Вакцина против вирусных инфекций
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к медицине, иммунологии. Вакцина представляет собой частицы 25-30 нм в диаметре, содержащие в центре полинуклеотидный комплекс (рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую гены инфекционного агента или двуспиральную РНК-стимулятор неспецифической резистентности организма), а на поверхности - гибридные белки, содержащие эпитопы (полипептиды) инфекционного агента и фермент (например, глутатион-S-трансферазу или -галактозидазу). Связь между полинуклеотидным комплексом и гибридными белками осуществляется посредством коньюгата: спермидин (для связи коньюгата с полинуклеотидным комплексом) - полиглюкин-субстрат для фермента (например, глутатион или галактопиранозид) для аффинной сорбции гибридных белков на конструкцию. Вакцина обеспечивает более высокий титр антител и более длительный иммунный ответ при иммунизации. 6 ил.
Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, иммунологии; оно может быть использовано в фармацевтической промышленности и молекулярной фармакологии и представляет собой способ доставки и представления иммуногенов иммунной системе организма.
Достижения в области генетики, молекулярной биологии и биотехнологии определили современную стратегию разработки вакцин. На сегодняшний день одним из перспективных и наиболее разрабатываемым направлением является создание генно-инженерных вакцин при помощи наработки антигенов микробиологическим синтезом с последующей их очисткой до гомогенного состояния. Оно предпочтительнее, чем усовершенствование вакцин на основе живых аттенюированных или инактивированных возбудителей. Это обусловлено тем, что присутствие части белков инфекционного агента в вакцине нежелательно [1, 2]. Так, например, известно, что среди белков вируса HIV есть и В-клеточные эпитопы, стимулирующие продукцию усиливающих инфекционность антител, и Т-клеточные эпитопы, стимулирующие супрессирующие клетки, и области, перекрестно реагирующие с нормальными белками клеток, и иммуносупрессивные районы. Поэтому для создания эффективных и безопасных вакцин нового поколения перспективно создавать синтетические пептидные вакцины, которые, как ожидается, будут свободны от многих недостатков, присущих живым и инактивированным вакцинам [3, 4]. Наиболее перспективными могут быть вакцины, содержащие несколько Т и В-клеточных эпитопов инфекционного агента. К недостаткам генно-инженерных вакцин следует отнести сравнительно небольшие молекулярные массы синтезируемых полипептидов-иммуногенов, от тысячи до нескольких десятков тысяч дальтон. Поэтому при вакцинации используют различные адъюванты, что не всегда желательно и вызывает побочные эффекты. Наиболее сильным из адъювантов является адъювант Фрейнда, который для людей использовать запрещено. Известны способы экспонирования эпитопов инфекционного агента на поверхности капсидных структур HBcAg, синтезированных в E.coli [5-9] и дрожжах S. cerevisiae [10] и получение на них иммунного ответа. HBcAg представляет собой нуклеокапсид вируса гепатита В и состоит из идентичных белковых субъединиц размером 21 кД, имеет диаметр около 25-27 нм [5, 6] или 30-34 нм [9] по данным разных авторов и является иммуногеном. Для реализации иммунного ответа на встроенные эпитопы необходимо выполнение трех основных условий [5, 6] : встроенная последовательность а) не нарушает капсидообразующих свойств химеры, б) экспонируется на ее наружной поверхности, в) сохраняет в составе химеры свою нативную конформацию. Наиболее перспективным по устойчивости к внедрению чужеродных последовательностей является район 144-й аминокислоты гена. Внедрение чужеродных последовательностей длиной 40-50 аминокислот в этом районе не приводит к нарушению процесса самосборки капсид, которые сохраняют морфологию немутантного HBcAg и экспонируют при этом на своей поверхности внедренные последовательности с сохранением их антигенной и иммуногенной активности [5, 6]. К недостаткам такой конструкции следует отнести ограниченность по размерам встраиваемых чужеродных эпитопов (порядка 40-50, до 100 аминокислот [5, 6]). К тому же, не все встроенные эпитопы проявляли свою антигенность в составе гибридных частиц [9, 11]. Например, было обнаружено, что эпитоп вируса иммунодефицита обезьян, встроенный в С-конец после 183-й аминокислоты, недоступен для антител и иммунологически не активен [11]. Технической задачей изобретения является создание высокоэффективной молекулярной конструкции вирусоподобного вида (вакцины) как средства доставки иммуногенов. Для вакцинации людей перспективным представляется создание такой конструкции вакцины, которая имела бы и антигенные свойства, и стимулятор иммунного ответа, и, в то же время имела молекулярную массу, сравнимую с молекулярными массами вирусов, т.