Способ радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки для сцинтиграфических исследований
Владельцы патента RU 2290643:
Государственное учреждение Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Бактерии кишечной палочки метят радионуклидом путем инкубации культуры E.coli в растворе реагента "Пирфотех, 99mTc", культивирования бактерий с 99mТс-пертехнетатом и последующей очистки маркированных бактериальных клеток центрифугированием. Применение изобретения позволяет получить жизнеспособную культуру кишечной палочки с высокой удельной радиационной активностью, не содержащую свободный 99mTc-пертехнетат во внеклеточной среде. 7 ил., 3 табл.
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к нуклеарной диагностике, и может быть использовано для радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки, применяемых для сцинтиграфических исследований.
Известные способы радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки включают два этапа: метка бактериальных клеток радионуклидом и очистка культуры меченых бактерий от несвязанного радионуклида.
Так известен способ радионуклидной маркировки кишечной палочки, включающий культивирование Е.coli с 99mТс-пертехнетатом на питательной среде, содержащей агар. Для очистки культуры меченых бактерий от несвязанного радионуклида проводят диализ /1/.
Известный способ осуществляют следующим образом. На этапе метки бактериальных клеток в пробирку с питательной средой агар-агар однократно высевают Е.coli и вносят 99mТс-пертехнетат из расчета 92,5 МБк на 1 мл среды. Инкубацию проводят при 37°С в течение 24 ч, после чего выполняют смыв культуры меченых бактериальных клеток физиологическим раствором. На этапе очистки Е.coli от несвязанного радионуклида выполняют диализ взвеси меченых бактериальных клеток при помощи гемодиализатора CRS-12 (Gambro, Германия), со скоростью подачи диализирующего раствора 50-60 мл/мин на протяжении 13-15 мин.
В результате осуществления известного способа получают взвесь маркированной радионуклидом кишечной палочки с удельной активностью 0,27 (0,22-0,29) МБк/мл и содержанием несвязанного 99mТс-пертехнетата - 14,9 (11,2-15,2)%.
К недостаткам данного способа следует отнести низкую удельную активность взвеси маркированной радионуклидом кишечной палочки и недостаточную очистку от несвязанного радионуклида. Низкая удельная активность обусловливает низкий счет импульсов при проведении сцинтиграфии, что требует увеличения времени регистрации сцинтиграфических изображений и ограничивает возможности исследователя при динамическом исследовании распространения бактерий в организме экспериментального животного.
Кроме этого, низкая удельная активность маркированных бактерий требует введения большого объема взвеси меченых бактерий, что приводит к регистрации на сцинтиграммах обширного очага активности в месте введения, перекрывающего прилежащие органы и ухудшающего условия визуализации очагов со значительно меньшей активностью, которые, как раз, и отражают процессы распространения меченых бактерий. Неполное удаление, несвязанного с Е.coli 99mТс-пертехнетата, приводит к искажению результатов сцинтиграфии, так как наряду с распространением меченых бактерий, регистрируют и распространение радионуклида, не связанного с бактериальными клетками. Также к недостаткам данного способа относится высокая стоимость расходных материалов (диализные колонки) и трудоемкость процесса очистки взвеси маркированных бактерий от несвязанного радионуклида.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ радионуклидной маркировки кишечной палочки, включающий культивирование Е.coli с 99mТс-пертехнетатом на питательной среде агар-агар в анаэробных условиях с последующей очисткой от несвязанного радионуклида путем этапного диализа /2/.
Известный способ осуществляют следующим образом. На этапе метки бактериальных клеток радионуклидом в асептических условиях готовят емкости с питательной средой агар-агар объемом по 8 мл в каждой. Проводят посев Е.coli, культивируют в течение 24 ч в аэробных условиях при температуре 37°С и добавляют 3 мл 10% раствора глюкозы. Затем вносят 99mТс-пертехнетат из расчета 92,5 МБк на 1 мл среды с добавлением 2 мл 10% раствора альбумина и 5 мл физиологического раствора. Дальнейшую инкубацию проводят в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч. По завершении инкубации выполняют смыв культуры маркированных радионуклидом бактериальных клеток физиологическим раствором.
