Способ люминесцентной диагностики и/или качественной оценки состояния биологического объекта и устройство для его осуществления
Владельцы патента RU 2254372:
Хоменко Владимир Александрович (RU)
Александров Михаил Тимофеевич (RU)
Гапоненко Олег Геннадьевич (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, а конкретно к оценке состояния биологического объекта с помощью оптико-электронных средств. Способ люминесцентной диагностики и/или качественной оценки состояния биологического объекта характеризуется измерением на двух участках биологического объекта (контролируемом и интактном) люминесцентных параметров путем воздействия на каждый участок оптическим излучением последовательно в спектральных интервалах, соответствующих возбуждению люминесценции различных тканевых флюорофоров. Из излучения люминесценции, обусловленного воздействием на участки биологического объекта оптического измерения, соответствующего каждому из упомянутых выше спектральных интервалов, выделяют соответствующие спектральные компоненты, а интенсивность их измеряют синхронно с соответствующей фазой пульсационной волны в области соответствующего участка биологического объекта. Приведено описание также устройства для осуществления предложенного способа, позволяющего повысить достоверность диагностики и оценки состояния биологического объекта путем исключения влияния артефактов и общесоматического состояния биологического объекта на результаты измерений люминесцентных параметров исследуемого участка. Изобретение может быть использовано для экспрессионного исследования спектров флюоресценции аэробных и анаэробных бактерий, а также при оптической диагностике процессов микробной природы в промышленности, медицине, пищевых технологиях.2 н. и 2 з.п. ф-лы, 27 ил., 3 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, а более конкретно к оценке состояния биологических объектов с помощью оптико-электронных средств. Предлагаемое изобретение может быть использовано для экспрессного исследования спектров флюоресценции аэробных и анаэробных бактерий, а также при оптической диагностике процессов микробной природы в промышленности, медицине, пищевых технологиях.
Как следует из предшествующего уровня техники, начиная с середины восьмидесятых годов прошлого века наблюдается все возрастающий интерес специалистов к использованию при оценке качественного состояния или диагностике состояния биологических объектов спектральных зависимостей их оптических и в особенности люминесцентных параметров.
Так, известен способ люминесцентного определения состояния биологического объекта, согласно которому воздействуют на биологический объект монохроматическим оптическим излучением, возбуждающим люминесценцию выбранного его тканевого флюорофора, выделяют из излучения люминесценции биологического объекта две спектральные компоненты, измеряют их интенсивность, а о состоянии биологического объекта судят по величине отношения измерительных интенсивностей спектральных компонент излучения люминесценции (см. патент US-A-N 5131398, 1992).
Там же описано устройство для осуществления способа люминесцентного определения состояния биологического объекта, которое содержит монохроматический источник света (предпочтительно модулированного) с длиной волны 300 нм, эндоскоп с окуляром и с входным и выходным волоконно-оптическими жгутами, два фотопреобразователя с оптическими фильтрами соответственно на длину волны 340 и 440 нм, а также измеритель отношения электрических сигналов, блок регистрации и компьютер. Вход входного волоконно-оптического жгута соединен с выходом монохроматического источника света, выход выходного волоконно-оптического жгута выполнен разветвленным на два канала, каждый из которых оптически сопряжен с соответствующим фотопреобразователем. Выходы фотопреобразователей соединены с соответствующим входом измерителя отношения электрических сигналов, первый выход которого соединен с входом блока регистрации, а второй выход - с входом компьютера.
Описанный выше способ люминесцентного определения состояния биологического объекта, а также устройство для его осуществления позволяют получить информацию об одном тканевом флюорофоре исследуемого объекта.
Недостаток же описанного выше технического решения заключается в том, что его использование не позволяет, вследствие ограниченной информативности, производить достоверную оценку состояния исследуемого биологического объекта, характеризующегося, как правило, наличием не одного, а нескольких тканевых флюорофоров.
Известен также способ люминесцентного определения состояния биологического объекта, взятый в качестве ближайшего аналога и включающий циклически повторяющееся воздействие на исследуемый биологический объект монохроматическим оптическим излучением последовательно на длинах волн, возбуждающих люминесценцию соответствующих тканевых флюорофоров биологического объекта, при этом из излучения люминесценции, обусловленного воздействием на биологический объект монохроматического излучения на каждой из выбранной выше длине волны, выделяют соответствующие спектральные компоненты, преобразуют распределение по контролируемому участку биологического объекта интенсивности каждой спектральной компоненты люминесценции в электрический сигнал, а оценку состояния каждого участка поверхности биологического объекта осуществляют после визуализации распределения интенсивности люминесценции (см. патент US-A-N 5413108, 1995). В этом же патенте описано устройство для осуществления способа люминесцентного определения состояния биологического объекта, содержащее комбинированный источник света (в качестве которого может быть использована либо лампа со светофильтром, либо два или больше лазеров), первый блок сменных светофильтров, эндоскоп с тремя вводами, второй блок сменных фильтров, фотоэлектрический усилитель изображения и твердотельный формирователь видеосигнала, подключенный своим выходом к процессорному блоку, снабженному средствами визуализации. При этом источник света посредством первой оптико-волоконной линии связан с входом первого блока сменных фильтров, выход которого посредством второй оптико-волоконной линии связан с первым вводом эндоскопа, второй ввод которого посредством третьей оптико-волоконной линии связан с входом фотоэлектрического усилителя изображения, оптически сопряженный своим выходом с входом твердотельным формирователям видеосигнала.
Недостаток описанного выше технического решения, взятого в качестве прототипа, заключается в том, что оно не обеспечивает получения результатов измерений спектров люминесценции, необходимых для достоверной оценки состояния исследуемого биологического объекта. Дело в том, что даже при правильном выборе длины волны оптического излучения, возбуждающего люминесценцию конкретного исследуемого тканевого флюорофора, существенное влияние на амплитудно-спектральную характеристику его люминесцентного излучения будут оказывать не только артефакты (происходящие в такт с измерениями, например, пульсации самой ткани под действием кровотока и/или ее температуры, а также соответствующее им изменение уровня оксигенации в исследуемой области), но и состояния нативного образца и/или общесоматическое состояние исследуемого объекта.
