Рекомбинантная плазмидная днк рвмс-rt(a)m-1, используемая для экспрессии обратной транскриптазы (rt) вируса иммунодефицита человека в клетках высших эукариот

 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к генетической инженерии и иммунологии. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-RT(A)m-1. Плазмида содержит в своем составе ген обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, в последовательности нуклеотидов которого в кодонах с преобладанием аденина и/или тимина аденин и/или тимин частично заменены на гуанин и/или цитозин. Плазмида обеспечивает высокий уровень экспрессии обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках. Предложенная плазмида может быть использована для иммунизации против вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А. 3 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к генетической инженерии и иммунологии, и может быть использовано для иммунизации против вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А.

Известна рекомбинантная плазмидная ДНК рНР 102, размером 7170 п.о., содержащая BamHI Pst фрагмент ДНК вектора pEL5B, ген бетагалактозидазы Е.соli размером 6400 п.о., а также Pst Bam HI фрагмент ДНК вируса иммунодефицита человека 1 типа, кодирующий полипептид Р102, размером 770 п.о. Данная плазмидная ДНК обеспечивает синтез в бактериальных клетках гибридного полипептида, способного связывать антитела к обратной транскриптазе вируса иммунодефицита человека 1 типа, RU 207152.

Данное техническое решение позволяет осуществить синтез полипептида, кодируемого геном роl вируса иммунодефицита человека 1 типа, в виде гибридного белка в бактериальных клетках. Однако синтез обратной транскриптазы ВИЧ-1 в клетках высших эукариот не осуществляется.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи создания рекомбинантной плазмидной ДНК, которая обеспечивает экспрессию обратной транскриптазы (RT), кодируемой геном роl ВИЧ-1 субтипа А в клетках высших эукариот.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-RT(A)m-1, используемая для экспрессии обратной транскриптазы (RT) вируса иммунодефицита человека в клетках высших эукариот, содержит ген обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2.

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых представлены:

на фиг.1 - последовательность нуклеотидов природного гена RT российского варианта субтипа А ВИЧ-1;

на фиг.2 - последовательность нуклеотидов в модифицированном гене RT российского варианта субтипа А ВИЧ-1. Замены оснований подчеркнуты;

на фиг.3 - структура плазмидной ДНК pBMC-RT(A)m-1.

Обозначения: RT(A)mod - фрагмент ДНК, содержащий измененные нуклеотиды, blа - ген беталактамазы, Ori - репликатор, Р - промотор предранних генов белков цитомегаловируса, ВGН - участок терминации транскрипции и полиаденилирования.

Получение плазмидной ДНК pBMC-RT(A)m-1 осуществляется следующим образом. Фрагмент ДНК, кодирующий ген RT ВИЧ-1 субтипа А, выделяли при помощи полимеразной цепной реакции, матрицей в которой служила ДНК из лимфоцитов периферической крови пациента, инфицированного вирусом иммунодефицита человека первого типа субтипа А. Данный фрагмент клонировали в вектор рВМС, получив плазмиду pBMC-RT(A), содержащую природный ген RT. Далее выделяли полученную плазмиду pBMC-RT(A) и вводили в ее последовательность известным способом фрагменты, содержащие последовательность Козака, инициирующий и терминирующие кодоны с получением плазмиды pBMC-RT(A)-1. Далее выделяли плазмиду pBMC-RT(A)-1 и производили в гене RT необходимые замены нуклеотидов известным способом, получив в результате плазмиду pBMC-RT(A)m-1.

Изучение синтеза обратной транскриптазы в эукариотических клетках происходит следующим путем. Культуру клеток 3Т3 мыши трансформировали ДНК плазмид рВМС, pBMC-RT(A)-1 и pBMC-RT(A)m-1 (по 1 микрограмму каждой плазмидной ДНК), после чего клетки инкубировали в течение 48 часов при температуре +37°С и содержании СО₂ в воздухе, равном 5%, лизировали и анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа А. Интенсивность окраски полос, соответствующих белку RT, анализировали с помощью компьютизированной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидой pBMC-RT(A)m-1, синтез белка RT в 10-15 раз выше, чем в клетках, трансформированных плазмидой pBMC-RT(A)-1.

Использование плазмидной ДНК pBMC-RT(A)m-1 для иммунизации организма иллюстрируется следующим примером. Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно по 10 и 25 микрограмм плазмидных ДНК pBMC-RT(A)-1 и pBMC-RT(A)m-1 согласно настоящему изобретению. Иммунизацию повторяли через четыре недели и еще через две недели собирали сыворотки крови иммунизированных животных и определяли в них титр антител к рекомбинантному белку RT субтипа А известным способом. Результаты приведены в таблице.

Формула изобретения

Рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-RT(A)m-1, используемая для экспрессии обратной транскриптазы (RT) вируса иммунодефицита человека в клетках высших эукариот, отличающаяся тем, что она содержит ген обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2.

РИСУНКИРисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3