Способ получения моноспецифических поликлональных антисывороток к антигенно родственным белкам

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения моноспецифических поликлональных антисывороток к близкородственным белкам при диагностике ряда заболеваний. Способ предусматривает иммунизацию животного путем однократного многоточечного введения в область спины внутрикожно иммунохимически чистого белка-антигена в количестве 100-500 мкг на животное, в присутствии трех объемов полного адъюванта Фрейнда относительно объема раствора белка-антигена, забор крови животного через 2 месяца и в течение полугода после иммунизации, получение иммунной сыворотки и избирательную адсорбцию ее другими антигенно родственными белками. Техническим результатом изобретения является разработка упрощенного, относительно дешевого и технологичного способа получения моноспецифических поликлональных антисывороток к антигенно родственным белкам.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам получения моноспецифических антисывороток и антител к родственным белкам, имеющим общие антигенные детерминанты, например подклассы иммуноглобулинов G.

Наиболее эффективным по специфичности из современных способов получения моноспецифических поликлональных антисывороток к антигенно родственным белкам является способ создания толерантности к общим антигенным детерминантам белков подклассов IgG (IgGI, IgG2, IgG3 и IgG4) с последующей иммунизацией целевым белком одного из подклассов [1]. Этот способ предусматривает получение моноспецифических антисывороток путем проведения пяти процедур для создания толерантности и трех процедур для иммунизации. Для этого используются обязательно новорожденные животные (от 6 до 20 ч от момента рождения). Толерантность создается введением высоких доз иммуногена, содержащего общие детерминанты для этих родственных белков, а иммунизация проводится низкими дозами целевого антигена.

Однако даже при этом способе не удается избежать необходимости последующей адсорбции в полученных антисыворотках антител к общим эпитопам белков. Кроме того, этот метод трудоемок, дорог и поэтому не имеет промышленных перспектив.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего получать моноспецифические поликлональные антисыворотки к близкородственным белкам простым, более дешевым и технологически пригодным способом. Такие антисыворотки могут быть использованы для дифференциального определения родственных белков в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах с помощью иммуноферментных тест-систем или радиальной иммунодиффузии.

Поставленная задача достигается путем разработки способа, который предусматривает иммунизацию животного путем однократного многоточечного введения в область спины внутрикожно иммунохимически чистого белка-антигена в количестве 100-500 мкг на животное, в присутствии трех объемов полного адъюванта Фрейнда относительно объема раствора белка-антигена, забор крови животного через 2 месяца и в течение полугода после иммунизации, получение иммунной сыворотки и избирательную адсорбцию ее другими антигенно родственными белками.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного, относительно дешевого и технологичного способа получения моноспецифических поликлональных антисывороток к антигенно родственным белкам, поскольку позволяет получить иммунный ответ ко всем и слабым, и сильным антигенным детерминантам. Для того чтобы родственные белки можно было различать между собой, антисыворотки к ним должны содержать антитела к наибольшему числу различающихся антигенных детерминант. Родственные белки могут различаться как слабыми, так и сильными антигенами, поэтому для решения задачи раздельного определения этих белков важно иметь антисыворотки с таким набором антител. Такие антисыворотки могут быть использованы для дифференциального определения родственных белков в сыворотке крови человека при диагностика ряда заболеваний и в биологических препаратах с помощью иммуноферментных тест-систем или радиальной иммунодиффузии.

Пример. Получение моноспецифических поликлональных антисывороток к подклассам IgG человека. 100-500 мкг иммунохимически чистого IgG определенного подкласса, растворенного в 0,5 мл физиологического раствора, смешивают с 1,5 мл полного адъюванта Фрейнда и вводят кролику (или козе) внутрикожно в 10 точек спины. Через 2 месяца у животных берут кровь из вены для получения иммунной сыворотки. Интенсивная линия иммунопреципитации в γ-зоне для антител к IgG, двойные линии (для антител к IgG3) или наличие "шпоры" в β₂-зоне (для антител к IgGI, IgG2, IgG4) с нормальной сывороткой человека при иммуноэлектрофорезе свидетельствуют о наличии в иммунных сыворотках антител к подклассам IgG. Иммуннизированные животные используются в качестве продуцентов иммунной сыворотки в течение 6 месяцев. Дополнительная адсорбция иммунных сывороток белками иммуноглобулинов G других подклассов с учетом их антигенного родства приводит к получению антисыворотки, специфичной к определенному подклассу. Такая антисыворотка при радиальной иммунодиффузии в геле в присутствии 5% полиэтиленгликоля с мол. массой 6000 Да выявляет IgG соответствующего подкласса в нормальной сыворотке и в сыворотках больных множественной миеломой и не дает преципитации с миеломными белками IgG других подклассов в концентрации 0,1 мг/мл.

ЛИТЕРАТУРА 1. Michaelsen Т.Е., Haug E. Human IgG subclass-specific rabbit antisera suitable for immunoprecipitation in gel, ELISA and multiplayer haemagglutination techniques. Journal of Immunological Methods. 1985. V.84. P.203-220.

Формула изобретения

Способ получения моноспецифических поликлональных антисывороток к антигенно родственным белкам, предусматривающий иммунизацию животного путем однократного многоточечного введения в область спины внутрикожно иммунохимически чистого белка-антигена в количестве 100-500 мкг на животное в присутствии трех объемов полного адъюванта Фрейнда относительно объема раствора белка-антигена, забор крови животного через 2 месяца и в течение полугода после иммунизации, получение иммунной сыворотки и избирательную адсорбцию ее другими антигенно родственными белками.