Биологически активная добавка для косметических средств и способ её получения

 

Изобретение относится к области медицины, а именно косметологии, и может быть использовано при производстве косметических средств с лечебно-профилактическими свойствами. Способ получения биологически активной добавки (БАД) для косметических средств предусматривает замораживание и оттаивание живой медицинской пиявки с последующей гомогенизацией пиявочной массы, экстрагированием гомогената и выделением жидкой фазы в качестве целевого продукта - собственно БАД. Способ обеспечивает повышение биологической активности целевого продукта за счет устранения возможности комплексообразования БАВ на поверхности мембраны бактерии-симбиота медицинской пиявки и высвобождения новых биологически активных веществ в активной форме. Это, в свою очередь, способствует улучшению следующих показателей активности получаемой БАД: увеличение белкового обмена, увеличение липидного обмена, противовоспалительное действие, снижение содержания малонового диальдегида, отсутствие раздражающего и аллергизирующего действия, повышение степени блокады тромбообразования, антигипоксическое и гипотензивное действие. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к косметологии, и может быть использовано при производстве косметических средств с лечебно-профилактическими свойствами.

Известно, что в процессе жизнедеятельности медицинская пиявка (Hirudo medicinalis) вырабатывает широкий спектр биологически активных веществ (БАВ): гирудин, ингибитор калликреина плазмы крови, бделлины, эглины, гиалуронидазу, дестабилазный комплекс, липазы, простагландины и др.

В зависимости от способа обработки медицинской пиявки выделяют комплексы БАВ, различные по своей структуре и составу, которые обуславливают свойства получаемых из них препаратов.

Известны препараты (Никонов Г.И. “Медицинская пиявка. Основы трудотерапии”. СПб.: “СДС”, 1998, с.32-68, 206-242, Патент РФ №2153325, МКИ А 61 К 7/48, опубл. 2000 г.), полученные путем гомогенизации медицинской пиявки и применяемые в виде нативного гомогената или его экстракта.

Однако низкое содержание биологически активных веществ, находящихся в активном состоянии и способных обеспечивать стимуляцию белково-липидного обмена в коже и подкожной клетчатке, не позволяет эффективно использовать их в качестве биологически активных добавок в косметических средствах.

При этом продукты, полученные непосредственно из живой пиявки, сильно загрязнены балластными веществами, различными бактериями и, прежде всего, продуктами жизнедеятельности (эндо- и экзопептидазами) бактерии-симбионта пиявки (Aeromonas hirudinis), и их применение часто провоцирует аллергические реакции организма. Кроме того, БАВ в нативном гомогенате сохраняют свою активность лишь незначительный срок. Поэтому препараты на основе гомогената или экстракта гомогената из медицинских пиявок и их частей имеют крайне ограниченное применение как в лечебных, так и в косметических средствах.

Попытки применить методы криообработки гомогената, полученного из медицинской пиявки (заявка №94031070, МКИ⁷ А 61 К 35/62, опубл. 10.09.96 г.), позволили несколько повысить биологическую активность целевого продукта.

Однако степень его воздействия на кожу остается низкой, а проявляемые свойства имеют нестабильный характер, поскольку в результате гомогенизации подавляющее количество БАВ, адсорбированных на стенке бактерии-симбионта пиявки и на поверхности балластных веществ кутикулы пиявки, остаются в связанном состоянии и не переходят в надосадочную жидкость.

Частично решить эти проблемы удалось при использовании технологий получения препарата из медицинских пиявок путем их замораживания с последующим лиофильным высушиванием (Патент РФ №2033173, МКИ А 61 К 35/62, опубл. 95 г.). Полученное таким образом порошкообразное вещество содержит достаточно широкий комплекс биологически активных соединений, длительное время сохраняет активность и используется как самостоятельно в лечебных целях, например, в качестве препарата, обладающего антитромботическим, тромболитическим, антиатеросклеротическим и гипотензивным действием, так и в составе косметических средств.

Наиболее близким из известных к описываемому изобретению является способ получения биологически активной добавки для косметических средств (Патент РФ №2113843, МКИ⁷ А 61 К 7/48, опубл. 98 г.) путем замораживания медицинской пиявки. Полученная известным способом биологически активная добавка (БАД) представляет собой надосадочную жидкость экстракта из порошка лиофильно высушенных медицинских пиявок и при включении в косметические средства оказывает некоторое влияние на белково-липидный обмен в коже.

