Способ определения структуры многоатомной молекулы

Использование: для изучения атомной структуры молекулы белка. Сущность: заключается в том, что особенностью изобретения является возможность перемещения источника зондирующих частиц и/или подложки или иглы на заданное расстояние с линейным дискретом до 0,01 нанометра и угловым дискретом до 10^-3 угловых секунд с помощью прецизионного позиционера, обладающего необходимым числом степеней свободы и позволяющего осуществлять угловые и линейные перемещения на расстояния, по меньшей мере, соответствующие размерам исследуемой молекулы, и фиксация в каждом положении распределения упругорассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам с помощью матричного полусферического анализатора. Восстановление рассеивающих центров, которыми являются атомы исследуемой молекулы, возможно расчетным путем по пространственной индикатрисе рассеяния зондирующих частиц или по интерференционной картине, возникающей в результате взаимодействия первичного пучка зондирующих частиц и упругорассеянных зондирующих частиц. Технический результат: повышение достоверности определения структуры многоатомной молекулы. 2 н.п. и 10 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к области структурного анализа, основанного на исследовании рассеянных образцом зондирующих частиц, и может быть использовано для изучения атомной структуры молекулы белка.

В настоящее время изучение структуры белков проводится, в основном, методами классического рентгеноструктурного анализа.

Это требует:

во-первых, разработки методов кристаллизации белков с целью получения кристаллических образцов для рентгеноструктурного анализа;

во-вторых, изучения кристаллов исследуемых белков;

в третьих, разработки методов расчета трехмерной структуры таких кристаллов по рентгенограммам, полученным в процессе рентгеноструктурного исследования, и дальнейшей ее верификации.

Сама по себе проблема кристаллизации белков отнюдь не является тривиальной. Кроме того, не все белки позволяют осуществить кристаллизацию, а в ряде случаев для получения кристаллов приходится добавлять вещества, позволяющие осуществить кристаллизацию, и избавляться от каких-то составляющих белков, которые препятствуют кристаллизации (например, от \жирных хвостов\). Таким образом, уже сам по себе процесс получения кристаллических образцов белков приводит к искажению структуры реального белка (в том числе и белка, существующего в растворе).

Известны способы определения структуры многоатомной молекулы жидкостей, газов и паров путем электронографии, в котором исследуемую молекулу фиксируют на проницаемой для падающего на молекулу исходного пучка зондирующих частиц подложке или игле, создают исходный пучок зондирующих частиц, направляют его на молекулу, фиксируют распределение упругорассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам с помощью матричного полусферического анализатора (Физическая энциклопедия, под ред. А.М.Прохорова, т.5, М., Научное издательство \Большая Российская энциклопедия\, 1998, с.584, 585).

В качестве зондирующих частиц используют электроны. При прохождении через исследуемую молекулу электроны, обладающие волновыми свойствами, взаимодействуют с атомами, в результате чего образуются дифрагированные пучки, интенсивность и расположение которых связаны с атомной структурой образца и другими структурными параметрами. Рассеяние электронов определяется электростатическим потенциалом атомов, максимумы которого соответствуют положениям атомных ядер.

Интенсивное взаимодействие электронов с веществом ограничивает толщину просвечиваемых ими образцов величиной порядка микрометра.

При многократном неупругом рассеянии возникают вторичные дифракционные картины от дифрагированных пучков.

В основе определения элементарной кристаллической ячейки и симметрии кристалла лежит измерение расположения рефлексов на электронограммах.

Известные способы позволяют определять структуру молекул с числом атомов до 10-20, а также характер их тепловых колебаний в широком интервале температур.

Основным недостатком известных способов является трудность выделения взаимодействия зондирующих электронов с ядрами атомов исследуемой молекулы и внутренними их электронами на общем фоне рассеяния зондирующих электронов при их взаимодействии с внешними электронами оболочки атомов.

Основной задачей изобретения является достоверное определение структуры многоатомной молекулы, в том числе реального белка.

Физическая суть предлагаемых способов основывается на следующих соображениях.

При рентгеновском исследовании структуры белковых молекул использование кристаллизованного белка в качестве образца для рентгеноструктурного анализа связано с необходимостью получения достаточно интенсивного сигнала, формируемого за счет рассеяния рентгеновских фотонов на многочисленных атомных плоскостях, в которых расположение атомов, составляющих изучаемую белковую молекулу, идентично. Это приводит к суммированию сигнала от каждой плоскости. Сечение рассеяния рентгеновского фотона на атомах достаточно мало, поэтому и требуется строго периодическая кристаллическая структура, позволяющая суммировать очень малый сигнал от атомов, идентично расположенных в многочисленных кристаллографических плоскостях. Столь малое сечение взаимодействия, с другой стороны, требует использования интенсивных рентгеновских пучков и достаточно длительных экспозиций, что, в свою очередь, вызывает разрушение исследуемого образца.