Настоящее изобретение направлено на обеспечение повышения достоверности качественной оценки состояния биологического объекта (путем исключения влияния артефактов и/или общесоматического состояния биологического объекта на результаты измерений амплитудно-спектральных характеристик тканевых флюорофоров).
Поставленная задача (с точки зрения способа как объекта изобретения) решена тем, что в способе люминесцентной диагностики и/или качественной оценки состояния биологического объекта, согласно которому воздействуют на исследуемый участок биологического объекта оптическим излучением последовательно в спектральных интервалах, соответствующих возбуждению люминесценции различных содержащихся в объекте флюорофоров биологического объекта, при этом из излучения люминесценции, обусловленного воздействием на исследуемый участок биологического объекта оптического излучения, соответствующего каждому из упомянутых выше спектральных интервалов, выделяют соответствующие спектральные компоненты и измеряют их интенсивность, согласно изобретению осуществляют непрерывный контроль соответствующей фазы нативного состояния и/или пульсации биологического объекта и измеряют люминесцентные характеристики его интактного участка путем воздействия на этот участок биологического объекта оптическим излучением последовательно в тех же спектральных интервалах, что и при воздействии на его контролируемый участок, затем из излучения люминесценции, обусловленной воздействием на интактный участок биологического объекта оптического излучения, соответствующего каждому из упомянутых выше спектральных интервалов, выделяют те же спектральные компоненты, которые выделяют из соответствующих излучений люминесценции исследуемого участка биологического объекта, при этом интенсивность выделенных спектральных компонент люминесцентных излучений обоих участков биологического объекта измеряют синхронно с соответствующей фазой нативного состояния и/или пульсационной волны в области соответствующего участка биологического объекта, и о качественных изменениях люминесцентных параметров исследуемого участка биологического объекта судят по отношению измеренных на обоих участках, т.е. исследуемом и интактном, интенсивностей одинаковых спектральных компонент люминесцентных излучений, соответствующих одному и тому же спектральному интервалу оптического излучения, используемого для возбуждения излучения люминесценции.
Качественная оценка состояния биологического объекта заключается в сравнении амплитудно-спектральных характеристик, мощности флюоресценции, нормированной мощности флюоресценции, амплитуды максимума флюоресцеции, ее полуширины и других спектральных показателей, нативного и исследуемого объекта в реальном времени на принципе обратной связи.
Кроме того, поставленная задача решена тем, что измерение люминесцентных характеристик контролируемого участка и клинически интактного участка биологического объекта осуществляют в циклической последовательности - измеряют люминесцентные характеристики контролируемого участка и интактиого участка биологического объекта последовательно синхронно с различными фазами нативного состояния и/или пульсационной волны с последующим усреднением интенсивностей одних и тех же спектральных компонент излучения люминесценции, измеренными синхронно с различными фазами нативного состояния биологического объекта и/или пульсационной волны.
Поставленная задача, с точки зрения устройства как объекта изобретения, решена тем, что устройство для люминесцентной диагностики и/или качественной оценки состояния биологического объекта, содержащее комбинированный источник света, первую передающую оптико-волоконную линию, приемную оптико-волоконную линию, оптико-электронный спектроанализатор, подключенный своим входом к выходу приемной оптико-волоконной линии, а своим выходом - к первому входу процессорного блока, согласно изобретению дополнительно содержит оптический коммутатор с N оптическими входами и с двумя оптическими выходами, а также вторую передающую оптико-волоконную линию и формирователь сигнала пульсовой волны, комбинированный источник света выполнен с N выходами, которые соответствуют оптическим излучениям различного спектрального состава, при этом каждый выход комбинированного источника света посредством соответствующего волоконного световода соединен с соответствующим оптическим входом оптического коммутатора, первая и вторая передающие оптико-волоконные линии подключены соответственно к первому и второму оптическим выходам оптического коммутатора, который включает прямоугольную призму с отражающими покрытиями на одинаковых катетных гранях, призму ромб с углами 45 и 135° между смежными гранями и с отражающими покрытиями на двух расположенных напротив друг друга гранях, при этом грани призм с отражающими покрытиями выполнены одинаковыми, а одна из катетных граней прямоугольной призмы расположена вплотную с одной из граней с отражающим покрытием призмы ромб, призмы установлены с возможностью поворота посредством привода вокруг оси, проходящей через точку пересечения диагоналей расположенных вплотную друг к другу граней призм и перпендикулярной гипотенузой грани прямоугольной призмы, оптические входы оптического коммутатора размещены под одинаковым углом π/N друг относительно друга по окружности с центром, лежащим на оси поворота призм, и с радиусом, равным расстоянию между осями входного и выходного световых пучков, которое у обеих призм одинаково, оптические выходы оптического коммутатора расположены соосно оси вращения призм, напротив друг друга и по обе стороны относительно плоскости поворота призм, вход привода призм являются управляющим входом оптического коммутатора, который включает также датчик углового положения призм, выход которого является электрическим выходом оптического коммутатора, приемная оптико-волоконная линия выполнена двухканальной, формирователь сигнала пульсовой волны также двухканальным, при этом его первый и второй выходы подключены соответственно ко второму и третьему входам процессорных блока, четвертый вход которого соединен с электрическим выходом оптического коммутатора, управляющий вход которого подключен к первому выходу процессорного блока.
Под биологическим объектом в данном изобретении подразумеваются объекты, получаемые как каким-либо биотехнологическим путем (например, продукты питания, получаемые с помощью или на основе микроорганизмов), культуры клеток ткани, микробные культуры, растения, разнообразные экологические объекты и объекты биосферы, так и биологические ткани человека и животных.
Преимущество предложенного способа люминесцентной диагностики и/или качественной оценки состояния биологического объекта перед известным (взятым в качестве прототипа) заключается в том, что проведение аналогичных измерений люминесцентных параметров исследуемого и интактного участков одного и того же биологического объекта позволяет повысить точность измерений люминесцентных параметров исследуемого участка за счет исключения влияния на результаты измерений не только артефактов (например, плотности биологического объекта, его температуры, пульсации тканей под действием тока биологических жидкостей, а также других процессов, которые происходят в такт с изменениями специфических и неспецифических биоритмов в области контролируемого участка), но и общего состояния биологического объекта. В результате повышается достоверность диагностики, особенно при исследовании динамики патологических процессов в биологическом объекте.