Однако известный способ получения БАД включает лиофильную сушку медицинской пиявки и измельчение лиофилизата до порошкообразного состояния, что не способствует сохранению БАВ в активном состоянии и, прежде всего, липосомы (дестабилазный комплекс). В процессе лиофилизации большая часть БАВ адсорбируется на стенке пищеварительного тракта, мышечных клетках тела пиявки, а также на балластных веществах кутикулы пиявки и не переходят в жидкую фазу в процессе экстрагирования, утрачивая свойства ингибировать ферменты. Кроме того, известный способ получения БАД для косметических средств требует предварительного промывания медицинской пиявки дистиллированной водой или физиологическим раствором и просушивания ее перед замораживанием, в результате чего происходит непроизвольный выброс секрета слюнных желез, а потому имеют место потери ценных биологически активных веществ (БАВ). И, как следствие, полученная известным способом БАД не обладает достаточной степенью активности из-за низкого содержания антиоксидантов, а также веществ, обеспечивающих стимуляцию белково-липидного обмена в коже и подкожной клетчатке, что является причиной проявления такого нежелательного эффекта, как накопление суммарных липидов в коже (нарушение метаболизма липидов). Кроме того, отсутствие веществ, стимулирующих увеличение парциального содержания кислорода в крови микроциркулярного русла кожи, не позволяют получить БАД для косметических средств с антигипоксическими свойствами.

При этом загрязнение конечного состава известной БАД балластными веществами и продуктами жизнедеятельности бактерии-симбионта пиявки увеличивают ее протеолитическую активность, которая является нежелательным фактором воздействия на клетки кожи, поскольку вызывает снижение собственной ферментативной активности клетки кожи, а при длительном применении может вызвать аллергический ответ.

Таким образом, технический результат, получаемый при реализации описываемого изобретения, состоит в повышении биологической активности целевого продукта, получаемого из медицинской пиявки, за счет устранения возможности комплексообразования БАВ на поверхности мембраны бактерии-симбионта медицинской пиявки и высвобождения новых БАВ в активной форме.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения биологически активной добавки для косметических средств путем замораживания медицинской пиявки замороженную пиявку оттаивают, гомогенизируют, полученный гомогенат экстрагируют в воде или физиологическом растворе и выдерживают в течение 2-10 часов при комнатной температуре, после чего выделяют жидкую фазу в качестве целевого продукта.

При этом для получения БАД с антипрокоагулянтным и гипотензивным действием выделенную жидкую фазу дополнительно подкисляют до значения рН 5,2-6,0 и прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-25 минут.

Указанный технический результат достигается также биологически активной добавкой, полученной по описанному выше способу.

Биологически активная добавка для косметических средств, полученная в соответствии с настоящим изобретением, содержит следующие ингредиенты: гиалуронидазу, гирудин, липосому (дестабилазный комплекс, структурированный в липосому, который разрушается при лиофилизации), антиоксиданты, стабильный аналог простациклина (6-keto-PGF_1α ), ингибиторы трипсина, плазмина и тромбина, липаза и холестерин-эстераза, а также антигипоксанты.

Полученная композиция БАВ позволяет стимулировать белковый обмен и повысить уровень суммарных липидов в коже, обладает выраженным антиоксидантным и антигипоксичесим действием, не проявляя при этом пртеолитической активности, раздражающего или аллергизирующего действия.

Описываемый способ получения БАД для косметических средств осуществляют следующим образом.

Медицинские пиявки замораживают, например, в бытовой морозильной камере, замороженную массу оттаивают при комнатной температуре, гомогенизируют, заливают водой или физиологическим раствором и выдерживают при комнатной температуре 2-10 часов, после чего полученный препарат перемешивают и выделяют жидкую фазу. Полученный жидкий продукт используют непосредственно в качестве БАД для косметической продукции.

Выделение жидкой фазы осуществляют любым известным способом, например центрифугированием, фильтрованием или отстаиванием. Продукт может быть передан на следующую стадию - подкисления и термической обработки - для получения БАД с антипрокоагулянтным и гипотензивным действием и/или подвергнут выпариванию до порошкообразного состояния с целью длительного хранения.