е. являлась бы полным антигеном. В качестве стимуляторов иммунного ответа применяются полисахариды, липидные (в том числе липосомы) и полинуклеотидные комплексы (двуспиральная РНК, фрагментированная ДНК) и др. Поставленная задача решается путем создания вакцины нового поколения - молекулярной конструкции, которая представляет собой вирусоподобные частицы, в центре которых находится полинуклеотидный комплекс (рекомбинантная плазмидная ДНК или двуспиральная РНК), а на поверхности - гибридные белки, содержащие эпитопы инфекционного агента (фиг.1). Рекомбинантная плазмидная ДНК может содержать различные гены инфекционного агента, тем самым превращая конструкцию также в "ДНК-вакцину". Сущность изобретения заключается в следующем. Вакцина (молекулярная конструкция вирусоподобного вида) представляет собой частицы (фиг. 1) 25-30 нм в диаметре, содержащие в центре полинуклеотидный комплекс (рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую гены инфекционного агента или двуспиральную РНК - стимулятор неспецифической резистентности организма), а на поверхности - гибридные белки, содержащие эпитопы (полипептиды) инфекционного агента и фермент (например глутатион-S-трансферазу или -галактозидазу). Связь между полинуклеотидным комплексом и гибридными белками осуществляется посредством конъюгата: спермидин (для связи конъюгата с полинуклеотидным комплексом) - полиглюкин - субстрат для фермента (например, глутатион или галактопиранозид) для аффинной сорбции гибридных белков на конструкцию. При иммунизации созданной конструкцией титр антител выше и сохраняется более длительное время по сравнению с таковым при иммунизации исходным белком-иммуногеном. Для сборки молекулярной конструкции получают рекомбинантную плазмидную ДНК, выделенную щелочным способом [12] , и содержащую гены инфекционного агента или двуспиральную РНК, выделенную из дрожжей, например из штамма Saccharomyces cerevisiae M437 Y116 [13], используемую как основной компонент лекарственного препарата для стимуляции неспецифической резистентности организма "Ридостин" [14, 15]. Полинуклеотидный комплекс покрывают слоем конъюгата (фиг.1): - полиглюкин с молекулярной массой около 60000 Д активируют периодатом натрия, который затем удаляют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 в калий-фосфатном буфере; - к активированному полиглюкину добавляют спермидин и субстрат для фермента гибридного белка, например глутатион или аминофенилгалактопиранозид; - после инкубации несвязавшиеся компоненты удаляют гель-фильтрацией на сефадексе G-50 в буфере: 0,1 М Трис-HCl, рН 8,3; - полученный конъюгат в избытке добавляют к полинуклеотидному комплексу и после инкубации освобождаются от избытка конъюгата гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-6B в физиологическом растворе. Далее к полученному комплексу добавляют гибридные белки, содержащие эпитопы инфекционного агента и фермент, например глутатион-S-трансферазу или -галактозидазу, и после инкубации полученную молекулярную конструкцию отделяют гель-фильтрацией на сефарозе CL-6B, используя для элюции физиологический раствор. Гибридные белки получают по стандартной процедуре клонирования генов в одной рамке считывания с маркерными ферментами (глутатион-S-трансферазой, -галактозидазой и т.