Вследствие корпускулярно-волнового дуализма, электроны аналогично рентгеновским фотонам будут рассеиваться на атомах белковой молекулы. Однако эффективное сечение рассеяния электрона на атоме благодаря наличию у него заряда, будет на 6-8 порядков больше эффективного сечения рассеяния рентгеновского фотона на таком же атоме, т.е. принципиально становиться возможным зарегистрировать индивидуальный акт рассеяния электрона на атоме белковой молекулы. Если учесть, что при таком акте могут быть зарегистрированы как энергия, так и угол отклонения (т.е. импульс) рассеянного электрона, то это позволит получить координаты рассеивающего центра, т.е. восстановить по картине рассеяния электронов топографию рассеивающих центров, а следовательно, и трехмерную структуру белковой молекулы. Процедура расчета координат рассеивающего центра близка к процедуре расчета, используемой в рентгеноструктурном анализе и газовой электронографии.

Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения является возможность определения рассеяния зондирующих частиц практически любым из атомов исследуемой молекулы, которая может состоять из большого числа атомов (порядка 10⁶ атомов), что позволит наиболее точно восстановить топографию рассеивающих центров, которыми являются атомы исследуемой молекулы.

Технический результат обеспечивается тем, что в способе определения структуры многоатомной молекулы, в котором исследуемую молекулу фиксируют на проницаемой для падающего на молекулу исходного пучка зондирующих частиц подложке или игле, создают исходный пучок зондирующих частиц, направляют его на молекулу, фиксируют распределение упругорассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам с помощью матричного полусферического анализатора, согласно изобретению один или более раз перемещают источник зондирующих частиц и/или подложку или иглу на заданное расстояние с линейным дискретом до 0,01 нанометра и угловым дискретом до 10^-3 угловых секунд с помощью прецизионного позиционера, обладающего необходимым числом степеней свободы и позволяющего осуществлять угловые и линейные перемещения на расстояния, по меньшей мере, соответствующие размерам исследуемой молекулы, и в каждом положении фиксируют распределение упругорассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам с помощью матричного полусферического анализатора, по пространственной индикатрисе рассеяния зондирующих частиц рассчитывают пространственное расположение рассеивающих центров, которыми являются атомы исследуемой молекулы.

Указанный технический результат обеспечивается также и тем, что в способе определения структуры многоатомной молекулы, в котором исследуемую молекулу фиксируют на проницаемой для падающего на молекулу исходного пучка зондирующих частиц подложке или игле, создают исходный пучок зондирующих частиц, направляют его на молекулу, фиксируют распределение упругорассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам с помощью матричного полусферического анализатора, согласно изобретению один или более раз перемещают источник зондирующих частиц и/или подложку или иглу на заданное расстояние с линейным дискретом до 0,01 нанометра и угловым дискретом до 10^-3 угловых секунд с помощью прецизионного позиционера, обладающего необходимым числом степеней свободы и позволяющего осуществлять угловые и линейные перемещения на расстояния, по меньшей мере, соответствующие размерам исследуемой молекулы, и в каждом положении фиксируют распределение упругорассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам с помощью матричного полусферического анализатора, по интерференционной картине, возникающей в результате взаимодействия первичного пучка зондирующих частиц и упругорассеянных зондирующих частиц, рассчитывают пространственное расположение рассеивающих центров, которыми являются атомы исследуемой молекулы.

В качестве источника исходного пучка зондирующих частиц в обоих указанных вариантах могут быть использованы:

- источник монокинетических (монохроматических) электронов;

- источник монохроматизированных фотонов синхротронного излучения;

- источник фотонов отфильтрованного резонансного излучения пучка атомов;

- источник фотонов, возникающих при флюоресценции атомов;

- размещенная вблизи от исследуемой молекулы игла, например, из тяжелого металла, из которой вытягивают электроны электромагнитным полем или посредством облучения ее кончика сфокусированным пучком монокинетических электронов.

Для определения структуры многоатомной молекулы, например молекулы белка, ее располагают на тонкой органической пленке на подложке или игле, которые закрепляются на держателе, связанном с прецизионным позиционером, обладающим необходимым числом степеней свободы и позволяющим осуществлять угловые и линейные перемещения на расстояния, по меньшей мере, соответствующие размерам исследуемой молекулы.