Преимуществом устройства для осуществления предложенного способа является то, что расширение его функциональных возможностей не привело к его усложнению за счет использования оптического коммутатора, обеспечивающее многопозиционное переключение нескольких источников оптического излучения различного спектрального состава последовательно на два выхода и имеющего простую, не требующую больших затрат при изготовлении конструкцию.
В дальнейшем изобретение поясняется конкретными примерами, которые, однако, не являются единственно возможньми, но наглядно демонстрируют возможность достижения ожидаемого технического результата с помощью указанной выше совокупности существенных признаков. Действительно, на основе принципиально нового технического решения, сформулированного в начале раздела, посвященного характеристике сущности изобретения, могут быть созданы устройства на основе комбинации других узлов, элементов и т.п.
На фиг.1 схематично изображено устройство для люминесцентной диагностики и/или качественной оценки состояния биологического объекта; на фиг.2 - положение прямоугольной призмы и призмы ромб на втором этапе измерений (вид со стороны втулки); на фиг.3 - оптический коммутатор в положении, соответствующем N+1 этапу измерений (увеличено).
Устройство для люминесцентной диагностики биологического объекта (фиг.1) содержит комбинированный источник света с N выходами 2.1., 2.2.,...,2N, которые соответствуют различным спектральным интервалам оптического излучения, оптический коммутатор 3 с N оптическими входами 4.1,4.2,...,4.N, двумя оптическими выходами 5.1 и 5.2, а также с электрическим управляющим входом 6.1 и электрическим выходом 6.2, при этом оптические входы 4.1.-4.N и выходы 5.1 и 5.2 выполнены в виде соответствующих коллиматоров (градиентных стержневых линз). Кроме того, устройство содержит оптико-электронный спектроанализатор 7, процессорный блок 8 и формирователь 9 сигнала пульсовой волны.
Выходы 2.1-2.N комбинированного источника 1 света посредством соответствующих волоконных световодов 10.1-10.N соединены с соответствующими входами 4.1-4.N оптического коммутатора 3. Первый оптический выход 5.1 оптического коммутатора 3 соединен с первой передающей оптико-волоконной линией 11, а второй его оптический выход 5.2 - со второй передающей оптико-волоконной линией 12. Выходной конец двухканальной приемной оптико-волоконной линии 13 соединен с входом оптико-электронного спектроанализатора 7, многоканальный выход которого соединен с многоканальным (первым) входом процессорного блока 8. Второй и третий входы процессорного блока 8 соединены соответственно с первым и вторым выходами формирователя 9 сигнала пульсовой волны. Четвертый вход процессорного блока 8 соединен с выходом 6.2 оптического коммутатора 3, а первый выход процессорного блока 8 соединен с управляющим входом 6.1 оптического коммутатора 3.
Комбинированный источник 1 света выполнен с возможностью формирования на его выходах 2.1-2.N оптического излучения в спектральных интервалах, соответствующих возбуждению люминесценции всех подлежащих исследованию тканевых флюорофоров. В предпочтительном варианте осуществления изобретения (для исследования основных тканевых флюорофоров, а именно: триптофана, коллагена, эластина, порфиринов, флавинов, НАД и НАД-Н) комбинированный источник 1 света содержит ксеноновую или дейтериевую лампу с комбинированным оптическим фильтром, пропускающим оптическое излучение в спектральном интервале 200-240 или 265-3ОО нм. Здесь необходимо отметить, что комбинированные интерференционно-абсорбционные оптические фильтры представляют собой комбинацию из узкополосного интерференционного фильтра и по крайней мере двух абсорбционных фильтров, устраняющих соответственно коротковолновые и длинноволновые побочные полосы пропускания узкополосного интерференционного фильтра (см., например, Н.А.Борисович и др. Инфракрасные фильтры. Минск: Наука и техника, 1971, с.210-212). Оптическое излучение в спектральном интервале 200-240 нм с помощью соответствующей фокусирующей системы направляется на первый выход 2.1.
Комбинированный источник 1 света содержит также галогенную лампу с излучением в диапазоне от 400 до 900 нм (или светодиод с излучением в диапазоне 470-490 нм, снабженную комбинированным интерференционно-абсорбционным оптическим фильтром, пропускающим оптическое излучение в спектральном интервале 470-490 нм, которое с помощью соответствующей фокусирующей системы направляется на соответствующий выход комбинированного источника света 1. Кроме того, комбинированный источник 1 света содержит, во-первых, лазер или светодиод, излучающий в диапозоне 500-514 нм, с соответствующим комбинированным интерференционно-абсорбционным оптическим фильтром, при этом излучение, прошедшее оптический фильтр с помощью соответствующей фокусирующей системы, направляется на другой выход, а во-вторых, лазер с длиной волны излучения 632.8 нм и соответствующим комбинированным интерференционно-абсорбционным оптическим фильтром (для подавления излучения паразитных мод лазера).
Оптический коммутатор 3 содержит прямоугольную призму 14 (полную или усеченную со стороны прямого угла, как показано на чертежах, с отражающими покрытиями на катетных гранях (фиг.1-3) и призму 15 ромб (с углами 45 и 135° между соответствующими смежными гранями) с отражающими покрытиями на двух расположенных напротив друг друга гранях, при этом расстояние между осями входного и выходного световых пучков у обеих призм одинаково.
Грани с отражающими покрытиями призм 14 и 15 выполнены одинаковыми, при этом одна из катетных граней призмы 14 расположена вплотную с одной из граней с отражающим покрытием призмы 15. Призмы 14 и 15 жестко закреплены на втулке 16, установленной в подшипниках 17 с возможностью вращения вокруг оси 18 и связанной с шаговым приводом 19, управляющий вход которого является электрическим управляющим входом 6.1 оптического коммутатора 3. Ось 18 проходит через точку пересечения диагоналей расположенных вплотную друг к другу граней призм 14 и 15 и перпендикулярна гипотенузой грани призмы 14.