д.) в разработанных или коммерческих векторах [16, 17]. Выделение и очистку белков проводят по разработанной методике или по рекомендациям фирм. Процесс получения конструкции представлен на фиг.2. Полученную конструкцию используют для иммунизации. Титр нарабатываемых антител, силу и длительность иммунного ответа определяют по стандартным методикам. Новыми, по сравнению с известными иммуногенными конструкциями, признаками являются: использование для иммунизации молекулярной конструкции вирусоподобного вида, содержащей в центре полинуклеотидный комплекс (рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую гены инфекционного агента или двуспиральную РНК - стимулятор неспецифической резистентности организма), а на поверхности - гибридные белки, содержащие эпитопы (полипептиды) инфекционного агента и глутатион-S-трансферазу (или -галактозидазу). Связь между полинуклеотидным комплексом и гибридными белками осуществляется посредством полианиона - конъюгата: спермидин (для связи конъюгата с полинуклеотидным комплексом) - полиглюкин - глутатион (или галактопиранозид) (для аффинной сорбции гибридных белков на конструкцию). Именно эта совокупность признаков обеспечивает более высокий титр антител и более длительный иммунный ответ при иммунизации созданной молекулярной конструкцией по сравнению с аналогичными при иммунизации просто исходным белком-антигеном. Молекулярная конструкция позволяет экспонировать на поверхности частиц эпитопы любых инфекционных агентов продолжительностью от десятков до тысяч аминокислот (в аналогах - до 50-100 аминокислот) и создавать поливалентные вакцины. Перечень графических материалов: Фиг.1. Молекулярная конструкция вирусоподобного вида: 1 - плазмидная ДНК, 2 - конъюгат: спермидин-полиглюкин-глутатион, 3 - гибридный белок глутатион-S-трансфераза - TBI (GST-TBI). Фиг.2. Гель-фильтрация на колонке с сефарозой CL-6B: 1 - плазмидная ДНК, 2 - то же, после инкубации с конъюгатом: спермидин-полиглюкин-глутатион, 3 - после инкубации с гибридным белком глутатион-S-трансфераза - TBI. Фиг. 3. Схема конструирования рекомбинантной плазмиды: bla - ген -лактамазы, кодирующий устойчивость к ампициллину (Арr); gst - ген, кодирующий глутатион-S-трансферазу; tbi - ген, кодирующий белок TBI. Фиг.4. Электронограмма негативно окрашенного препарата микрочастиц вакцины. Увеличение 70000. Фиг. 5. Динамика изменения титра антител к белку TBI в сыворотках животных, иммунизированных белком TBI-GST (черные столбцы); вирусоподобными частицами с белком TBI-GST (белые столбцы). Контрольные животные (серые столбцы). В каждом опыте использовали сыворотку от пяти животных. Фиг. 6. Электрофореграмма образцов вакцины в 10%-ном полиакриламидном геле: а - окраска кумасси R-250: 1 - конструкция с белком GST - TBI, 2 - белок gp41--гaлaктoзидaзa, 3 - конструкция с белками GST - TBI и gp41--галактозидаза; б - иммуноблоттинг с антителами положительной по HIV-I сывороткой человека. М - маркеры мол.масс. Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. Пример 1. Создание плазмид, несущих гены гибридных белков. Целью создания плазмиды pGEX-2T-TBI было получение гибридного белка глутатион-S-трансфераза-ТВI (GST-TBI), способного одной своей половиной молекулы аффинно соединяться с конъюгатом глутатион-полисахарид, а второй половиной (TBI) - экспонировать эпитопы HIV-I на поверхности конструкции [18] . При создании плазмиды pGEX-2T-TBI исходную плазмиду pUC19/TBI [18] гидролизуют рестриктазами Pst I и EcoR I (фиг.3), выделяют фрагмент длиной 445 п. о., который затем лигируют с коммерческим вектором фирмы "Pharmacia" pGEX-2Т [16] , обработанным рестриктазами EcoR I и Sma I. Правильность встройки определяют секвенированием ДНК в районе соединения генов, кодирующих составные гибридного белка. Рамка считывания гена при этом не нарушается. В созданной плазмиде сайты узнавания для рестриктаз Pst I и Sma I отсутствуют. Полученной плазмидой трансформируют компетентные клетки реципиентного штамма E. coli SG 200-50 и суспензию высевают на агаризованную среду, содержащую ампициллин (100 мкг/мл). Для наработки плазмиды культуру клеток выращивают в L-бульоне до оптической плотности Д5501,5-2,0 о.е., добавляют хлорамфеникол и инкубируют в течение 3-5 ч при 32oС. Плазмидную ДНК выделяют щелочным методом с последующей очисткой хроматографией на гидроксилапатите. Плазмида pGP41-16 [19] , содержащая ген, кодирующий гибридный белок pGP41-16 - -галактозидаза создана по традиционной технологии и любезно предоставлена авторами. Пример 2. Выделение и очистка гибридных белков. Для наработки биомассы рекомбинантных клеток выросшие на селективной (Ар) среде клоны вносят в 100 мл L-бульона; подращивают до оптической плотности Д5501,0 о.