Установлено специфичное для биологии медицинской пиявки явление. Симбионт пиявки - бактерия Aeromonas hirudinis, обитающая в кишечном канале пиявки и обеспечивающая пиявку необходимыми для ее жизни веществами, синтезирует биологически активные вещества не только своими органеллами, но и на поверхности мембраны (в примембранном матриксе). Причем имеют место специфическая (синтез дистабилазного комплекса; активация неактивных форм предшественников БАВ) и неспецифическая (депонирование гирудина, антигипоксантов, простагландинов и т.д.) адсорбция БАВ на внешней поверхности мембраны. Процесс криообработки путем замораживания целой живой пиявки с последующим ее оттаиванием позволяет перевести бактерию в состояние спор при сохранении целостности бактерии-симбионта. При этом разрушаются адсорбционные связи между БАВ и стенкой бактерии, что приводит к переводу БАВ из связанного с матриксом состояния в свободное, т.е. происходит преобразование БАВ из состояния предшественника в активную форму. В результате последующей гомогенизации пиявочной массы и экстрагирования гомогената освобожденные БАВ легко переходят в жидкую фазу, в то время как бактерия и осколки ее оболочек после гомогенизации вместе с протеолитическими ферментами, эндо- и экзопептитазами поступает в осадок. Полученная водная субстанция активизированных БАВ и есть целевой продукт.

При этом установлено, что применение приемов замораживания-оттаивания уже размельченной пиявочной массы (гомогената), как это предлагается в упомянутом выше аналоге, не приводит к спорообразованию, комплексы БАВ - стенка бактерии-симбионта сохраняются, БАВ остаются в связанном с частями бактерии состоянии и не переходят в раствор, поступая в осадок, а потому не наблюдается какого-либо значительного повышения биологической активности.

В таблице представлены свойства полученной в соответствии с описываемым способом биологически активной добавки (А) в сравнении с характеристиками известных препаратов аналогичного действия (БАД по прототипу - патент РФ 2113843 (С) и препарата, полученного с применением приемов криообработки гомогената из медицинской пиявки (заявка РФ 94031070 (В)).

Сущность изобретения поясняется конкретными примерами реализации описываемого изобретения, где в примерах 1 и 2 показаны варианты осуществления способа получения БАД для косметических средств, а в примерах 3-9 приведена экспериментальная оценка эффективности полученной БАД.

Пример 1

Берут 500 медицинских пиявок общим весом 600 г, замораживают при температуре -4° С, оттаивают при комнатной температуре на льду в течение шести часов, гомогенизируют в гомогенизаторе Politron P-40 до состояния однородной массы.

Полученную массу заливают дистиллированной водой, доводя объем гомогената до 1 литра (соотношение объемов 1:1), выдерживают при комнатной температуре в течение 10 часов, перемешивают, центрифугируют и собирают выделенную жидкость. Таким образом получают 650 мл жидкого целевого продукта. В целях длительного хранения продукт подвергают выпариванию, получая 25 г порошкообразной БАД к косметическим средствам.

Пример 2

Берут 100 медицинских пиявок (общий вес 120 г), замораживают при температуре -4° С, оттаивают при комнатной температуре в течение четырех часов, гомогенизируют, доводят дистиллированной водой объем гомогената до 240 мл, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение шести часов, собирают супернатант и определяют активности.

В полученный супернатант добавляют 0,1% раствор НСl до значения рН=5,6, после чего раствор прогревают в кипящей бане в течение 15 минут, центрифугируют и собирают выделенную жидкость. Получают 100 мл жидкого целевого продукта.

Пример 3. Изучение раздражающего и аллергизирующего действия БАД, ее подострой токсичности, влияния накожных длительных аппликаций препаратов на морфологические структуры кожи и печени экспериментальных животных.

Исследования проводились на 90 половозрелых морских свинках, находящихся на обычном рационе питания. Полученную по способу, описанному в примере 1, жидкую БАД наносили на кожу морских свинок ежедневно в течение 30 дней в концентрации 0,001% (n=30), 0,01% (n=30), и 0,1% (n=15). В качестве контроля животным апплицировали 0,85% раствор NaCl (физиологический раствор; n=15).

Результаты исследований показали, что полученный в соответствии с описываемым способом продукт не обладает раздражающим и аллергизирующим действием на кожу, отрицательного действия на морфологические структуры кожи и печени не оказывает, не вызывает общетоксического действия на организм подопытных животных. Животные не отставали в прибавлении веса от контрольных, были активны, подвижны, имели блестящую шерсть, хороший аппетит. При анализе влияния препарата-прототипа установлено аллергизирующее действие на кожу животных, которое выражалось в нарушении пигментации отдельных участков кожи и расчесывании кожи. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии отрицательного воздействия полученного комплекса БАВ на состояние кожи экспериментальных животных.

Пример 4. Изучение содержания общего растворимого белка в коже.

Исследования проводились по стандартному методу Д.Бейли.

Полученный по способу, описанному в примере 1, жидкий продукт наносили на кожу экспериментальных животных по методике и в режиме, аналогично описанному в примере 3.