Торцы волоконных световодов 10.1-10.N состыкованы с соответствующими торцами соответствующих коллиматоров 4.1-4.N, оси которых параллельны оси 18. Коллиматоры 4.1-4.N установлены по окружности с центром на оси 18 и с радиусом R, равным расстоянию между осями входного и выходного световых пучков призм 14 и 15, и под одинаковым углом относительно друг друга, равным N.
Коллиматоры 5.1 и 5.2 расположены соосно оси 18 напротив друг друга одноименными торцами и по обе стороны относительно плоскости вращения призм 14 и 15. При этом торец первой передающей оптико-волоконной линии 11 состыкован с соответствующим торцом коллиматора 5.1, а торец второй передающей оптико-волоконной линии 12 состыкован с соответствующим торцом коллиматора 5.2.
Оптический коммутатор 3 снабжен также датчиком 20 углового положения призм 14 и 15, например оптоэлектронного в виде N оптоэлектронных пар 21, светоизлучающие и фотоприемные элементы которых оптически сопряженны между собой через обращенные в противоположные стороны грани призм 14 и 15, на которые в этом случае нанесены двухсторонние отражающие покрытия.
Выходы фотоприемных элементов оптоэлектронных пар 21 подключены к соответствующим входам формирователя 22 кодового цифрового сигнала, выход которого является электрическим выходом 6.2 оптического коммутатора.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения концы оптических волокон 13.1 первого канала приемной оптико-волоконной линии 13 объединены с концами оптических волокон первой передающей оптико-волоконной линии 11 в общий жгут. Аналогично концы оптических волокон 13.2 второго канала приемной оптико-волоконной линии 13 объединены с концами оптических волокон второй передающей оптико-волоконной линии 12 в соответствующий общий жгут (фиг.1)
Оптико-электронный спектороанализатор 7 выполнен с возможностью выделения спектральных компонент излучения люминесценции, соответствующего каждому исследуемому тканевому флюорофору, и формирования электрического сигнала, соответствующего каждой выделенной спектральной компоненте. В предпочтительном варианте осуществления изобретения оптикоэлектронный спектроанализатор 7 выполнен М-канальным.
Каждый канал (23.1-23.М) включает последовательно расположенные вдоль соответствующей оптической оси коллимирующий оптический элемент (24.1-24.М), комбинированный интерференционно-абсорбционный оптический фильтр (25.1-25.М, пропускающий излучение, соответствующее одной спектральной компоненте, фокусирующий оптический элемент (26.1-26.М), фотопреобразователь (27.1-27.М), подключенный своим выходом ко входу электронного усилителя (28.1-28.М). Выходы электронных усилителей (28.1-28.М) являются многоканальным выходом оптико-электронного спектроанализатора 7. В принципе оптико-электронный спектроанализатор 7 может быть выполнен и по одноканальной схеме, аналогичной описанной в прототипе, с использованием М сменных комбинированных интерференционно-абсорбционных оптических фильтров, равномерно по окружности закрепленных на диске, который установлен с возможностью вращения вокруг своей оси. Однако в этом случае увеличивается не только время измерений, но и усложняется схема устройства за счет введения дополнительного датчика углового положения сменных оптических фильтров и соответствующего драйвера.
В качестве процессорного блока 8 используется системный блок персонального компьютера, к интерфейсу которого могут быть подключены клавиатура (для ручного запуска необходимых программ), монитор и/или принтер (для регистрации результатов измерений), а также модем.
Формирователь 9 сигнала пульсовой волны в предпочтительном варианте осуществления изобретения выполнен в виде двух оптоэлектронных датчиков насыщенности крови кислородом (см., например, Окоси Т. и др. Волоконно-оптические датчики. Л.: Энергоатомиздат, 1991, с.154). Каждый оптоэлектронный датчик насыщенности крови кислородом снабжен соответствующим оптико-волоконным жгутом 29.1 и 29.2, концы которых (в предпочтительном варианте) объединены соответственно с концами первого канала приемной оптико-волоконной линии 13 и первой передающей оптико-волоконной линии 11, а также с концами второго канала приемной оптико-волоконной линии 13 и второй передающей оптико-волоконной линии 12, в соответствующие общие оптико-волоконные жгуты. В качестве формирователя 9 сигнала, например, пульсовой волны могут быть использованы также и другие известные датчики, например датчики, принцип действия которых основан на измерении давления.
На фиг.1 (исследуемый участок биологического объекта обозначен позицией 30, а клинически интактный участок того же объекта - позицией 30.1. Ход оптических лучей показан линиями со стрелками.
Способ люминесцентной диагностики и/или качественной оценки состояния биологического объекта осуществляется следующим образом. В зависимости от конкретных особенностей диагностируемого биологического объекта определяют подлежащие исследованию (см. таблицу 1) флюорофоры. Затем на основании известных люминесцентных свойств каждого тканевого флюорофора определяют спектральные интервалы, соответствующие возбуждению люминесценции каждого из подлежащих исследованию флюорофоров, при этом желательно, чтобы каждый выбранный спектральный интервал оптического излучения обеспечивал возбуждение люминесценции только одного тканевого флюорофора. Так, для триптофанов - это спектральный интервал от 250 до 295 нм, для порфиринов 500-700 нм. Далее, опять на основании известных люминесцентных свойств каждого тканевого флюорофора, определяют спектральные компоненты излучения люминесценции, позволяющие идентифицировать каждый флюорофор при воздействии на него оптического излучения определенного спектрального состава. Так, для коллагена - это 320-335 нм, эластина (при возбуждении в нем люминесценции в спектральном интервале 385-390 нм) - это от 340 до 395 нм и т. д.