е., добавляют ампициллин до конечной концентрации 500 мкг/мл и инкубируют в течение 2 ч для лизиса безплазмидных клеток. После этого засевают 1,6 л L-бульона (8 колб по 200 мл). Индукцию биосинтеза целевого белка проводят добавлением в среду изопропилтиогалактопиранозида до конечной концентрации 0,1 мМ. Гибридный белок GST-TBI накапливается в клетках в нерастворимой форме, в тельцах включения. Очистку белка GST-TBI проводят по методу, разработанному для искусственного белка TBI [20]. Для этого суспензию клеток обрабатывют ультразвуком и отмывают тельца включения. Гибридный белок растворяют в 6 М растворе мочевины в течение 2 ч, осадок удаляют центрифугированием, и затем проводят ренатурацию белка, последовательно инкубируя раствор при концентрациях мочевины 3 М и 1,5 М, после этого проводят диализ против буфера, не содержащего денатурирующего агента. При таком режиме ренатурации выпадения целевого белка в осадок не наблюдается. Для доочистки используют аффинную хроматографию на глутатион-сефарозе. Очистку гибридного белка gp 41(607-620)--галактозидаза проводят согласно рекомендациям авторов [19]. Пример 3. Создание вирусоподобной конструкции (вакцины). А) В вирусах молекулы ДНК и РНК не связаны с белками ковалентными связями. Подобную структуру создавали и мы. В центре конструкции вакцины находится интактный полинуклеотидный комплекс, а на поверхности - гибридный белок, содержащий антигены HIV-I. Для связи используют конъюгат полиглюкина со спермидином и глутатионом. Положительно заряженный спермидин обеспечивает связывание конъюгата с полинуклеотидным комплексом, глутатион - аффинно сорбирует гибридный белок TBI-GST. Схематично вид конструкции представлен на фиг.1. В качестве "центрального ядра" конструкции используют плазмиду pGEX-2T-TBI (мол. массой около 3250000 Д), содержащую ген, кодирующий эпитопы HIV-I. Для получения полисахаридной вставки 50 мг (0,8 мкМ) полиглюкина (60000 Д) обрабатывают 0,5 М раствором периодата натрия в течение 20-30 мин и затем проводят гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-50 в 20 мМ фосфатном буфере (рН 7,6). После этого в раствор активированного полиглюкина вносят 5 мг глутатиона (16 мкМ) и 2,5 мг спермидина (16 мкМ). Смесь инкубируют в течение ночи, затем добавляют боргидрид натрия, перемешивают еще 2 ч и непрореагировавшие компоненты удаляют гель-фильтрацией на сефадексе G-50, используя 100 мМ Трис-НСl (рН 8,3). Полученный таким образом препарат содежит 3,3 мг белка. Так как исходные компоненты (глутатион и спермидин) вносятся в эквимолярном соотношении, то можно предположить, что и полученный конъюгат содержит их одинаковые количества, т.е. на 0,8 мкМ полиглюкина по 7,2 мкМ глутатиона и спермидина (соотношение около 1:9:9). Для сборки конструкции к раствору, содержащему 400 мкг нуклеотидного материала (около 0,12 нМ) в физиологическом растворе добавляют полисахаридную вставку (0,1 мг по белку), смесь инкубируют 2 ч при 4oС и образовавшийся комплекс отделяют гель-фильтрацией на сефарозе CL-6B. После этого добавляют гибридный белок (1,5 мг) в физ. растворе и также инкубируют в течение 2 ч. Полученную конструкцию отделяют от несвязавшихся компонентов гель-фильтрацией на сефарозе CL-6B (фиг.2). Исследование физических свойств молекулярной конструкции. При исследовании комплекса [нуклеотидный материал - полисахаридная вставка] было обнаружено, что на 0,12 нМ плазмидной ДНК содержалось 0,025 мг белка, т.