subsp. paracasei LMG Р-17806 применяют в качестве пробиотика в пищевых продуктах и натуропатических препаратах. Устойчив in vitro к действию соляной кислоты и желудочного сока, сохраняет соли желчных кислот без их деконъюгации в условиях их интенсивной ассимиляции. Характеризуется хорошим уровнем выживаемости при прохождении через желудок и пищеварительный тракт, оптимально растет при температуре примерно 37^oС. Штамм представляется грам-положительной гомоферментативной палочковидной бактерией, способной вырабатывать L-молочную кислоту и содержащей три плазмиды размером соответственно 2,2, 4,36 и 9,1 тысяч пар нуклеотидов. Пищевой продукт и натуропатический препарат, облегчающие атопические реакции и/или корректирующие клостридии и повышающие содержание бифидобактерий и колиформных бактерий, представляют собой композицию, включающую биомассу указанного штамма в пищевом продукте или инертном наполнителе с заданным титром бактерий. Изобретение обеспечивает повышенную выживаемость штамма при прохождении его через кишечник, положительное влияние на вкусовые качества целевых продуктов на его основе. 3 с. и 3 з.п. ф-лы, 10 табл.

Изобретение касается штамма Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, его композиций, предназначенных для использования в пищевых продуктах, а также продукта, содержащего упомянутый штамм.

Определение и характеристика штамма Новый штамм (который в дальнейшем в целях упрощения изложения обозначается как LMG Р-17806) является вариантом вида Lactobacillus paracasei ssp. paracasei. Ему характерно свойственное данному виду содержание GC на уровне 44%. Штамм LMG Р-17806 был выделен из образцов кишечной микрофлоры человека. LMG P-17806 является грамположительной гомоферментативной палочковидной бактерией. Он вырабатывает L-молочную кислоту (левосторонний стереоизомер молочной кислоты) и характеризуется оптимумом роста при 37^oС. Этот штамм характеризуется резистентностью к действию in vitro соляной кислоты и желудочного сока, толерантностью солей желчных кислот без их деконъюгации, а также способностью к интенсивной ассимиляции холестерина. Также этот штамм характеризуется наличием в клетках трех плазмид с ДНК длиной 2,2, 4,36 и 9,1 тысяч пар нуклеотидов соответственно. Другими характеристиками этого штамма является способность ферментировать (расщеплять) рибозу, адонитол, галактозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, сорбозу, маннитол, сорбитол, N-ацетилглюкозамин, эсколин, целлобиозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, инулин, мелецитозу, D-туранозу и D-тагатозу. С другой стороны, он не способен ферментировать глицерин, эритритол, D- и L-арабинозу, D- и L-ксилозу, β-метил-D-ксилозид,рамнозу,дульцит,инозитол,α-метил-D-маннозид,α-метил-D-глюкозид, амигдалин, арбутин, салицин, мелибиозу, раффинозу, крахмал, гликоген, ксилитол, гентиобиозу, D-ликсозу, D- и L-фукозу, D- и L-арабитол и 2- и 5-кетоглюконат.

Данный штамм был охарактеризован с применением SDS-электрофореза в геле, по параметрам которого проводили сравнение с шестью другими штаммами молочнокислой бактерии Lactobacillus paracasei ssp. paracasei. В этом сравнении были показаны отличия от всех других ранее описанных штаммов; в то же время данные сравнения с другими молочнокислыми бактериями подтверждают принадлежность заявляемого штамма обозначенному виду. Также штамм был охарактеризован по параметрам рибосомной РНК с применением так называемого "рибопринтера" Riboprinter®. По данным этого метода для данного штамма было установлено 76%-ное сходство с типовым штаммом подвида Lactobacillus paracasei ssp. paracasei и 72%-ное сходство с типовым штаммом Lactobacillus casei, проанализированного тем же способом.

Данный штамм был депонирован в Бельгийскую коллекцию микроорганизмов (ВССМ), коллекция LMG, в которой ему был присвоен депозитарный LMG Р-17806.