| Таблица 1 | ||
| Тканевый флюорофор | Спектральный интервал оптического излучения, возбуждающего люминесценцию тканевого флюорофора (нм) | Спектр люминесценции (им) |
| триптофан | 250-310 | 300-380 |
| коллаген | 300-380 | 320-440 |
| эластин | 310-390 | 340-450 |
| НАД(Н) | 300-450 | 400-500 |
| флавины | 350-440 | 500-600 |
| порфирины | 350-440 (Соре) | 600-800 |
| 500-700 |
После установки выбранных (как описано выше) оптических фильтров (предпочтительно комбинированных интерференционно-абсорбционных) в оптический канал, соответствующий каждому выходу 2.1-2.N комбинированного источника 1 света, а также в каждый канал 23.1-23.М оптико-электронного спектроанализатора 7 производят установку требуемого уровня мощности оптического излучения на каждом из выходов 2.1-2.N комбинированного источника 1 света, величину которого в процессе измерений поддерживают постоянной. После этого осуществляют воздействие на исследуемый участок биологического объекта оптическим излучением последовательно в выделенных спектральных интервалах, соответствующих люминесценции различных тканевых флюорофоров. Для этого на первом этапе измерений призмы 14 и 15 оптического коммутатора 3 устанавливают таким образом (фиг.1), чтобы оптическое излучение с выхода 2.1 комбинированного источника 1 света распространялось сначала по волоконному световоду 10.1 и коллиматору 4.1, затем, дважды отразившись от катетных граней прямоугольной призмы 14, перешло в коллиматор 5.1, а далее по первой передающей оптико-волоконной линии 11 поступило на исследуемый участок 30 биологического объекта. Информация о положении призм 14 и 15, а следовательно, о спектральном интервале оптического излучения, воздействующего на исследуемый участок 30, с выхода 6.2 поступает на четвертый вход процессорного блока 8. В результате воздействия оптического излучения (поступающего с выхода 2.1 комбинированного источника 1 света) на исследуемый участок 30 возбуждается люминесценция соответствующего тканевого флюорофора. Излучение люминесценции по оптическим волокнам 13.1 первого канала приемной оптико-волоконной линии 13 подает на вход оптико-электронного спектроанализатора 7, в котором осуществляется сначала выделение из излучения люминесценции спектральных компонент (в соответствии со спектральными областями пропускания комбинированных интерференционно-абсорбционных оптических фильтров 25.1-25М), а затем (с помощью фотопреобразователей 27.1-27.М и электронных усилителей 28.1-28.М) формирование электрических сигналов, соответствующих интенсивности каждой выделенной спектральной компоненты. Сигналы, соответствующие интенсивности каждой выделенной спектральной компоненты люминесцентного излучения, с многоканального выхода оптико-электронного спектроанализатора 7 поступают на первый вход процессорного блока 8. В течение всего процесса измерений на второй вход процессорного блока 8 поступает сигнал с первого выхода формирователя 9 сигнала пульсовой волны, при этом в процессорном блоке 8 осуществляется непрерывный контроль соответствующей фазы (например, максимума или минимума) пульсовой волны в зоне контролируемого участка 30. В момент появления заранее выбранной фазы пульсовой волны осуществляют запись в устройство памяти процессорного блока 8 сигналов с выходов только тех каналов (23.1-23.N) оптико-электронного спектроанализатора 7, комбинированные интерференционно-абсорбционные оптические фильтры которых обеспечивают выделение спектральных компонент, соответствующих только исследуемому на данном этапе измерений тканевому флюорофору. На этом первый этап измерений заканчивается и по сигналу, поступающему с первого выхода процессорного блока 8 на управляющий вход 6.1 оптического коммутатора 3, с помощью шагового привода 19 осуществляют поворот втулки 16, а следовательно, и закрепленных на ней призм 14 и 15 на угол π/N (фиг.2). В результате оптическое излучение с выхода 2.2 комбинированного источника 1 света, распространяясь сначала по волоконному световоду 10.2 и коллиматору 4.2, затем, дважды отразившись от катетных граней прямоугольной призмы 14, переходит в коллиматор 5.1, а далее по первой передающей оптико-волоконной линии 11 поступает на исследуемый участок 30 биологического объекта. Информация о новом положении призм 14 и 15, а следовательно, о спектральном интервале оптического излучения, воздействующего в этот момент на исследуемый участок 30 биологического объекта, с выхода 6.2 оптического коммутатора 3 поступает на четвертый вход процессорного блока 8. В результате воздействия на исследуемый 30 участок оптического излучения в другом спектральном интервале (с выхода 2.2 комбинированного источника 3 света) происходит возбуждение излучения люминесценции другого тканевого флюорофора. Излучение люминесценции на этом этапе измерений (так же, как и на первом этапе измерений) по оптическим волокнам 13.1 первого канала приемной оптико-волоконной линии 13 подает на вход оптико-электронного спектроанализатора 7, в котором осуществляются преобразования излучения люминесценции, аналогичные тем, которые осуществлялись (как описано выше) на первом этапе измерений. Аналогично осуществляют последующие этапы измерений люминесцентных параметров других тканевых флюорофоров на исследуемом участке 30.