На этапе очистки для удаления несвязанного с Е.coli радионуклида выполняют этапный диализ физиологическим раствором при помощи гемодиализатора CRS-12 (Gambro, Германия) со скоростью подачи диализирующего раствора 50-60 мл/мин на протяжении 75 мин. Содержимое внутреннего и внешнего контуров диализной колонки подлежит обязательному радиометрическому контролю каждые 15 мин. Известный способ предусматривает 5 этапов диализа, из которых 4 основных и 5-й - контрольный для подтверждения эффективности очистки. В результате осуществления известного способа получают взвесь маркированной радионуклидом кишечной палочки удельной активностью 0,76 (0,67-0,8) МБк/мл с содержанием несвязанного 99mТс-пертехнетата - 5,2 (5,1-5,5)%.
К недостаткам известного способа (на этапе метки) относится низкая удельная активность получаемой взвеси меченых бактериальных клеток. Кроме этого, при механическом нагнетании бактериальной взвеси во внутренний контур диализной колонки (на этапе очистки) происходит частичное разрушение меченых бактериальных клеток, что приводит к снижению количества меченых бактерий и увеличению содержания свободного 99mТс-пертехнетата, высвобождающегося из разрушенных бактериальных клеток. Это приводит к тому, что взвесь меченых бактериальных клеток невозможно полностью очистить от несвязанного радионуклида - на завершающих этапах диализа в диализирующем растворе внешнего контура диализной колонки постоянно регистрируется минимальная активность (табл. №1).
| Таблица №1 Удельная активность и содержание несвязанного 99mТс-пертехнетата во взвеси маркированной радионуклидом кишечной палочки на этапах диализа (медиана, нижний и верхний квартили) | |||
| этап диализа, № | Удельная активность взвеси, маркированной радионуклидом Е.coli, (МБк/мл) | Активность диализирующего раствора (МБк) | Содержание несвязанного 99mТс-пертехнетата во взвеси Е.coli, маркированной радионуклидом (%) |
| 1 | 1,4 (1,3-1,5) | 70,5 (38,7-70,7) | 19,9 (19,7-20,3) |
| 2 | 1,1 (1,0-1,1) | 5,6 (5,6-5,9) | 13,1 (11,0-13,5) |
| 3 | 0,9 (0,8-0,9) | 2,8 (2,2-2,9) | 8,4 (7,3-8,7) |
| 4 | 0,76 (0,67-0,8) | 1,4 (1,3-1,6) | 5,2 (5,1-5,5) |
| 5 | 0,66 (0,55-0,73) | 0,8 (0,7-0,8) | 4,1 (3,8-4,4) |
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки, используемых для сцинтиграфических исследований.
Техническим результатом заявляемого решения является повышение удельной активности маркированных радионуклидом бактерий кишечной палочки и уменьшение содержания несвязанного радионуклида во взвеси меченых бактериальных клеток.
Технический результат заявляемого способа достигается тем, что способ радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки для сцинтиграфических исследований включает культивирование Е.coli с Tc99m-пертехнетатом на питательной среде, содержащей агар, при температуре 37°С в анаэробных условиях и последующую очистку культуры маркированных бактериальных клеток от несвязанного 99mТс-пертехнетата.
Отличие заявляемого способа заключается в том, что предварительно культуру Е.coli инкубируют в течение 60 мин в растворе реагента "Пирфотех, 99mTc" с содержанием сухого вещества 1,05-1,40 мг/мл.
Отличительным приемом заявляемого способа также является и то, что очистку проводят центрифугированием при 4000 об/мин, температуре 4°С, в 4 этапа, по 30 мин каждый.
Авторами заявляемого способа установлено, что предварительное инкубирование в течение 60 мин культуры Е.coli в растворе реагента "Пирфотех, 99mTc" с содержанием сухого вещества 1,05-1,40 мг/мл, позволяет увеличить связывание 99mТс-пертехнетата с клетками Е.coli и, таким образом, повысить удельную активность культуры меченых бактериальных клеток.
Культивирование бактерий в анаэробных условиях приводит к активации ферментативных систем бактериальной клетки, ответственных за поглощение и внутриклеточную преципитацию 99mТс-пертехнетата.