Преимущества заявляемого штамма Штамм LMG Р-17806 при сравнении с известными штаммами бактерий рода Lactobacillus проявляет принципиальные преимущества в использовании в качестве пробиотического материала в пищевых продуктах и натуропатической медицине благодаря уникальному сочетанию ценных свойств: - данный штамм характеризуется существенной устойчивостью к действию желудочного сока и солей желчных кислот, но в отличие от многих других штаммов он не обусловливает деконъюгации солей желчных кислот; - он характеризуется существенной способностью ассимилировать холестерин; - данный штамм хорошо "переносит" прохождение через желудок; - данный штамм влияет на условия в модели кишечника в результате увеличения выработки в нем L-молочной кислоты; - данный штамм не проявляет больших провоспалительных свойств по сравнению с обычными йогуртовыми бактериями; - данный штамм защищает клетки кишечника от инфицирования патогенными микроорганизмами, такими как Salmonella typhimurium; - данный штамм проявляет свойства антагониста в отношении бактерии Helicobacter pylori - патогена язвы желудка;
- данный штамм продуцирует бактериоцины, активные в отношении клостридий;
- данный штамм хорошо выживает в молоке, как в замороженном, так и высушенном состояниях;
- данный штамм, в отличие от многих других молочнокислых бактерий, характеризуется положительным влиянием на вкусовые качества ферментированных молочных продуктов (не дает какого-либо неприятного привкуса).

Заявляемый штамм Lactobacillus paracasei ssp. paracasei может быть использован в качестве пищевой добавки или как натуропатический препарат (т.н. "лечебной пище"), или в качестве добавки в натуропатических препаратах.

Такие препараты могут быть использованы для детей при решении проблемы сглаживания атопических (аллергических) реакций для пожилых людей с целью коррекции микрофлоры, естественным образом изменяющейся с возрастом, или коррекции изменившейся секреции соляной кислоты; и для людей в целом с целью нормализации кишечной флоры, в результате чего будет снижаться количество клостридий, количество молочнокислых и бифидобактерий будет увеличиваться, а количество коли-бактерий будет снижаться.

Благодаря указанным свойствам штамм LMG Р-17806 отличается от известных в настоящее время штаммов так, как это будет показано в нижеследующих примерах.

Получение данного штамма
Данный штамм получают обычным для молочнокислых бактерий путем. Используется обычный для молочнокислых бактерий субстрат. Этот субстрат должен, например, содержать по крайней мере один вид углеводов, который данный штамм способен утилизировать в соответствии с вышеприведенными перечнями, в сочетании с белками, витаминами, минеральными компонентами и другими пищевыми компонентами, которые в норме являются необходимыми для молочнокислых бактерий. Примерами пригодных коммерческих субстратов являются глюкозодрожжевой бульон, MRS (бульон де Мана-Рогоза-Шарпа), Rogosa, молоко с небольшим добавлением дрожжевого экстракта и т.п. Данный штамм культивируется в условиях микроаэрации или же при полном отсутствии кислорода, при температуре от +15 до +42^oС. Если субстрат засевается 0,1-1% выращиваемого материала, то пригодным временем культивирования является 10-40 часов. Данный штамм может быть, если это желательно, сконцентрирован с помощью центрифугирования или отфильтровывания, после чего концентрат промывают с целью удаления культуральной среды. Этот концентрат затем может быть заморожен или лиофилизован обычным путем. В этом случае может быть достигнуто приготовление от 100 миллионов до 100 миллиардов живых бактерий штамма LMG Р-17806 в расчете на 1 г полученного материала. Он затем может быть использован сам по себе или использован в качестве пищевой добавки, например, к молоку или иному продукту, в котором штамм LMG P-17806 получит возможность выживать и, если это желательно, расти.