По завершении N-го этапа измерений, проводимого на исследуемом участке 30 биологического объекта, очередной сигнал, поступающий на управляющий вход 6.1 оптического коммутатора 3, обеспечивает поворот призм 14 и 15 на очередной угол, равный π/N. Однако N дискретных поворотов призм 14 и 15 на угол π/N соответствуют повороту их на угол 180° по отношению к тому положению, которое они занимали во время проведения первого этапа измерений (фиг.1 и 3). В результате оптическое излучение с выхода 2.1 комбинированного источника 1 света с помощью призмы 15 ромб (фиг.3) направляется из коллиматора 4.1 в коллиматор 5.2, а далее по второй передающей оптико-волоконной линии 12 на клинически интактный участок 30.1 того же биологического объекта. Здесь необходимо отметить, что клинически интактный участок 30.1 выбирается на основании предварительных клинических исследований различных участков биологического объекта и выявления, с одной стороны, исследуемых участков (иными словами, с явными или неявно выраженными изменениями), а с другой стороны, участков биологического объекта, безусловно, не имеющих каких-либо патологических изменений, т.е. клинически интактных участков 30.1. В результате воздействия оптического излучения (поступающего с выхода 2.1 комбинированного источника 1 света) на клинически интактный участок 30.1 того же биологического объекта возбуждается люминесценция того же тканевого флюорофора, что и проведении описанного выше первого этапа измерений на исследуемом участке 30 биологического объекта. Излучение люминесценции по оптическим волокнам 13.2 второго канала приемный оптико-волоконный линии 13 попадает на вход оптико-электронного спекторанализатора 7, в котором осуществляется сначала выделение из излучения люминесценции от клинически интактного участка 30.1 биологического объекта спектральных компонент (в соответствии со спектральными областями пропускания установленных в каналах (23.1-23.М) комбинированных интерференционно-абсорбционных оптических фильтров (25.1-25.М)), а затем с помощью фотопреобразователей (27.1-27.М) и электронных усилителей (28.1-28.М) формирование электрических сигналов, соответствующих интенсивности каждой выделенной спектральной компоненты. Сигналы, соответствующие интенсивности каждой выделения спектральной компоненты люминесцентного излучения, с многоканального выхода оптико-электронного спектроанализатора 7 поступают на первый вход процессорного блока 8. В течение всего процесса измерений на третий вход процессорного блока 8 поступает также и сигнал со второго выхода формирователя 9 сигнала пульсовой волны. В процессорном блоке 8 осуществляется непрерывный контроль той же фазы пульсовой волны (что и на первых N этапах изменений), но только в зоне клинически интактного участка 30.1. В момент появления контролируемой фазы пульсовой волны осуществляют запись в устройство памяти процессорного блока 8 сигналов с выходов тех же каналов (23.1-23.М) оптико-электронного спектроанализатора 7, что и на описанном выше первом этапе измерений. Иными словами, с выходов тех каналов (23.1-23.М) комбинированные интерференционно-абсорбционные оптические фильтры которых обеспечивают выделение спектральных компонент, соответствующих только тому тканевому флюорофору, который исследовали выше на описанном выше первом этапе измерений. Запуск нужной программы считывания и запоминания сигналов, поступающих на первый вход процессорного блока 8, осуществляется по соответствующему сигналу, поступившему ранее на его четвертый вход с выхода 6.2 оптического коммутатора 3. На этом N+1 этап измерений заканчивается. Далее аналогично осуществляют последовательно воздействие на клинически интактный участок 30.1 биологического объекта оптическим излучением, поступающим с каждого из выходов 2.2-2.N комбинированного источника 1 света. При этом из излучения люминесценции, обусловленного воздействием на участок 30.1 оптического излучения, соответствующего каждому из спектральных интервалов на выходах 2.2-2.N комбинированного источника 1 света, выделяют и изменяют интенсивность тех же спектральных компонент люминесцентного излучения, что и при проведении соответствующего тому же спектральному интервалу оптического излучения этапу измерений на контролируемом участке 30 того же биологического объекта.
Для увеличения точности измерений N этапов измерений люминесцентных характеристик контролируемого участка 30 биологического объекта и N этапов изменений люминесцентных характеристик клинически интактного участка 30.1 осуществляют в циклической последовательности (каждый цикл из 2N измерений) с накоплением и усреднением соответствующих измерений.
Дополнительное повышение точности измерений может быть обеспечено за счет измерения люминесцентных характеристик участков 30 и 30.1 биологического объекта последовательно синхронно с различными фазами пульсационной волны (например, при максимуме и минимуме пульсовой волны) с последующим усреднением интенсивностей одних и тех же спектральных компонент излучения люминесценции, измеренных синхронно с различными фазами пульсационной волны.
В зависимости от конкретного выполнения устройства для осуществления предложенного способа люминесцентной диагностики состояния биологического объекта измерения люминесцентных характеристик синхронно с различными фазами пульсовой волны можно осуществлять также в процессе каждого этапа измерений, а именно: не изменяя параметры спектрального интервала оптического излучения, вызывающего люминесценцию соответствующего тканевого флюорофора (при неизменном положении призм 14 и 15 оптического коммутатора 3), последовательно с приходом каждой очередной пульсовой волны изменяют фазу, синхронно с которой осуществляют измерение интенсивности выделенных спектральных компонент люминесцентного излучения соответствующего участка. Об люминесцентных параметрах исследуемого участка биологического объекта судят по соотношению измеренных на обоих его участках (30 и 30.1) интенсивностей одинаковых спектральных компонент люминесценции, соответствующих одному и тому же спектральному интервалу оптического излучения, используемого для возбуждения излучения люминесценции. При этом проведение аналогичных измерений на двух участках одного и того же биологического объекта позволяет повысить точность измерений люминесцентных параметров исследуемого участка благодаря возможности учета, а следовательно, исключения влияния на результаты измерений не только артефактов (плотности биологического объекта, его рН, его температуры, а также других процессов, происходящих в такт с другими изменениями, например, тока биологических жидкостей), но и общесоматического состояния исследуемого биологического объекта.
Таким образом, повышается точность диагностики состояния исследуемого участка биологического объекта (которая осуществляется путем сравнения полученных результатов с известными и принятыми в качестве стандартных для диагностики того или иного патологического процесса) и, что особенно важно при наблюдении динамики происходящих в биологических объектах, связанных с их качеством или состоянием, процессов.
Изобретения могут быть использованы как для проверки качества пищевых продуктов, например, для идентификации продуктов виноделия, количественного определения флюоресцирующих веществ в биологическом объекте (вино) и качественной оценки состояния продукта в целом, так и для диагностики заболевания. В опытах были использованы метод и аппаратура ЛФД; в примерах представлены результаты проведения исследования на установке, по представленной методике. Все исследования проводили при одинаковых показателях эталонного образца (фторопласт) S2/S1≤1. Результаты представлены в виде поясняющих чертежей и таблиц.