Указанные отличительные приемы заявляемого способа позволяют получать маркированную радионуклидом жизнеспособную кишечную палочку с удельной активностью - 13,4 (12,2-14,6) МБк/мл (р=0,011).
Предлагаемое авторами заявляемого способа 4-х этапное центрифугирование позволяет полностью удалить внеклеточный 99mТс-пертехнетат из взвеси меченых бактериальных клеток.
Получение маркированных радионуклидом бактерий кишечной палочки в виде растворимого осадка дает возможность ресуспензировать его до необходимого объема в соответствии с требованиями и условиями планируемого исследования.
Радионуклидная маркировка кишечной палочки по заявляемому способу впервые обеспечила возможность проведения сцинтиграфической оценки бактериальной транслокации у крыс, так как необходимым условием выполнения исследования у данных животных является использование малых объемов взвеси меченых бактерий с активностью, достаточной для регистрации сцинтиграфических изображений на протяжении 4 ч исследования.
Сопоставительный анализ заявляемого решения и прототипа показывает, что предлагаемый способ на этапе маркировки Е.coli отличается предварительным введением раствора реагента "Пирфотех, 99mTc" с содержанием сухого вещества 1,05-1,40 мг/мл, а на этапе очистки взвеси меченых бактерий от несвязанного радионуклида - проведением центрифугирования при 4000 об/мин, температуре 4°С, в 4 этапа, по 30 мин каждый.
Из приведенного сопоставительного анализа следует, что предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения "новизна".
Предлагаемый способ позволяет получить маркированную радионуклидом культуру кишечной палочки в виде растворимого осадка с удельной активностью 13,4 (12,2-14,6) МБк/мл при полном отсутствии несвязанного 99mТс-пертехнетата (табл. №2).
| Таблица №2 Удельная активность и содержание несвязанного 99mТс-пертехнетата на этапах центрифугирования взвеси Е.coli, маркированной радионуклидом по заявляемому способу (медиана, нижний и верхний квартили) | |||
| Этап центрифугирования, № | Удельная активность взвеси, маркированной радионуклидом Е.coli, (МБк/мл) | Активность супернатанта (МБк) | Содержание несвязанного 99mTc-пертехнетата во взвеси, маркированной радионуклидом Е.coli, (%) |
| 1 | 18,7 (17,5-19,2) | 67,6 (55,1-85,8) | 8,4 (7,7-10,5) |
| 2 | 15,8 (12,3-16,6) | 1,5 (1,3-2,0) | 1,2 (1,0-2,3) |
| 3 | 14,8 (13,6-15,5) | 0,19 (0,15-0,36) | 0,6 (0,4-0,8) |
| 4 | 13,4 (12,2-14,6) | 0,08 (0,05-0,12) | - |
| 5 | 12,5 (11,2-13,9) | - | - |
Предлагаемый способ обеспечивает достижение поставленного заявителем технического результата, а именно - повышение удельной активности маркированных радионуклидом бактерий кишечной палочки и уменьшение содержания несвязанного радионуклида во взвеси меченых бактериальных клеток.
Заявляемый способ позволяет получать маркированную радионуклидом кишечную палочку, используемую для сцинтиграфических исследований распространения бактерий при интроабдоминальной хирургической патологии в эксперименте. Высокая удельная активность получаемой взвеси меченых бактерий позволила авторам заявляемого способа использовать ее в объеме 1 мл. Это способствует улучшению условий регистрации очагов минимальной активности, отражающих распространение меченых бактерий, так как малый объем вводимой бактериальной взвеси не создает обширного очага активности в области введения и исключает избыточное растяжение кишки экспериментального животного, что не нарушает условий ее нормального физиологического состояния. Высокая степень очистки позволяет повысить точность получаемых результатов сцинтиграфии и исключить ошибочную трактовку, обусловленную распространением несвязанного радионуклида наряду с мечеными бактериями.
В результате проведенного анализа патентной и специальной литературы авторами установлено, что предлагаемый способ имеет признаки, отличающие его не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях медицины. Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию "изобретательский уровень".