Исследования
А. Исследования результатов прохождения данного штамма через пищеварительный тракт
Штамм LMG Р-17806 культивировали описанным выше образом и добавляли в молоко вместе с йогуртными культурами. Ферментированный продукт получали путем инкубации молока в течение 5 часов при 42^oС. Был получен вкусный продукт, в котором содержалось 100 миллионов живых бактерий LMG Р-17806 в расчете на 1 г продукта. Здоровым индивидуумам давали этот продукт ежедневно три раза по 200 г в течение недели. Общее количество "съеденной" бактерии LMG Р-17806 составляло от 40 до 200 миллиардов клеток.

Анализ каловых масс проводили перед приемом продукта, через неделю после этого и через неделю после прекращения эксперимента. Как видно из табл. 1 и 2, приведенных ниже, у обследованных лиц наблюдалось существенное возрастание количества молочнокислых бактерий. У каждого из индивидуумов было выделено по два изолята с целью видовой диагностики, т.е. всего было получено 20 изолятов. Исходя из проведенной классификации фенотипа бактерий, для 18 изолятов было подтверждено соответствие штамму LMG Р-17806. Этот штамм бактерий не выявлялся в исследованных образцах ни до, ни после употребления бактерий штамма LMG Р-17806.

Средний уровень содержания в образцах кала в ходе эксперимента был очень высоким и варьировался в весьма средних пределах - от 63 до 320 миллионов бактерий на 1 г, т.е. в 5-кратном диапазоне. Заслуживающим внимания являлось то, что содержание было практически одинаковым независимо от того, каким было содержание в начале данного эксперимента. После прекращения приема продукта содержание возвращалось на тот уровень, который представляется естественным для обследуемого индивидуума.

В табл. 1 и 2 содержание молочнокислых бактерий в кале показано в миллионах бактерий на 1 г: использовалось выращивание на субстрате Rogosa.

Проведенный анализ показывает, что данный штамм характеризуется хорошей выживаемостью при прохождении через пищеварительный тракт.

В. Анализ образования L-молочной кислоты данным штаммом в модели толстого кишечника
Описанный выше ферментированный продукт добавляли к так называемому SHIME-реактору, который является моделью толстого кишечника in vitro. Образцы брали из той части реактора, которая соответствует наиболее важным отделам толстого кишечника. Сходные сравнительные тесты были осуществлены с использованием некоторых других штаммов молочнокислых бактерий, а также близкородственных представителей L.paracasei ssp. paracasei. Как видно из табл. 3, штамм LMG Р-17806 обусловливал резкое повышение выработки L-молочной кислоты, которая является изомером молочной кислоты, присущим именно штамму LMG P-17806. Выработка молочной кислоты рассматривается как позитивный признак из-за ряда причин, в частности, благодаря противобактериальной активности молочной кислоты, равно как и то, что благодаря снижению рН снижается количество и интенсивность образования азотсодержащих соединений.

Реактор 4 соответствует передней части толстого кишечника, реактор 5 - средней части, а реактор 6 - задней части толстого кишечника. Проведенный анализ показывает, что данный штамм вырабатывает L-молочную кислоту в использованной модели толстого кишечника.

С. Исследование защиты данным штаммом клеток эпителия кишечника от инфицирования Salmonella typhimurium
Эпителиальные кишечные клетки линии СаСо-2 культивировали in vitro. К ним добавляли сочетание молочнокислых бактерий и Salmonella typhimurium в соотношении 100:1 с добавлением 1 миллиона клеток сальмонеллы на 1 мл. Проявляемый эффект анализировали после 120-минутной инкубации при 37^oС. Количество инфицировавшихся клеток сальмонеллы анализировали путем трехкратной промывки планшетов, к которым прикрепляются клетки СаСо-2. Прикрепившиеся клетки обрабатывали антибиотиком гентамицином в концентрации 100 мг/л в течение 1 часа с целью уничтожения всех бактерий, которые не проникли внутрь клеток. Затем планшеты промывали фосфатно-солевым буфером с целью удаления всего гентамицина и наконец захваченные бактерии выделяли путем обработки клеток СаСо-2 0,1%-ным Тритоном-Х при встряхивании. Количество сальмонелл затем определяли с помощью стандартной техники высева клеток. Штамм LMG Р-17806 проявлял положительный эффект в том, что количество инфицированных сальмонеллой клеток снижалось. Напротив, близкородственный штамм L.paracasei - К-506, как представляется, стимулирует инфицирование сальмонеллами. Также и в отношении этого параметра штамм LMG Р-17806 проявляет позитивный эффект. Полученные результаты представлены в табл. 4.