Пример 1
В ходе проведения исследования получены собственные спектры флюоресценции различных сортов вин: Мерло, Кагор, Гранатовое, Черный монах, Алиготе, которые имеют по следующим показателям существенные различия: нормированная мощность флюоресценции S2/S1, амплитуда а1, а2, положение пиков на длине волны λ1, λ2. По указанным показателям одномоментно регистрируют различия свежих вин по ГОСТ и продуктов виноделия, которые подверглись воздействию различных условий при его производстве, хранении и реализации. См. фиг.4-8. В таблице 2 приведены амплитудно-спектральные характеристики различных продуктов виноделия.
| Таблица 2 | |||||||
| Амплитудно-спектральные характеристики флюоресценции вин. | |||||||
| Название биологического объекта | Положение пиков (λ1, λ2) флюоресценции на длине волны (им) и амплитуда (а1, а2) (от.ед.) | S2/S1-нормированная мощность флюоресценции (изменение мощности в %) | ΔQ (%) ошибка измерения | ||||
| λ1 | λ2 | а1 | а2 | ||||
| Мерло | свежее | 676 | 713 | 8,2 | 8,8 | 65,39 (100) | 4,3 |
| 1,5 мес. хран. | 676 | 713 | 6,5 | 7,9 | 48,66 (74) | 2,5 | |
| 7 мес. хран. | 676 | 713 | 4,9 | 5,1 | 37,92 (58) | 2,62 | |
| Замороженное 1,5 мес. хран. | 676 | 713 | 15,2 | 15,5 | 76,02 (116,25) | 0,8 | |
| Замороженное 7 мес. хран. | 676 | 713 | 7,9 | 7,3 | 42,05 (64,3) | 1,0 | |
| Кагор | свежее | 676 | 713 | 53 | 75 | 141,86 (100) | 0,8 |
| через сутки (присутствие воздуха) | 676 | 713 | 20 | 32 | 92,65 (65,31) | 0,8 | |
| через 5 суток (присутствие воздуха) | 676 | 713 | 12 | 21 | 78,94 (55,65) | 1,0 | |
| Гранатовое свежее | 676 | 713 | 3,8 | 5 | 36,32 (100) | 5,1 | |
| Черный монах свежее | 676 | 713 | 12,5 | 14 | 82,06 (100) | 3,2 | |
| Алиготе | Свежее | 676 | 713 | 0,5 | 0,6 | 2,38 (100) | 4,5 |
| 1,5 мес. хран. | 676 | 713 | 0,2 | 0,28 | 4,05 (170) | 4,8 | |
| 7 мес. хран. | 676 | 713 | 0,17 | 0,19 | 8,18 (343,7) | 5 |
Разработанная экспресс-технология контроля качества является наглядной, объективной и основана на принципе одномоментного сравнения амплитудно-спектральных характеристик флюоресценции нативного (неизменного) аттестованного объекта с объектом, подвергнутым воздействию неблагоприятных условий (температура, свет, воздух и т.д.) при его производстве, хранении и реализации. Различие результатов, характеризующих изменение указанных характеристик на 2-5% и более, свидетельствует о порче биологического объекта и/или наличии в нем патологического процесса, вызванного жизнедеятельностью микроорганизмов.
Пример 2
Также получены собственные спектры флюоресценции различных сортов сыров: Тильзитер, Мааздам, Сваля, Советский, Швейцарский (см. фиг.9-13). В таблице 3 приведены амплитудно-спектральные показатели флюоресценции вин.
Разработанная экспресс-технология контроля качества является наглядной, объективной и основана на принципе одномоментного сравнения амплитудно-спектральных характеристик флюоресценции нативного (неизменного) аттестованного объекта с объектом, подвергнутым воздействию неблагоприятных условий (температура, свет, воздух и т.д.) при его производстве, хранении и реализации.
| Таблица 3 | ||||
| Амплитудно-спектральные показатели флюоресценции сыров. | ||||
| Название сорта сыра | S2/S1 - нормированная мощность флюоресценции (изменение мощности в %) | ΔQ (ошибка измерения) | ||
| свежий | Тильзитер | 6,1(100) | 0,04 | |
| Мааздам | 9,32 (100) | 0,04 | ||
| Сваля | 7,72 (100) | 0,05 | ||
| Сроки хранения | Тильзитер | 6,1 (100) | 0,05 | |
| 2.12.03 | 6,57 (107) | 0,05 | ||
| 3.12.03 | 8,23 (135) | 0,04 | ||
| 4.12.03 | 9,18 (150) | 0,03 | ||
| 5.12.03 | 9,08 (149) | 0,04 | ||
| 8.12.03 | 15,23 (250) | 0,05 | ||
| Сваля | 7,72 (100) | 0,04 | ||
| 2.12.03 | 7,48 (97) | 0,05 | ||
| 3.12.03 | 7,57 (98) | 0,05 | ||
| 4.12.03 | 7,6 (98,5) | 0,05 | ||
| 5.12.03 | 8,95 (116) | 0,05 | ||
| 8.12.03 | 11,32 (146,6) | 0,05 | ||
| Способ измерения | Без пленки | 15,9 (206) | 0,06 | |
| Через пленку | 15,8 (204) | 0,06 | ||
| Условия хранения | Сваля | Холодильник | 7,5 (97) | 0,05 |
| Комн. темпер. | 14,9 (193) | 0,05 | ||
| Советский | Холодильник | 7,65 (109) | 0,04 | |
| Комн. темпер. | 16,2 (231) | 0,05 | ||
| Швейцарский | Холодильник | 6,07 (104) | 0,05 | |
| Комн. темпер. | 23,08 (395) | 0,04 |
Полученные результаты оцениваются аналогично примеру 1. Различие результатов, характеризующих изменение указанных характеристик на 2-5% и более, свидетельствует о порче исследуемого биологического объекта и/или наличии в нем патологического процесса, например, вызванного жизнедеятельностью микроорганизмов.
Пример 3
Экспресс-определение чувствительности бактерий гнойного отделяемого к антибиотикам (линкомицин, гентамицин) показано на фиг.14-16.
Разработанная экспресс-технология контроля качества является наглядной, объективной и основана на принципе одномоментного сравнения амплитудно-спектральных характеристик флюоресценции нативного (неизменного) аттестованного объекта с объектом, подвергнутым воздействию неблагоприятных условий (температура, свет, воздух и т.д.).
Пример 4
Экспресс-определение состояния микрофлоры гнойного отделяемого методом ЛФД показано на фиг.17-20.
Высокая чувствительность метода позволяет объективно оценивать процесс реабилитации больного с флегмоной. Разработанная экспресс-технология контроля качества является наглядной, объективной и основана на принципе одномоментного сравнения амплитудно-спектральных характеристик флюоресценции нативного (неизменного) аттестованного объекта с объектом, подвергнутым воздействию неблагоприятных условий (температура, свет, воздух и т.д.).
Пример 5
Экспресс-определение выраженности дисбиоза желудочно-кишечного тракта методом ЛФД показано на фиг.21-23.
