Способ определения антимикробной активности растительных масел in vitro
Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к методам определения антимикробной активности растительных масел. В растительное масло добавляют эмульгатор ТВИН-80 в соотношении 9:1. Далее вносят 0,5 мл полученной масляной эмульсии в 4,5 мл стандартной микробной культуры. Затем перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим высевом на соответствующую плотную питательную среду и подсчитывают выросшие микробные колонии. Изобретение позволяет упростить способ определения антимикробной активности. 1 табл.
Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной микробиологии, в частности к определению антимикробной активности растительных масел и препаратов на их основе.
В работе Ю.А.Богдарина (Богдарин Ю.А. Ускоренный метод определения высших жирных кислот на газовом хроматографе // Лабораторное дело. - 1979. - N 2. - С.121) и ряде других работ антимикробная активность жидких жиров (в том числе растительных масел) определяется по содержанию в них высших жирных кислот (которое, в свою очередь, устанавливается хроматографическим анализом). Но, как известно, определенной антимикробной активностью обладают и другие компоненты жидких жиров (например, токоферолы), и не все они могут быть определены хроматографически на тех же режимах и с тем же набором реактивов, что и высшие жирные кислоты. Неизвестны также данные о возможном изменении (синергизме, антагонизме, потенцировании) антимикробного воздействия при их совместном присутствии. Наконец, понятие "антимикробной активности" дается Ю.А.Богдариным чрезмерно обобщенно (как возможность воздействия на микроорганизмы вообще), в то время как при микробиологических исследованиях крайне важны сведения о реакции определенного рода, вида, штамма микроорганизмов на те или иные воздействия. Таким образом, при анализе жидких жиров и масел метод Богдарина дает определенную ошибку, и эта ошибка тем значительнее, чем более выражены неучтенные факторы.
Существом предлагаемого изобретения является прямой, упрощенный способ определения антимикробной активности путем добавления в исследуемое растительное масло эмульгатора ТВИН-80 в соотношении 9:1, последующего внесения 0,5 мл полученной масляной эмульсии в 4,5 мл стандартной микробной культуры, перемешивания ее в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим высевом 1 мл культуры на соответствующую плотную питательную среду и прямым подсчетом колоний, выросших из каждого разведения. Контролем служит та же культура микроорганизма, не подвергшаяся действию эмульсии. Отличительным признаком антимикробной активности является полное или частичное отсутствие роста колоний в экспериментальных сериях по сравнению с контрольными.
Для количественной оценки антимикробной активности может быть построен график, по оси абсцисс которого откладывается величина десятичного логарифма количества колониеобразующих единиц на миллилитр (IgKOE) в последовательных десятикратных разведениях, а по оси ординат - число колоний при данном разведении.
Неочевидность заявляемого способа состоит в установлении необходимости использования для определения антимикробной активности прямым методом - не непосредственно масла, а его эмульсии, что обеспечивает высокую однородность материала для посева на питательные среды.
Новизна изобретения состоит в том, что впервые открывается возможность прямо и непосредственно, с достаточной простотой и точностью определить антимикробную активность жидких жиров и растительных масел по отношению к любому определенному роду, виду, штамму микроорганизмов. Кроме того, путем исследования группы различных масел может быть получена исчерпывающая информация о влиянии и взаимовлиянии различных их компонентов на общую антимикробную активность. Метод-прототип такой возможности не предусматривает, кроме того, он требует достаточно сложного оборудования, специально подготовленного персонала и трудоемкой процедуры анализа.
Исследования выполнены на кафедре микробиологии Кировской государственной медицинской академии. Чувствительность метода была доказана сравнением экспериментальных результатов, полученных заявляемым способом и способом-прототипом. Сходимость данных предлагаемого метода по результатам математической обработки алгоритмом Стьюдента, также была признана достоверной, в то время как для прототипа по ряду исследованных масел таковой не наблюдалось.
Проведенные исследования по восьми основным пищевым маслам (оливковому, соевому, горчичному, курукузному, арахисовому, хлопковому, рапсовому, подсолнечному рафинированному и нерафинированному), а также по трем различным маркам товарного подсолнечного масла ("ЗДРАВА", "Злато" и "Олейна") позволяют заключить, что предлагаемый способ определения антимикробной активности обладает большой универсальностью и высокой точностью получаемых результатов, что делает возможным его применение даже в непосредственных условиях производства (пищевого, фармацевтического и т.п.). Кроме того, результаты исследования облепихового, шиповникового, персикового масел, масла расторопши и аптечного масляного экстракта "Фитотон" доказывают, что заявляемый способ может применяться для исследований масел различного состава и класса чистоты (в том числе парфюмерных). Напротив, для метода-прототипа точность результатов во многом зависит от количества и состава (химического и структурного) содержащихся в нем примесей, что не обеспечивает необходимой статистической достоверности анализа.
Таким образом, не только для масел любой степени чистоты, но и для их смесей точность результатов, полученных предлагаемым способом, выше таковых для способа-прототипа.
Заявляемый способ по сравнению с прототипом обладает большей простотой исполнения и доступностью для любой микробиологической лаборатории (в том числе заводской - в пищевой, фармацевтической, парфюмерной промышленности и т.п.). Он не требует применения специального оборудования, приборов, дорогостоящих реактивов и специальной подготовки персонала, отличается универсальностью и позволяет получить не только качественную, но и количественную характеристику антимикробной активности растительных масел и препаратов на их основе. Все это позволяет рекомендовать заявляемый метод для лабораторного определения антимикробной активности растительных масел (в том числе пищевых растительных масел различных сортов).
Пример 1.
Определение антимикробной активности пищевого подсолнечного масла марки "ЗДРАВА" в отношении St.aureus.
Из клинического материала выделяется чистая культура St.aureus, и из нее готовят два ряда десятикратных разведений (опытный и контрольный) - от 109 до 10 -1 колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл). Характеристикой концентрации является показатель мутности, определяемый на ФЭК при длине световой волны 540 нм.
Для приготовления масляной эмульсии в пробирку с 4,5 мл масла "ЗДРАВА" вносят 0,5 мл эмульгатора ТВИН-80 и тщательно перемешивают. В каждую пробирку опытного ряда разведений добавляют 0,5 мл полученной масляной эмульсии, а в пробирки контрольного ряда - соответственно по 0,5 мл стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре.
После перемешивания по 0,1 мл каждого разведения (как из опытного, так и контрольного рядов) высевают на чашки Петри с желточно-солевым агаром (ЖСА). Чашки инкубируют при 37°С в течение 48 часов. После инкубирования подсчитывают количество колоний на чашках из каждого разведения опытного ряда и сравнивают с соответствующим посевом из контрольного ряда. Результаты исследований представлены в таблице.
Отсутствие или меньшее количество колоний на чашках опытного ряда свидетельствует о выраженной антимикробной активности масла "ЗДРАВА".
Таким образом, для растительных масел любого состава и марки (в том числе пищевых) способ можно признать пригодным для определения антимикробной активности.
Заявляемый способ может применяться для определения антимикробной активности жидких жиров и масел в лабораторных условиях и при экспериментальном моделировании с целью оценки ожидаемого терапевтического воздействия лекарственных препаратов на основе растительных масел.
Формула изобретения
Способ определения антимикробной активности растительных масел in vitro, отличающийся тем, что в исследуемое растительное масло добавляют эмульгатор ТВИН-80 в соотношении 9:1, затем вносят 0,5 мл полученной масляной эмульсии в 4,5 мл стандартной микробной культуры, перемешивают ее в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим высевом на соответствующую плотную питательную среду и прямым подсчетом выросших микробных колоний.