Из табл. 4 видно, что штамм LMG Р-17806 обусловливает отчетливую защиту от заражения сальмонеллами.

D. Исследование защиты от Helicobacter pylori
На модели мышей, в которой мышей инфицировали бактериями Helicobacter pylori, анализировали эффект скармливания молочного продукта, ферментированного с использованием штамма LMG P-17806, в одном из вариантов, и в отсутствие упомянутого штамма в другом варианте, оценивая содержание Н.pylori путем измерения количества этих бактерий в фекалиях.

Мышей инфицировали 100 миллионами бактерий Н. pylori штамма 17874 в спиральной форме трижды с интервалом 1 день. Затем мышам скармливали экспериментальные продукты и содержание бактерий в фекалиях измеряли с использованием гепаринизованных намагниченных шариков и применением иммуноферментного анализа. Были протестированы три продукта. Все продукты в виде ферментированного молока, обусловливали снижение количества Н.pylori, однако этот эффект проявлялся существенно быстрее в тех случаях, когда тестируемый продукт содержал штамм LMG Р-17806 по сравнению с обычными йогуртным штаммом и по сравнению со штаммом KLD молочнокислой бактерии L.fermentum соответственно.

Приведенные в таблице 5 значения соответствуют уровню поглощения при 405 нм и являются относительными величинами.

Е. Анализ влияния штамма LMG Р-17806 на иммунологическую защиту
Защитная иммунологическая система находится под контролем серии факторов, выполняющих сигнальную функцию, т.н. цитокинов. Некоторые из них могут быть провоспалительными. Влияние штамма LMG Р-17806 на выработку цитокинов TNF-α (α- фактор некроза опухолей) и IL-6 (интерлейкин-6) сравнивали с влиянием двух других видов, включая йогуртную культуру, L.delbruckei ssp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus. Лейкоциты выделяли из крови человека и добавляли к живым бактериям или бактериям, убитым глутаровым альдегидом, в количестве 10 миллионов лейкоцитов. В качестве контроля использовали липополисахариды (ЛПС) кишечной палочки E.coli. Полученные данные представлены в табл. 6. Полученные результаты показывают, что штамм LMG Р-17806 обладает такими же противовоспалительными свойствами, что и обычная йогуртная культура, использовавшаяся в данном анализе.

F. Анализ резистентности штамма LMG Р-17806 к действию антибиотиков
Пробиотические материалы могут быть использованы в связи с проблемами нарушения баланса кишечной флоры, возникающими в ходе лечебного применения антибиотиков. В то же время важным является то, чтобы пробиотики не обусловливали распространения резистентности к антибиотикам, и это особенно важно в случае одновременного применения пробиотиков и антибиотиков. Резистентность штамма LMG Р-17806 к действию различных антибиотиков была проанализирована именно с этой точки зрения. Чувствительность штамма LMG Р-17806 к различным антибиотикам оценивали путем определения того содержания, при котором наблюдалось снижение роста бактерий на 50%, что измеряли по показателям оптической плотности.

Как было видно, штамм LMG Р-17806 характеризуется резистентностью к ванкомицину и не подавляется даже при концентрации 256 мг/л. Этот штамм проявляет сходный уровень резистентности к действию триметоприма и цефотаксима: характерная для 50%-ного уровня оптическая плотность была отмечена при концентрациях соответственно 12 и 4 мг/л. С другой стороны, штамм LMG P-17806 оказался чувствительным к действию хлорамфеникола, эритромицина, рифампицина и тетрациклина, при концентрации которых даже на уровне 1 мг/л обусловливалось подавление роста бактерий на 50%.