Высокая чувствительность метода позволяет определять ранние признаки дисбиоза желудочно-кишечного тракта, например, по снижению мощности флюоресценции. Разработанная экспресс-технология контроля качества является наглядной, объективной и основана на принципе одномоментного сравнения амплитудно-спектральных характеристик флюоресценции нативного (неизменного) аттестованного объекта с объектом, подвергнутым воздействию неблагоприятных условий (температура, свет, воздух и т.д.).
Пример 6
Экспресс-диагностика выраженности внелегочного туберкулеза (ВТ) по специфической флюоресценции плазмы крови.
Разработанная экспресс-технология позволяет в реальном времени с воспроизводимостью 96,7% говорит о наличии патологического процесса (ВТ), эффективности его лечения и завершении процесса реабилитации (выздоровление) (фиг.24-27).
Представленные примеры свидетельствуют о широком диапазоне возможности методики при исследовании различных биологических объектов (гнойное отделяемое, вино, сыр, фекалии и др.). Одномоментное измерение объектов исследования (аттестованного клинико-лабораторной методикой или по ГОСТу и исследуемого образца на различных этапах его изготовления, хранения, реализации и применения) повышает точность измерения, сокращает сроки исследований, значительно снижает влияние возмущающих факторов (экзо- и эндогенного характера) на конечный результат, что делает его более объективным.
Предлагаемые способ и устройства для люминесцентной диагностики и/или качественной оценки состояния биообъекта может быть применено в различных областях, в том числе и для диагностики различных заболеваний, в том числе внелегочного туберкулеза, онкологических. При этом устройство для осуществления способа имеет простую конструкцию и предполагает использование современных комплектующих элементов, серийно освоенных промышленностью.
1. Способ люминесцентной диагностики и/или качественной оценки состояния биологического объекта, согласно которому воздействуют на исследуемый участок биологического объекта оптическим излучением последовательно в спектральных интервалах, соответствующих возбуждению люминесценции различных, содержащихся в объекте флюорофоров биологического объекта, при этом из излучения люминесценции, обусловленного воздействием на исследуемый участок биологического объекта оптического излучения, соответствующего каждому из упомянутых выше спектральных интервалов, выделяют соответствующие спектральные компоненты и измеряют их интенсивность, отличающийся тем, что осуществляют непрерывный контроль соответствующей фазы и/или пульсации волны биологического объекта и измеряют люминесцентные характеристики его интактного участка путем воздействия на этот участок биологического объекта оптическим излучением последовательно в тех же спектральных интервалах, что и при воздействии на его контролируемый участок, затем из излучения люминесценции, обусловленной воздействием на интактный участок биологического объекта оптического излучения, соответствующего каждому из упомянутых выше спектральных интервалов, выделяют те же спектральные компоненты, которые выделяют из соответствующих излучений люминесценции исследуемого участка биологического объекта, при этом интенсивность выделенных спектральных компонент люминесцентных излучений обоих участков биологического объекта измеряют синхронно с соответствующей фазой нативного состояния и/или пульсационной волны в области соответствующего участка биологического объекта, а о качественных изменениях люминесцентных параметров исследуемого участка биологического объекта судят по соотношению измеренных на обоих его участках, т.е. исследуемом и интактном, интенсивностей одинаковых спектральных компонент люминесцентных излучений, соответствующих одному и тому же спектральному интервалу оптического излучения, используемого для возбуждения излучения люминесценции.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измерение люминесцентных характеристик контролируемого участка и клинически интактного участка биологического объекта осуществляют в циклической последовательности.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что измеряют люминесцентные характеристики контролируемого участка и клинически интактного участка биологического объекта последовательно синхронно с различными фазами пульсационной волны с последующим усреднением интенсивностей одних и тех же спектральных компонент излучения люминесценции, измеренными синхронно с различными фазами пульсационной волны.
4. Устройство для люминесцентной диагностики биологического объекта, содержащее комбинированный источник света, первую передающую оптиковолоконную линию, приемную оптиковолоконную линию, оптикоэлектронный спектроанализатор, подключенный своим входом к выходу приемной оптиковолоконной линии, а своим выходом - к первому входу процессорного блока, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит оптический коммутатор с N оптическими входами и с двумя оптическими выходами, а также вторую передающую оптиковолоконную линию, и формирователь сигнала пульсовой волны, комбинированный источник света выполнен с N выходами, которые соответствуют оптическим излучениям различного спектрального состава, при этом каждый выход комбинированного источника света посредством соответствующего волоконного световода соединен с соответствующим оптическим входом оптического коммутатора, первая и вторая передающие оптиковолоконные линии подключены соответственно к первому и второму оптическим выходам оптического коммутатора, который включает прямоугольную призму с отражающими покрытиями на одинаковых катетных гранях, призму ромб с углами 45° и 135° между смежными гранями и с отражающими покрытиями на двух расположенных напротив друг друга гранях, при этом грани призм с отражающими покрытиями выполнены одинаковыми, а одна из катетных граней прямоугольной призмы расположена вплотную с одной из граней с отражающим покрытием призмы ромб, призмы установлены с возможностью поворота посредством привода вокруг оси, проходящей через точку пересечения диагоналей расположенных вплотную друг к другу граней призм и перпендикулярной гипотенузой грани прямоугольной призмы, оптические входы оптического коммутатора размещены под одинаковым углом π/N относительно друг друга по окружности с центром, лежащим на оси поворота призм, и с радиусом, равным расстоянию между осями входного и выходного световых пучков, которое у обеих призм одинаково, оптические выходы оптического коммутатора расположены соосно оси вращения призм, напротив друг друга и по обе стороны относительно плоскости поворота призм, вход привода призм является управляющим входом оптического коммутатора, который включает также датчик углового положения призм, выход которого является электрическим выходом оптического коммутатора, приемная оптиковолоконная линия выполнена двухканальной, формирователь сигнала пульсовой волны также выполнен двухканальным, при этом его первый и второй выходы подключены соответственно ко второму и третьему входам процессорного блока, четвертый вход которого соединен с электрическим выходом оптического коммутатора, управляющий вход которого подключен к первому выходу процессорного блока.
