Способ получения регенерантных растений в культуре пыльников проса (panicum miliaceum l.)

 

Изобретение предназначено для использования в области биотехнологии. Способ включает формирование культуры эмбриогенных каллусов, стимулирование регенерационного процесса и культивирование регенерирующих каллусных тканей in vitro в течение длительного периода времени с последовательным выделением корнесобственных регенерантов в нестерильные условия. Для формирования эмбриогенных каллусов используют среду N₆, дополнительно содержащую 2 мг/л 2,4 Д, 500 мг/л L-глутамина, 500 мг/л мио-инозитола, 0,1 мг/л 6-БАП. Для стимулирования регенерационного процесса используют среду N₆, дополнительно содержащую 4 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л α-НУК. При этом длительное культивирование регенерирующих каллусных тканей проводят на среде MS без регуляторов роста и дополнительно содержащей витамины среды В5. Изобретение позволяет получать корнесобственные растения в течение длительного периода времени, исчисляемого годами. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности получению регенерантных растений проса в культуре пыльников in vitro и может быть использовано в генетике, физиологии и селекции.

Для получения генерантных растений семейства злаковых (Gramineae) в культуре пыльников широкое применение нашла среда N₆ [1]. Она характеризуется высокой каллусогенной активностью. Как правило, используют улучшенные варианты этой среды [2, 3]. При этом варианты для каллусогенеза создаются на основе среды N₆, а основой регенерационных сред является среда MS [4].

В культуре пыльников проса также получены регенерантные растения [5]. Для этого использовали культуральные среды, основанные на протоколах сред MS и В5 [6]. Формирование эмбриогенных тканей наблюдалось на среде, дополненной 2 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), 200-500 мг/л L-глутамина или L-глутаминовой кислоты, содержащей 500 мг/л мио-инозитола. Стимулирование регенерационного процесса происходило на среде, содержащей 10 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) и 0,5 мг/л α-НУК (α-нафтилуксусная кислота). Длительное культивирование непрерывно регенерирующих каллусных тканей с последовательным выделением корнесобственных регенерантных растений имело место на среде без регуляторов роста. Слабым местом такого метода получения регенерантов является невысокая частота формирования эмбриогенных каллусных тканей (меньше 1%), плохая повторяемость результата, а также активная пролиферация клеток соматических тканей пыльника.

Вследствие того, что среда N₆ показала хорошие результаты в стимулировании каллусогенеза у ряда злаковых культур, а также с целью более эффективного получения регенерантных растений в культуре пыльников проса разработаны ее улучшенные варианты. Для получения эмбриогенных каллусных тканей разработан вариант среды N₆ - среда N1. Она содержит соли, витамины среды N₆, L-глутамин (500 мг/л) и мио-инозитол (500 мг/л), регуляторы роста: 2,4-Д (2 мг/л) и 6-БАП (0,1 мг/л). Характерной особенностью среды N1 является более высокая эффективность формирования эмбриогенных каллусных тканей (до 4%). Стоит отметить, что после переноса эмбриогенных каллусных тканей со среды N1 на регенерационную среду с солями MS и витаминами В5 регенерационный процесс отличается малой эффективностью. Вследствие этого стимулирование регенерационного процесса проводят на среде RN1, которая основана на среде N1, отличается от нее регуляторами роста и содержит 4 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л α-НУК. Затем регенерирующие каллусные ткани переносят на оригинальную среду МС, созданную на основе среды MS, с витаминами В5 и не содержащую регуляторов роста. Сочетание пролиферативного и регенерационного процессов в условиях этой среды позволяет получать корнесобственные растения в течение длительного, исчисляемого годами, периода времени при периодическом переносе каллусных тканей на свежие среды.

Таким образом, эмбриогенные каллусные ткани, полученные на среде с повышенной результативностью N1, способны к эффективной регенерации после помещения на среду RN1. При этом N1 и RN1 являются улучшенными вариантами среды N₆. Длительное культивирование регенерирующих каллусных тканей происходит в условиях среды МС с другой основой: солями MS и витаминами В5.

Пример. В эксперименте использовали пыльники регенерантов R₁ клона 2085/26, полученного в культуре пыльников гетерозиготного по гену формы метелки гибрида F₃ Регенерант 20N10 (сомаклональный вариант сорта Орловское 92) х Соргообразный карлик 2010. В культуру in vitro были введены также пыльники регенерантов R₀ клона 34К3, инициированного в культуре пыльников гибрида F₁ Могарообразное 2083 35 х Развесистое 1970. В качестве экспериментального материала использовали пыльники регенерантов R₁ клона 159, полученного в культуре незрелых семяпочек, образованных с использованием принудительного опыления цветков растений сорта Ильиновское смесью пыльцы кукурузы {Zea mays L.) и полиплоидного проса (Полиплоид 2000).