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в ядерной и экспериментальной медицине. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами. Из изложенного следует, что заявляемое техническое решение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
На этапе метки бактериальных клеток радионуклидом в асептических условиях готовят емкости с питательной средой агар-агар объемом 8 мл в каждой. Проводят посев Е.coli и культивируют в течение 24 ч в аэробных условиях при температуре 37°С. Далее в пробирки с суточной бактериальной культурой вносят 10 мл раствора реагента "Пирфотех, 99mTc" с содержанием сухого вещества 1,05-1,40 мг/мл и инкубируют в течение 60 мин при температуре 37°С. Затем вносят 99mТс-пертехнетат из расчета 92,5 МБк на 1 мл среды и проводят инкубацию в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 24 часов. Анаэробные условия создают в микроанаэростатах с помощью бескислородных газовых смесей (пакетов "Gas Pak Plus").
На этапе очистки взвесь меченых бактериальных клеток центрифугируют со скоростью 4000 об/мин в течение 30 мин при температуре 4°С. По завершении центрифугирования надосадочную жидкость, содержащую несвязанный 99mТс-пертехнетат, удаляют, а осадок, содержащий осажденные бактериальные клетки, ресуспензируют в 10 мл физиологического раствора. Этап центрифугирования повторяют еще трижды. После каждого этапа центрифугирования проводят радиометрический контроль осадка и надосадочной жидкости. На последнем этапе осадок ресуспензируют в 1 мл физиологического раствора.
Проведение четырехкратного центрифугирования позволяет получить взвесь маркированной радионуклидом кишечной палочки с удельной активностью 13,4 (12,2-14,6) МБк/мл, не содержащую несвязанный 99mТс-пертехнетат.
Авторами заявляемого способа проведена сравнительная оценка радионуклидной маркировки кишечной палочки по предлагаемому способу и по способу-прототипу (табл. №3).
| Таблица №3 | |||
| Сравнение свойств маркированной радионуклидом кишечной палочки, полученной по заявляемому способу и способу-прототипу (медиана, нижний и верхний квартили) | |||
| Способ радионуклидной маркировки Е.coli | Значимость различий по критерию Манна-Уитни (р) | ||
| Заявляемый способ (n=6) | Способ-прототип (n=6) | ||
| Концентрация Е.coli в 1 мл препарата после 4-го этапа очистки (lg KOE) | 7,0 (6,0-7,0) | 7,0 (6,0-7,0) | 1,0 |
| Удельная активность маркированной радионуклидом Е.coli после 4-го этапа очистки (МБк/мл) | 13,4 (12,2-14,6) | 0,76 (0,67-0,8) | 0,011 |
| Процент содержания несвязанного 99mТс-пертехнетата после 4-го этапа очистки (%) | - | 5,2 (5,1-5,5) | 0,005 |
Таким образом, заявляемый способ позволяет получать маркированную радионуклидом жизнеспособную кишечную палочку с удельной активностью 13,4 (12,2-14,6) МБк/мл (р=0,011) и не содержащую свободный 99mТс-пертехнетат во внеклеточной среде (р=0,005).
Указанные характеристики маркированной радионуклидом кишечной палочки позволяют использовать ее для сцинтиграфических исследований транслокации жизнеспособных бактериальных клеток при интроабдоминальной хирургической патологии в эксперименте.
Возможность использования бактерий кишечной палочки, маркированных 99mТс-пертехнетатом по заявляемому способу, подтверждается примерами выполнения сцинтиграфических исследований.
Пример №1.
Наблюдение проведено на 10 крысах породы "Wistar" с моделированным перитонитом и установленным в просвет тонкой кишки катетером, по которому вводили взвесь культуры кишечной палочки, маркированной радионуклидом по заявляемому способу. Далее выполняли динамическую сцинтиграфию в течение 4 часов. По завершению исследования проводили эвтаназию животного и экстирпацию кишечника для удаления очага экранирующего органы забрюшинного пространства. Затем выполняли статическую сцинтиграфию в течение 15 минут. На динамических сцинтиграммах максимальную активность регистрировали в области введения кишечной палочки, маркированной радионуклидом. Экстраинтестинальные очаги активности регистрировали в проекции печени, сердца (фиг.1). На статических сцинтиграммах, выполненных после эвтаназии животного и экстирпации кишечника, регистрировали активность в проекции печени, сердца, почек, мочевого пузыря, мягких тканей (фиг.2). Очагов активности в проекции щитовидной и слюнных желез (органов, к которым тропен 99mТс-пертехнетат) зарегистрировано не было, что свидетельствовало о полной очистке культуры кишечной палочки, маркированной радионуклидом, от несвязанного 99mТс-пертехнетата. Динамику процесса бактериальной транслокации из просвета кишки в портальный и системный кровоток оценивали по кривым активность-время с области печени (фиг.3) и области сердца (фиг.4). Результаты исследования подтвердили закономерности распространения бактерий из просвета кишки при интроабдоминальной хирургической патологии, известные по данным литературы /3/.