Исходный пучок зондирующих частиц направляют на исследуемую молекулу.

Регистрация сигналов от исследуемой молекулы с поддерживающей пленкой и отдельно от нее позволит выделить с помощью разностного метода сигнал от исследуемой молекулы.

Для того чтобы узнать, как в пространстве расположены атомы или их ядра нужен \агент\, способный проникнуть под внешнюю оболочку молекулы, не слишком сильно возмущая ее общую структуру. С этой целью возможно, в первую очередь, использование рентгеновских и жестких УФ-фотонов, нейтронов и электронов. Использование фотонов связано с преодолением больших экспериментальных трудностей, из-за малого сечения рассеяния и большой вероятности радиационного поражения исследуемой молекулы. В случае использования нейтронов проблемой является то, что самое большое сечение рассеяния нейтронов у ядра водорода, а его в биологических системах слишком много, т.е. в биологической молекуле не учитывать многократное рассеяния нельзя. Кроме того, и это самое главное, сечение взаимодействия нейтронов с ядром, а тем более с материалами системы регистрации мало, а значит, эффективность регистрации крайне низка.

Наиболее перспективным представляется применение электронных пучков, в случае использования которых:

- рассеяние на внешних оболочках атома будет мало, и станет возможным зондирование достаточно глубоких оболочек;

- кинетическая энергия, переданная атому будет мала, т.к. масса электрона мала;

- в связи с тем, что пучки электронов хорошо фокусируются, не требуется вводить дополнительную \метку\, достаточно осветить сразу отдельную молекулу либо даже исследовать ее часть, не разрушая всю молекулу;

- представляется возможным исследования в углах 4π, поскольку существует и успешно применяется система регистрации рассеянных частиц (многоканальные пластины);

- эффективность регистрации рассеянных электронов близка к единице;

- просто управлять энергией исходного пучка;

- возможен переход к изучению неупругорассеянных частиц и к исследованию структуры внешних оболочек;

- существует достаточно хорошо развитая теория рассеяния электронов на атомах и возможность оперативной ее доработки в соответствии с проблемами, могущими возникнуть в ходе эксперимента.

С помощью матричного полусферического анализатора, состоящего из ячеек CCD-матрицы, перед которой расположена система сеток высокой прозрачности, позволяющая выделять электроны с энергией выше некоторой заданной, фиксируют распределение упругорассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам.

Возможность суперпрецизионной юстировки и перемещения исследуемой молекулы относительно зондирующего электронного пучка или источника исходного пучка зондирующих частиц относительно исследуемой молекулы позволяет изучать рассеяние электронов практически любым из атомов исследуемой молекулы, многократно возвращаясь к нему и изменяя необходимым образом взаимную ориентацию исследуемой молекулы и зондирующего электронного пучка.

По пространственной индикатрисе рассеянных зондирующих частиц известными методами рассчитывают пространственное расположение рассеивающих центров, которыми являются атомы исследуемой молекулы, т.е. восстанавливают ее топографию.

Наиболее интересная возможность исследования структуры белковых молекул связана с использованием \электронной голографии\. В этом случае в качестве опорного пучка используется зондирующий электронный пучок электронного просвечивающего сканирующего микроскопа (STEM), а в качестве исследуемого пучка - высокоэнергетичные электроны, упругорассеянные на ядрах атомов исследуемой молекулы. Благодаря возникающей интерференционной картине по фазе можно определить, какому именно атому из атомов данного типа принадлежит данный рефлекс, фиксируемый полусферическим анализатором упругорассеянных электронов. Тот факт, что высокоэнергетичные электроны будут упруго рассеиваться на атомных ядрах, должен в значительной степени снять проблему деструкции исследуемой молекулы в процессе изучения ее структуры. Благодаря наличию заряда вероятность регистрации каждого упругорассеянного высокоэнергетичного электрона практически равна 1, вследствие чего резко ослабляются требования к интенсивности зондирующего пучка, что также уменьшает вероятность деструкции исследуемой молекулы в особенности по сравнению с использованием интенсивного рентгеновского пучка, используемого обычно при исследовании белковых кристаллов.