Пыльники брали с метелок, предварительно срезанных и выдержанных при низкой положительной температуре (+4^oС) в течение 1-5 суток. Метелки срезали непосредственно перед их выходом из влагалища флагового листа. Контроля стадии развития пыльцевых зерен при посадке пыльников не проводили.

Для получения эмбриогенных каллусных тканей использовали среду N1. Стимулирование регенерационного процесса происходило на среде RN1. Субкультивирование регенерирующих каллусных тканей имело место в условиях среды МС.

Как правило, на способность пыльников к каллусогенезу влияет интегрированный набор факторов. При этом условия произрастания растений, а также сроки изолирования метелок могут иметь решающее значение. Поэтому пыльники, взятые не со всех, а только с отдельных метелок, оказались способными к продуцированию эмбриогенных каллусных тканей. Например, на среду N1 помещали пыльники 17 метелок (табл. 1). Формировали каллусы лишь пыльники, взятые с 5 метелок. Доля эффективных метелок составила 29,4%. Число пыльников с эффективных метелок составило 37,9% от их общего количества. Среднее число полученных эмбриогенных каллусов сильно зависело от варианта гибрида и составило 1,1-20% (табл. 2). В пересчете на общее число высаженных пыльников эффективность формирования эмбриогенных каллусов составила 0,2-4%.

Средняя продолжительность формирования эмбриогенных каллусов составляла 48 суток. Стимулирование регенерационного процесса на среде RN1 занимало 29 суток. Продолжительность периода от посадки экспланта до появления корнесобственных регенерантов равнялась 78 суткам. Субкультивирование непрерывно регенерирующих каллусных тканей на среде МС с последовательным переводом регенерантов в нестерильные условия для отдельных клонов происходило в течение 1 года.

Таким образом, использование улучшенной среды N1 позволило повысить эффективность формирования эмбриогенных каллусных тканей в отдельных вариантах опыта до 4%. Стимулирование регенерационного процесса успешно реализовано на среде RN1, а регенерирующие каллусные ткани после переноса на среду МС оказались способными к длительному культивированию in vitro с периодическими пересадками и выделением корнесобственных растений в нестерильные условия.

Источники информации 1. Chin-ching The N₆ medium and its applications to anther culture cereal crops | | Proceedings of symposium on plant tissue culture. - Peking: Science press, 1980. - P.43-50.

2. Datta S.K. Plant regeneration by pollen embryogenesis from cultured whole spikes of barley (Hordeum vulgare) // Theoretical and applied genetics. - 1987. - V.74. - P. 121-124.

3. Datta S.K., Wenzel G.I. Isolated microspore derived plant formation via embryogenesis in Triticum aestivum L. // Plant Science. - 1987. - V.48. - P.49-54.

4. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioasseys with tobacco tissue cultures // Physiology of plant. - 1962. - V.15. - 13. - P.473-497.

5. Бобков С.В. Получение корнесобственных регенерантов в культуре пыльников проса // Вестник РАСХН. - 2000. - 5. - С.41-43.

6. Gamborg О., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of gluconases in cultures of wheat and barley // Can.J.Biochem. - 1968. - V.46. - 5. - Р. 417-421.

Формула изобретения

Способ получения регенерантных растений в культуре пыльников проса (Panicum miliaceum L.), включающий формирование культуры эмбриогенных каллусов, стимулирование регенерационного процесса и культивирование регенерирующих каллусных тканей in vitro в течение длительного периода времени с последовательным выделением корнесобственных регенерантов в нестерильные условия, отличающийся тем, что для формирования эмбриогенных каллусов используют среду N₆, дополнительно содержащую 2 мг/л 2,4 Д, 500 мг/л L-глутамина, 500 мг/л мио-инозитола, 0,1 мг/л 6-БАП, а для стимулирования регенерационного процесса используют среду N₆, дополнительно содержащую 4 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л α-НУК, причем длительное культивирование регенерирующих каллусных тканей проводят на среде MS без регуляторов роста и дополнительно содержащей витамины среды В5.

РИСУНКИ

Рисунок 1