Результаты испытаний, приведенные в таблице, свидетельствуют об эффективности полученного в соответствии с описываемым изобретением препарата в стимулировании белкового обмена.

Пример 5. Изучение суммарных липидов в коже.

Воздействие полученным препаратом на исследуемых животных проводили по методике, аналогичной описанной в примере 3, содержание суммарных липидов определялось по общепринятой методике Хуэрго.

Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о выраженном влиянии исследуемого препарата на метаболизм липидов, обусловленном избирательным воздействием описываемого комплекса БАВ на свободные липиды, в то время как при воздействии БАД согласно прототипу происходит делипидизация мембранной клетки, т.е. разрушение структурных липидов.

Пример 6. Изучение содержания малонового диальдегида.

Исследования проводились по стандартному методу В.Стальной.

Результаты отражены в таблице.

Достоверное снижение уровня малонового диальдегида является показателем антиоксидантной активности исследуемого комплекса БАВ.

Пример 7. Изучение антигипоксического действия БАД.

Исследование проводилось по стандартному методу Н.Агаджаняна “Определение устойчивости к гипоксии в группе крыс” на 28-ми половозрелых крысах-самцах линии Вистар, находящихся на обычном рационе питания.

Жидкую БАД, полученную в соответствии с настоящим изобретением, наносили на кожу 14-ти животных ежедневно в течение 45 дней в концентрации 0,01% (n=14). В контрольной группе (n=14) животным апплицировали 0,85% раствор NaCl (физиологический раствор). Обе группы животных были помещены в барокамеру, в которой производилась откачка воздуха до давления, соответствующего высоте 12000 м над уровнем моря. Спустя 4 минуты восстанавливали исходное давление воздуха. В контрольной группе выжило 2 крысы (14,3%), в опытной - 8 (57,1%). То есть выживаемость крыс при использовании описываемой БАД увеличивается в 4 раза, что свидетельствует об антигипоксическом действии препарата.

Пример 8. Изучение антипрокоагулянтного действия.

Противотромботическое действие препарата, полученного по способу, описанному в примере 2, определяли на крысах с использованием метода тромбообразования по Весслеру. Степень блокады тромбообразования оценивали при интервале между введением раствора препарата и активированной стеклом сыворотки крови человека, составляющем 4 часа, и выражали в процентах относительно контроля (равный объем физиологического раствора).

При внутривенном введении 0,3 мл как 0,01%, так и 0,001% раствора препарата степень блокады тромбообразования составила 100%.

При введении 0,3 мл 0,001% раствора препарата по прототипу (С) степень блокады тромбообразования составила 45%, а препарата (В) - 85%.

Пример 9. Изучение гипотензивного действия.

Гипотензивное действие определяли при пероральном введении 2 мл препарата крысам линии SHR (спонтанно гипертензивные). Исходный уровень давления составлял 165-5 мм рт. ст. Спустя 10 часов анализировали уровень давления в хвостовой вене крыс. Гипотензивное действие выражали в процентах относительно контроля (равный объем физиологического раствора). Экспериментальным животным вводили препарат, получение которого описано в примере 2.

Уровень давления в хвостовой вене крыс составил при введении 0,001% раствора БАД по сравнению с контролем 15-5%, при введении 0,01% раствора - 25-5%, что свидетельствует о выраженном гипотензивном действии препарата.

Другие свойства описываемого продукта, представленные в таблице, анализировали по общепринятым методикам для определения каждого параметра. Сведения, представленные в таблице, указывают на значительное увеличение активности препарата по сравнению с аналогичными продуктами, полученными из медицинской пиявки.

Полученный комплекс БАВ стимулирует белковый обмен, увеличивает содержание суммарных липидов в коже, обладает выраженным антиоксидантным, антигипоксическим и гипотензивным действием, не проявляет раздражающего и аллергизирующего действия на кожу и предназначен для использования в качестве биологически активной добавки для косметических средств.

Формула изобретения

1. Способ получения биологически активной добавки для косметических средств путем замораживания медицинской пиявки, отличающийся тем, что замороженную пиявку оттаивают, гомогенизируют, полученный гомогенат экстрагируют в воде или физиологическом растворе и выдерживают в течение 2-10 ч при комнатной температуре, после чего выделяют жидкую фазу в качестве целевого продукта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделенную жидкую фазу дополнительно подкисляют до значения рН 5,2-6,0 и прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-25 мин.

3. Биологически активная добавка для косметических средств, отличающаяся тем, что она получена по способу в соответствии с п.1.