Влияние антибиотиков также было проанализировало в тесте с использованием т.н. "сенси-диска" (Oxoid). В соответствии с полученными данными штамм LMG Р-17806 проявил резистентность к действию азтреонама, цефтаксимида, цефокситина, колистина сульфата, канамицина, полимиксина-В, стрептомицина и ванкомицина.

Штамм LMG Р-17806, в соответствии с полученными результатами, может представлять наибольший интерес с точки зрения использования его одновременно с терапией, базирующейся на применении таких антибиотиков, как ванкомицин, триметоприм, равно как и некоторые цефлоксацины - для всех этих антибиотиков известно проявление побочных эффектов в отношении кишечной флоры и функций кишечника.

Применение штамма LMG Р-17806
Пример 1
Приготовление бактериального концентрата
Замороженный бактериальный концентрат, содержащий 10 миллиардов бактерий штамма LMG Р-17806, приготавливали указанным выше путем, культивируя молочнокислых бактерий в молочной сыворотке с добавлением 1 г дрожжевого экстракта на 1 л при рН 5,5 в течение 14 часов при 36^oС. Бактерии отделяли центрифугированием с непрерывной промывкой. Полученный концентрат замораживали на жидком азоте и хранили до момента использования при -80^oС.

Пример 2
Приготовление ферментированного молочного продукта
Молочный продукт готовили из молока путем гомогенизирования этого молока, обработки нагреванием до +95^oС в течение 5 минут и охлаждения до +37^oС. Полученный молочный продукт заражали 0,01%-ной коммерческой замороженной йогуртной культурой и 0,5%-ным концентратом бактерий LMG P-17806. Культуры оставляли расти в течение 6 часов при данной установленной температуре. Затем молоко подвергали свертыванию и понижали рН до 4,55. Коагулят отделяли и полученный продукт охлаждали до +12^oС, при которой его упаковывали в стандартные пластиковые стаканчики, которые обычно используются для расфасовки йогурта; затем его охлаждали в камере холодильника с температурой +5^oС в течение дня и ночи. Затем величину рН снижали до 4,4. Полученный продукт затем хранили при +8^oС до трех недель.

Содержание бактерий штамма LMG Р-17806 контролировали, как показано в табл. 7: отмечается ограниченный рост штамма LMG Р-17806 в процессе культивирования, а при хранении в течение трех недель выживаемость бактерий LMG Р-17806 при рН<4,4 была очень хорошей.

Полученный продукт характеризовался нормальным внешним видом и отстаиванием сыворотки не более чем на 1% после 14-дневного хранения. Полученный продукт имел отличный вкус, был однородным по консистенции и имел свежий, средний по силе запах. Анализируемый продукт в сравнении с обычным йогуртом получил более высокие оценки независимой дегустационной службы при проведении дегустации в исследовательском институте. Данный продукт подвергали оценке в дегустационной службе, в которой дегустаторы не были поставлены в известность о том, какой продукт они дегустируют: сравнение проводили с соответствующим продуктом, не содержащим бактерий LMG Р-17806. Продукту со штаммом LMG P-17806 было отдано предпочтение 74% дегустаторов: они в среднем выставили оценку 7,6 по 9-балльной шкале, что было существенно выше по сравнению с оценками обычного йогурта. Средние оценки были ненамного более чем на единицу выше тех оценок, которые ранее были даны пробиотической культуре кисломолочной бактерии Lactobacillus acidophilus. Полученные результаты также отличаются от тех, которые были ранее получены в ходе сравнения "чистого" йогурта и смешанных продуктов йогурта и пробиотических молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium longum соответственно. Не удается обнаружить сколько-нибудь существенных различий между "чистым" йогуртом и соответствующим смешанным продуктом в данных сравнительных тестах.