е. на 1 молекулу - по 540 молекул глутатиона и спермидина или соответственно - по 60 молекул полисахаридной вставки. Конечная конструкция содержала 0,96 мг белка (около 20 нМ гибридного белка при его мол. массе около 45000 Д). Таким образом конечная конструкция имела соотношение: на 1 молекулу нуклеотидного материала - 60 молекул полисахаридной вставки - 170 молекул гибридного белка. Ее мол. масса около: 3250000+6060000+17045000= 14500000 Д и при гель-хроматографии на колонке с сефарозой CL-6B она элюируется в свободном объеме (фиг.2). Из теоретических расчетов следует, что шаровидная молекула нуклеиновой кислоты с молекулярной массой около 3250 кДа может сорбировать около 55 молекул полиглюкина. Комплекс [нуклеотидный материал - полисахаридная вставка] при молекулярной массе около 3250 кДа+5560 кДа=6850 кДа может сорбировать примерно 120 шарообразных молекул гибридного белка (мол. массой 45 кДа). Так как в эксперименте это соотношение составило 1:60:170, то, вероятно, можно объяснить некоторой некомпактностью полисахаридного конъюгата и дипольной пространственной структурой гибридного белка. При дипольной пространственной структуре на поверхности конструкции находится только белок TBI (антиген). Для проверки полноты упаковки нуклеотидного материала в собранной конструкции проводили ее обработку смесью ДНКазы и РНКазы. Опыт показал, что если для исходной плазмидной ДНК полная деградация наблюдалась уже через 30 мин инкубации, то в собранной конструкции нуклеотидный материал сохранялся интактным в течение суток. По данным электронной микроскопии препарат молекулярной конструкции содержал шарообразные частицы, имеющие в основном диаметр от 10 до 25 им (фиг. 4). Встречались также более крупные частицы, диаметр которых достигал 50-100 нм. Возможно, это обусловлено тем, что полисахаридная вставка содержит на поверхности не одну молекулу спермидина, а девять, и происходит объединение ряда частиц. Тем не менее, размер полученной конструкции сравним с размером полиовируса и вируса полиомы, и приближается к размеру ВИЧ. Б) Схожие результаты были получены при создании молекулярной конструкции, содержащей в качестве центрального ядра двуспиральную РНК из дрожжей штамма Saccharomyces cerevisiae M437 Y116. В) При создании конструкции вакцины, содержащей два гибридных белка: GST-TBI и gp 41(607-620)--галактозидаза, на стадии получения полисахаридной вставки к активированному полиглюкину добавляют спермидин, а вместо глутатиона - аминофенилгалактопиранозид. И затем при сборке в раствор с плазмидной ДНК вносят на девять частей конъюгата [полиглюкин-спермидин-глутатион] одну часть конъюгата [полиглюкин-спермидин-галактопиранозид]. Затем в соответствующих отношениях вносят и гибридные белки. Конструкция проявляет суммарные антигенные свойства. Следует отметить, что искусственный белок TBI не имеет в своем составе последовательности gp 41(607-620) и сочетание обоих белков в конструкции вакцины должно увеличивать ее иммуногенные свойства. Пример 4. Биологические испытания молекулярной конструкции. Для иммунизации были использованы мыши линии BALB/c весом 18-20 грамм. Животные содержались на стандартном рационе. Все манипуляции с животными в эксперименте проводили с применением седативных средств в соответствии с ветеринарным законодательством. Иммунизация. С целью изучения иммунного ответа на искусственные вирусоподобные частицы, экспонирующие белок TBI, была проведена иммунизация мышей линии BALB/c. Животным вводили внутримышечно трехкратно с интервалом через две недели по 45 мкг (по белку) собранной конструкции. В качестве положительного контроля использовали очищенный белок TBI-GST (80 мкг на мышь). Через каждые две недели проводили взятие крови и приготовление сыворотки для определения титра антител к белку TBI. Для определения титра антител к эпитопам вируса ВИЧ-1 (белку TBI) использовали иммуноферментный анализ (ИФА). Антиген в конечной концентрации 5 мкг/мл в объеме 100 мкл сорбировали в течение ночи в полистироловых планшетах. Для титрования использовали последовательные трехкратные разведения сывороток, начиная с 1:15. Связавшиеся специфические антитела выявляли с помощью конъюгата антител кролика против IgG мыши с пероксидазой хрена ("Sigma"). Накопление антител в сыворотке мышей, иммунизированных чистым белком TBI и частицами, представлено на фиг.5. Как видно из графика, вирусоподобные частицы индуцируют более высокий титр антител по сравнению с титром, индуцируемым чистым белком TBI-GST, несмотря на то что количество вводимого животным белка TBI-GST в составе частиц было в два раза меньше. Две группы мышей отличаются также и по динамике изменения титров сыворотки. Группы мышей, иммунизированных TBI-GST и вирусоподобными