Дополнительно необходимо отметить, что рассеяние электронов на атомах описывается как рассеяние на потенциалах нулевого радиуса с соответствующим образом выбранными параметрами в зависимости от рода атомов, являющихся центрами рассеяния (Ю.Н.Демков, В.Н.Островский \Метод потенциалов нулевого радиуса в атомной физике\, изд. ЛГУ, Ленинград, 1975). Рассеяние электронов на атомах рассчитывалось с помощью метода Борна и метода искаженных волн, достаточно подробно описанных в литературе (М.Гольдбергер, К.Ватсон \Теория столкновений\, изд. \Мир\, Москва, 1967, стр.276, 279, 53; Н.Мотт, Г.Месси \Теория атомных столкновений\, изд. \Мир\, 1969, стр.326, 385, 493, 534, 540; Y.Itikawa Phys. Rep. 143, №2 (1986) р.69-108).

1. Способ определения структуры многоатомной молекулы, в котором исследуемую молекулу фиксируют на проницаемой для падающего на молекулу исходного пучка зондирующих частиц подложке или игле, создают исходный пучок зондирующих частиц, направляют его на молекулу, фиксируют распределение упругорассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам с помощью матричного полусферического анализатора, один или более раз перемещают источник зондирующих частиц, и/или подложку, или иглу на заданное расстояние с линейным дискретом до 0,01 нм и угловым дискретом до 10^-3 угловых секунд с помощью прецизионного позиционера, обладающего необходимым числом степеней свободы и позволяющего осуществлять угловые и линейные перемещения на расстояния, по меньшей мере, соответствующие размерам исследуемой молекулы, и в каждом положении фиксируют распределение упругорассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам с помощью матричного полусферического анализатора, по пространственной индикатрисе рассеяния зондирующих частиц рассчитывают пространственное расположение рассеивающих центров, которыми являются атомы исследуемой молекулы.

2. Способ определения структуры многоатомной молекулы по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника исходного пучка зондирующих частиц используют источник монокинетических электронов.

3. Способ определения структуры многоатомной молекулы по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника исходного пучка зондирующих частиц используют источник монохроматизированных фотонов синхротронного излучения.

4. Способ определения структуры многоатомной молекулы по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника исходного пучка зондирующих частиц используют источник фотонов отфильтрованного резонансного излучения пучка атомов.

5. Способ определения структуры многоатомной молекулы по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника исходного пучка зондирующих частиц используют источник фотонов, возникающих при флюоресценции атомов.

6. Способ определения структуры многоатомной молекулы по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника исходного пучка зондирующих частиц используют размещенную вблизи от исследуемой молекулы иглу из тяжелого металла, из которой вытягивают электроны электромагнитным полем или посредством облучения ее кончика сфокусированным пучком монокинетических электронов.

7. Способ определения структуры многоатомной молекулы, в котором исследуемую молекулу фиксируют на проницаемой для падающего на молекулу исходного пучка зондирующих частиц подложке или игле, создают исходный пучок зондирующих частиц, направляют его на молекулу, фиксируют распределение упруго рассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам с помощью матричного полусферического анализатора, один или более раз перемещают источник зондирующих частиц и/или подложку или иглу на заданное расстояние с линейным дискретом до 0,01 нанометра и угловым дискретом до 10^-3 угловых секунд с помощью прецизионного позиционера, обладающего необходимым числом степеней свободы и позволяющего осуществлять угловые и линейные перемещения на расстояния, по меньшей мере, соответствующие размерам исследуемой молекулы, и в каждом положении фиксируют распределение упруго рассеянных зондирующих частиц по интенсивностям и углам с помощью матричного полусферического анализатора, по интерференционной картине, возникающей в результате взаимодействия первичного пучка зондирующих частиц и упруго рассеянных зондирующих частиц, рассчитывают пространственное расположение рассеивающих центров, которыми являются атомы исследуемой молекулы.

8. Способ определения структуры многоатомной молекулы по п.7, отличающийся тем, что в качестве источника исходного пучка зондирующих частиц используют источник монокинетических электронов.

9. Способ определения структуры многоатомной молекулы по п.7, отличающийся тем, что в качестве источника исходного пучка зондирующих частиц используют источник монохроматизированных фотонов синхротронного излучения.

10. Способ определения структуры многоатомной молекулы по п.7, отличающийся тем, что в качестве источника исходного пучка зондирующих частиц используют источник фотонов отфильтрованного резонансного излучения пучка атомов.

11. Способ определения структуры многоатомной молекулы по п.7, отличающийся тем, что в качестве источника исходного пучка зондирующих частиц используют источник фотонов, возникающих при флюоресценции атомов.

12. Способ определения структуры многоатомной молекулы по п.7, отличающийся тем, что в качестве источника исходного пучка зондирующих частиц используют размещенную вблизи от исследуемой молекулы иглу из тяжелого металла, из которой вытягивают электроны электромагнитным полем или посредством облучения ее кончика сфокусированным пучком монокинетических электронов.