Пример 3
Подходящие добавки штамма LMG Р-17806
Также были проведены эксперименты с целью определения подходящих масштабов добавления штамма LMG P-17806. Молоко обрабатывали и затем добавляли йогуртную культуру в соответствии с описанным выше, в то время как добавление концентрата бактерий штамма LMG Р-17806 варьировалось в диапазоне от 5 до 0,01%. При таком высоком содержании концентрата, как 5%-ное содержание концентрата LMG Р-17806, наблюдался неприятный привкус, который, как предполагается, обусловлен собственными компонентами вносимой культуры. Изменение рН было в пределах нормы, как нормальным был и внешний вид продукта. Содержание бактерий штамма LMG Р-17806 в свежем продукте составляло 504 миллиона на 1 г, и содержание оставалось на этом уровне в течение всего времени хранения. При добавлении 0,01% концентрата LMG Р-17806 полученный продукт по ощущениям не отличается от обычного йогурта, а содержание бактерий LMG Р-17806 уже через неделю хранения было менее 1 миллиона на 1 мл: это является наименьшей величиной, которой может характеризоваться продукт для того, чтобы он мог определяться как продукт, содержащий пробиотический компонент в соответствии с международным законодательством.

Пример 4
Приготовление специального ферментированного продукта
Данный эксперимент был проведен в соответствии с описанным выше, за исключением того, что в молоко также добавляли 0,4 г дрожжевого экстракта в расчете на 1 л. Заражение проводили 0,01% той же йогуртной культурой, что и в предыдущем эксперименте, но добавляли только 0,1% концентрата штамма LMG Р-17806. Инкубацию проводили при +34^oС в течение 8 часов, после чего процесс останавливали и полученный продукт охлаждали, расфасовывали и хранили так же, как это было описано выше в примере 3. В использованных условиях бактерии LMG Р-17806 имели 10-кратный рост и при этом, так же как и в предыдущих экспериментах, характеризовались в ходе хранения хорошей выживаемостью. Полученные результаты представлены ниже в таблице 8.

Полученный продукт характеризовался нормальным внешним видом при 1,5%-ном уровне отстаивания сыворотки после 14-дневного хранения. Полученный продукт характеризовался приятным суховатым вкусом и однородной консистенцией.

Пример 5
Приготовление овощного сока, содержащего штамм LMG P-17806
Овощной сок приготавливали путем смешивания морковного концентрата и концентрата апельсинового сока в равной пропорции таким образом, чтобы рН полученной смеси составил 3,9. Проводили тепловую обработку полученного смешанного напитка и добавляли соответственно 1 и 0,1% концентрата штамма LMG P-17806. Содержание бактерий LMG P-17806 становилось соответственно 100 и 10 миллионов на 1 мл. Напитки хранили при +7^o С в течение 4 недель. Вкус полученного продукта не менялся, и не было выявлено какого-либо негативного влияния хранения или добавления бактерий LMG Р-17806. Однако добавление LMG Р-17806 до содержания на уровне, превышающем 50 миллионов, как предполагается, приводит к подавлению снижения содержания витамина С. В продукте, не содержащем штамма LMG Р-17806, как и в продукте, содержащем 10 миллионов бактерий на 1 мл, содержание витамина С снижалось с 25 мг в 100 г перед началом хранения до 18 мг в 100 г через 4 недели. При добавлении 100 миллионов бактерий LMG Р-17806 содержание витамина С снижалось только до 22 мг в 100 г, т. е. снижение содержания витамина С оказалось менее, чем вдвое выраженным. Выживаемость штамма LMG Р-17806 была хорошей, и содержание бактерий LMG Р-17806 через 4 недели было лишь на 40% меньше, чем в свежем продукте, независимо от добавлявшегося количества.

В другом эксперименте в тот же самый фруктово-овощной напиток добавляли 5% бактерий LMG Р-17806. Был получен неприятный привкус, и бактерии плохо росли в процессе хранения.