частицами, отличаются и по динамике изменения титров сыворотки. Через неделю после последней иммунизации титр сыворотки животных, иммунизированных TBI-GST, достигал значения 1,8107, но через три недели резко снижается до 1105 (фиг.5). У мышей, иммунизированных вирусоподобными частицами, через неделю после последней иммунизации обратный титр достигает 0,9107 и практически не изменяется через три недели. Таким образом, вирусоподобные частицы вызывают пролонгацию иммунного ответа, выступая в качестве своеобразного депо антигенов инфекционного агента. По-видимому, белок TBI в составе вирусоподобных частиц в организме животного более стабилен и меньше подвержен действию протеаз. При постановке иммуноферментного анализа осуществляли перенос белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр. Иммуноблот вели с сывороткой крови человека, содержащей антитела к белкам ВИЧ-1. Иммунные комплексы выявляли с помощью конъюгата белка А с пероксидазой. Как видно из фиг.6, первая конструкция вакцины содержит белок GST-TBI, вторая - оба белка. Обе конструкции проявляют антигенные свойства. Таким образом, использование предлагаемой молекулярной конструкции по сравнению с аналогами позволяет:- экспонировать на поверхности молекулярной конструкции любые эпитопы инфекционных агентов продолжительностью от десятков до тысяч аминокислот;
- использовать гены инфекционных агентов в составе рекомбинантных плазмидных ДНК ("центральное ядро" частиц) в качестве ДНК-вакцины;
- использовать двуспиральную РНК в молекулярной конструкции ("центральное ядро" частиц) в качестве неспецифического стимулятора иммунного ответа;
- используемый для получения конъюгата полиглюкин также является стимулятором иммунного ответа;
- сравнительно большие размеры частиц молекулярной конструкции (около 25 нм) позволяют ее использовать для иммунизации без адъювантов как полноценные антигены. Литература
1. Bolognesi D.P. //Mol.Biol.Med. 1990. V.7. Р.1-15. 2. Ada G.L. //Nature. 1989. V.339. Р.331-332. 3. Steward M.W., Howard C.R. // Med. Lab. Sci. 1985. V.42. P.376-387. 4. Rowlands D.J. // Biochem.Soc.Trans. 1989. V.17. P.945-947. 5. Борисова Г.П., Берзинь И.Г., Осе В.П. и др. Кор-антиген вируса гепатита в качестве носителя чужеродных антигенных детерминант. // "Новые направления биотехнологии". Тез. докладов. - Пущино. - 1990. - С. 61. 6. Борисова Г.П., Берзинь И.Г., Цибиногин В.В. и др. // Докл. АН СССР. - 1990. - Т. 312. - С. 751-754. 7. Филатов Ф.П. Конструирование герпесвирусных векторов, экспрессирующих рекомбинантные гены на основе HBcAg. //"Новые направления биотехнологии". Тез. докладов. - Пущино. - 1990. - С. 70. 8. Цибиногин В.В., Лосева В.Я., Борисова Г.П. Иммунологические свойства HBcAg, содержащего чужеродные антигенные детерминанты. //"Новые направления биотехнологии". Тез. докладов. - Пущино. - 1990. - С. 71. 9. Патент РФ 2121504, кл. С 12 N 15/51, опубл. 1998. 10. Татьков С. И., Кувшинов В.Н., Комарских М.Е. и др. Конструирование вакцины нового поколения против вируса гепатита В. //"Новые направления биотехнологии". Тез. докладов. - Пущино. - 1990. - С. 68. 11. Yon J., Corcoran Т., Kent К. et al. //J.Gen.Virol. - 1992. - V.73. - P. 2569-2575. 12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Молекулярное клонирование. - М. : Мир, 1984. - 479 с. 13. Дужак А.Б., Лобова Н.Н., Подгорный В.Ф. и др. II Антибиотики и мед. биотехнология. - 1985. - 1. - С. 19-21. 14. Патент РФ 2083221, кл. А 61 К 38/20, опубл. 1997. 15. ВФС 42-2457-94. Ридостин для инъекций. 16. Pharmacia Biotech "BioDirectory". - 1996. 17. Каталог фирмы "Promega". Promega protocols and applications guide. - 1997. 18. Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P. et al.//Protein Enginiring. - 1995. - V.8. - N.2. - P. 167-173. 19. Белявская В.А., Закабунин А.И., Долгова И.Н. и др.//Молекул. генет. микробиол. и вирусол. - 1994. - 6. - С.12-16. 20. Лебедев Л.Р., Ерошкин A.M., Гилева И.П. //Биотехнология. - 1997. - 7-8. - С. 38-42.
Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (RU)
Адрес для переписки:
630559, Новосибирская обл., Новосибирский р-н., р.п. Кольцово, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Дата публикации: 20.03.2012