Полученные данные свидетельствуют о возможности применения кишечной палочки, маркированной радионуклидом по заявляемому способу, для сцинтиграфических исследований.
Пример №2
Наблюдение проведено на 10 крысах породы "Wistar" с моделированным перитонитом и установленным в левое поддиафрагмальное пространство катетером, по которому вводили кишечную палочку, маркированную радионуклидом по заявляемому способу. Динамическую сцинтиграфию проводили в течение 4 часов. После эвтаназии животного выполняли санацию брюшной полости в области введения маркированной радионуклидом кишечной палочки для удаление очага активности, экранирующего органы забрюшинного пространства. Затем проводили статическую сцинтиграфию в течение 15 минут. При оценке динамических сцинтиграмм максимальную активность регистрировали в области введения кишечной палочки маркированной радионуклидом. Очаги активности регистрировали в проекции сердца, правой почки, мочевого пузыря, мягких тканей (фиг.5). При проведении статической сцинтиграфии после эвтаназии животного и санации брюшной полости очаги активности регистрировали в проекции печени, сердца, почек, мочевого пузыря, мягких тканей (фиг.6). Очагов активности в проекции щитовидной и слюнных желез - органов, к которым тропен 99mТс-пертехнетат зарегистрировано не было, что свидетельствует о полной очистке меченых бактерий от несвязанного радионуклида. Динамику процессов распространения бактерий из брюшной полости в системный кровоток оценивали по кривой активность-время в области сердца (фиг.7). Результаты исследования подтвердили закономерности бактериальной резорбции из брюшной полости при интроабдоминальной хирургической патологии, известные по данным литературы /3/.
Таким образом, заявляемый способ позволяет получить культуру маркированной радионуклидом кишечной палочки с высокой удельной активностью [13,4 (12,2-14,6) МБк/мл] и максимальной степенью очистки от несвязанного 99mТс-пертехнетата и обеспечить возможность ее использования для регистрации распространения бактерий при сцинтиграфических исследованиях.
Список литературы
1. Способ получения меченой радиопрепаратом Е.coli для исследования брюшинной резорбции в эксперименте: Заявка на изобретение №96122238/14(028770) РФ: МПК6 А 61 В 6/00 / К.А.Апарцин, А.В.Шелехов, Р.А.Виноградов и др. - 1996. - 11 с.
2. Кувшинов А.Г. Закономерности развития бактериальной транслокации при ранних ишемических и реперфузионных повреждениях тонкой кишки, вызванных острым нарушением магистрального кровотока: Автореф. дис.... канд. мед. наук: 14.00.27, 14.00.16 / ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2004. - 26 с. - прототип.
3. Григорьев Е.Г. Спленэктомия и бактериальная транслокация / Ю.М.Галеев, К.А.Апарцин, М.В.Прокопьев // Органосохраняющая хирургия селезенки. - Новосибирск: Наука, 2001. - С.140-154.
Способ радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки для сцинтиграфических исследований, включающий культивирование бактерий E.coli в аэробных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, внесение 99mТс-пертехнетата и инкубирование в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч и последующую очистку культуры маркированных бактериальных клеток от несвязанного 99mТс-пертехнетата, отличающийся тем, что перед добавлением 99mТс-пертехнетата в суточную культуру E.coli, инкубируемую в аэробных условиях, вносят раствор реагента "Пирфотех, 99mTc" с содержанием сухого вещества 1,05-1,40 мг/мл и инкубируют в течение 60 мин при температуре 37°С, а очистку проводят центрифугированием при 4000 об./мин, температуре 4°С, в 4 этапа по 30 мин каждый.