Пример 6
Приготовление сухого пищевого порошка
Сухой пищевой порошок приготавливали обычным путем. Концентрат штамма LMG Р-17806 в соответствии с описанным выше лиофилизовали после смешивания с кукурузным крахмалом и хранили после расфасовки в герметичную упаковку при температуре -20^oС. Лиофилизованный препарат содержал 61 миллиард бактерий LMG Р-17806 на 1 г. Полученный порошок высушивали с 0,03% LMG P-17806 и упаковывали в атмосфере азота в герметичную упаковку. Сначала пищевой порошок хранили в течение трех месяцев при +12^oС и затем при комнатной температуре еще в течение четырех месяцев. Содержание бактерий LMG P-17806 представлено в табл. 9. Полученный сухой порошок характеризовался хорошими показателями выживаемости бактерий LMG P-17806, следовательно, возможным является приготовление, например, детского питания, характеризующегося высоким содержанием штамма LMG P-17806.

Пищевой порошок растворяли в 9 частях воды при +50^oС и определяли содержание бактерий LMG P-17806. Это содержание составило 1 миллион клеток LMG P-17806 на 1 мл напитка в том случае, когда использовали порошок 6-месячного хранения. Разведенный ("порошковый") продукт ничем не отличался от обычного продукта. После хранения в течение ночи при комнатной температуре, однако, порошковый продукт, полученный с добавлением LMG Р-17806, характеризовался слабокислым вкусом и рН 5,7.

Во втором эксперименте был исследован эффект добавления 1 и 0,001% соответственно лиофилизованного препарата LMG Р-17806. Его содержание в пищевом порошке после добавления составляло соответственно 570 и 0,8 миллионов на 1 г.

Порошковые препараты хранили соответствующим образом и тестировали после 5-месячного хранения. После растворения в соответствии с описанным выше содержание бактерий в приготовленном порошке составило 800 миллионов для низкого количества добавки менее 10000 на 1 мл. При высоком количестве добавки слабокислый запах появлялся уже после 4 часов хранения порошка при комнатной температуре.

Пример 7
Приготовление высушенного порошка, предназначенного для использования в качестве "лечебной пищи"
Лиофилизованный концентрат LMG Р-17806 смешивали с различными количествами кукурузного крахмала в соотношениях 1:1, 1:9, 1:99 и 1:999 соответственно. Смешанные порошки хранили в небольших пакетах по 1-100 г материала на 1 блок. Материал пакетов непроницаем для кислорода и влаги. Пакеты хранили в морозильнике, холодильнике и при комнатной температуре. Их содержимое затем использовали в качестве добавки к напитку, для чего порошок размешивали в этом напитке перед питьем. Соответствующий уровень выживаемости был таким же, как было выше показано в примере 6. Порошковый материал в пропорции 1:1 также упаковывали в желатиновые капсулы - по 0,4 г в одной капсуле. Содержание бактерий в капсуле составило 10 миллиардов. Капсулы были расфасованы в блистеры таким образом, чтобы обеспечить недоступность кислорода и влаги. Капсулы хранили так же, как было описано выше: были получены соответствующие хорошие параметры выживаемости.

Пример 8
Приготовление и использование бактериальных смесей
Штамм LMG Р-17806 может быть смешан с другими молочнокислыми бактериями без их ингибирования. Как представляется, штамм LMG P-17806 не образует каких-либо веществ, которые бы ингибировали другие молочнокислые бактерии или кокки в тех случаях, когда LMG P-17806 одновременно культивируют с йогуртными культурами, простоквашными культурами лактококков или другими видами молочнокислых бактерий, такими как L.acidophilus, L.fermenturn или L.rhamnosus. Эксперименты со смесями лиофилизованных препаратов, содержащих все три эти бактерии, продемонстрировали неизменные параметры хранения по сравнению с теми вариантами, в которых проводилось смешение с кукурузным крахмалом или с пищевым порошком. После растворения пищевого порошка и хранения в течение 12 часов при температуре тела и 12 часов при комнатной температуре не было отмечено какого-либо негативного влияния бактерий LMG Р-17806 как по признаку общего количества молочнокислых бактерий, так и по признаку содержания любого из видов бактерий.

В эксперименте с получением пробиотической простокваши 0,5% простоквашной культуры и 0,6% лиофилизованного концентрата каждой из бактерий L. acidophilus (штамм NCFB-1748), L.fermentum (штамм KLD) и штамм LMG Р-17806 добавляли к молоку, обработанному обычным образом. Однако добавляли только 0,1% штамма KLD, потому что повышение количества этой добавки приводило к появлению привкуса и ухудшению створаживания. Молоко хранили 19 часов при комнатной температуре. Затем показатель рН продукта устанавливали 4,50. Молоко охлаждали до +10^oС, упаковывали и хранили при +6^oС в течение 14 дней. Полученные результаты видны из приводимой ниже табл. 10.

Восемьдесят здоровых волонтеров употребляли полученные продукты в пищу в связи с поездкой на проводившуюся в Стамбуле (Турция) конференцию. Они были разделены на две группы: одна питалась простоквашей, приготовленной в соответствии с описанным выше с добавлением только штамма LMG Р-17806, в то время как во второй группе в пищу использовалась простокваша, полученная с использованием трех различных пробиотических штаммов. Волонтеры данного эксперимента находились на конференции на протяжении 8 дней. Они начали употреблять анализируемые продукты в пищу за два дня до отъезда и прекратили есть их спустя 4 дня после возвращения домой. Употребление продуктов проводилось в виде легкой закуски трижды в день - по 150 г за 1 раз. За исключением двух персон, остальные волонтеры заявили, что в течение всего периода употребляли простоквашу в соответствии с указанной схемой. При проведении контрольного опроса выяснялись какие-либо случаи пищевого дискомфорта, обусловливаемого желудочными болями, напряженностью, поносом или запором, используя 3-балльную шкалу. Что касается поноса, то имелось отчетливое различие: только у 5% тех, кто питался простоквашей, приготовленной с использованием штамма LMG Р-17806, отмечался мучительный тяжелый понос по крайней мере в два последних дня эксперимента, в то время как частота этого признака составила 22% в группе, которые питались пробиотической простоквашей.

Таким образом, как представляется, смесь нескольких различных молочнокислых бактерий может быть более эффективной по сравнению с использованием единственного штамма бактерий. Это может обусловливаться тем фактом, что употреблявшиеся в пищу молочнокислые бактерии обладают дифференцированными свойствами.

Формула изобретения

1. Штамм Lactobacillus paracasei subsp. paracasei LMG P-17806, применяемый в качестве пробиотика в пищевых продуктах и натуропатических препаратах.

2. Пищевой продукт, облегчающий атонические реакции, и/или корректирующий и нормализующий кишечную флору, и/или снижающий содержание клостридий и повышающий содержание бифидобактерий и колиформных бактерий, характеризующийся тем, что представляет собой композицию, включающую 0,0005-0,5% биомассы штамма Lactobacillus paracasei subsp. paracasei no п.1 в молочном продукте, ферментированном молочном продукте, овощном или фруктовом напитке или их порошковом продукте.

3. Пищевой продукт по п.2, отличающийся тем, что он содержит 5•10⁵-5•10⁹ живых бактерий/г продукта.

4. Пищевой продукт по п.2, отличающийся тем, что он содержит 1•10⁵-1•10⁹ живых бактерий/г продукта.

5. Натуропатический препарат, облегчающий атонические реакции, и/или корректирующий и нормализующий кишечную флору, и/или снижающий содержание клостридий и повышающий содержание бифидобактерий и колиформных бактерий, характеризующийся тем, что представляет собой композицию, включающую 0,1-50,0% биомассы штамма Lactobacillus paracasei subsp. paracasei no п.1 и съедобный инертный наполнитель.

6. Препарат по п.6, отличающийся тем, что он содержит 1•10⁹-1•10¹¹ живых бактерий/г препарата.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10