Композиции на основе белков матрикса зубной эмали для модуляции иммунного ответа

Предложено применение препарата из активного вещества матрикса зубной эмали, выбранного из белков, представляющих собой энамелины, амелогенины, неамелогенины, обогащенные пролином неамелогенины, тафтелины и их смеси для производства фармацевтической композиции для профилактики или лечения системного воспаления и/или инфекции и соответствующий способ. Композиция защищает от тяжелого септического шока и полиорганной недостаточности, вызванной токсином или тяжелой системной инфекцией, а снижение уровней TNF и IL-6 свидетельствует об общей ремиссии. 2 н. и 50 з.п. ф-лы, 3 ил.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к применению препарата активного вещества матрикса зубной эмали, такого как амелогенин, процессированный продукт амелогенина или его метаболит, для производства фармацевтической композиции для модуляции иммунного ответа. Композицию можно использовать для профилактики и/или лечения состояния или заболевания у млекопитающего, характеризующегося наличием у млекопитающего дисбаланса его естественного иммунного ответа на внутренние и/или внешние стимулы. Как правило, указанное состояние может быть системным или местным, таким как системное и/или посттравматическое общее воспаление или аутоиммунное заболевание.

Предпосылки изобретения

Нормальной функцией иммунной системы является защита организма посредством атаки и разрушения чужеродных микроорганизмов таких, как бактерии и вирусы. В нормальных условиях они распознаются в качестве инвазивных агентов и таким образом обезвреживаются.

Ответственной за иммунный ответ индивидуума является лимфоидная система, которая представляет собой совокупность лимфоцитов, их предшественников и производных и всех поддерживающих клеток. При аномальных состояниях или дисбалансе иммунной системы она не способна реагировать и разрушать чужеродные микроорганизмы, ошибочно принимает собственные клетки и ткани за чужеродные и атакует их или неадекватно активируется по типу гиперчувствительности.

Иммунный ответ на антигенный агент, является ли он чужеродным антигеном или аутоантигеном, обычно характеризуется продукцией антител В-лимфоцитами и разрушением любых клеток, несущих данные антигены, Т-лимфоцитами или природными клетками-киллерами (NK). Однако дефекты лимфоидных В- или Т-клеток могут привести к развитию иммунодефицитных заболеваний или нарушению функции иммунного ответа. Дефицит или дефект иммунной системы может быть врожденным, т.е. возникнуть в результате мутации гена, или может быть приобретенным, например, в результате вирусной инфекции или в результате старения. Возникший таким образом дефект может приводить или не приводить к летальному исходу в зависимости от стадии дифференцировки стволовых клеток или лимфоцитов, на которой он происходит.

Помимо антигена для полной активации лимфоцитам необходимы лимфокины. Например, Т-хелперные клетки не пролифирируют, пока не получат сигналы от макрофагов, а Т-цитотоксические клетки, равно как и В-клетки, зависят от сигналов от Т-хелперных клеток и, возможно, также от макрофагов, для их полного развития. Для адекватного иммунного ответа необходимы скоординированные активности нескольких типов клеток, что означает, что модуляция экспрессии или активности лимфокинов потенциально оказывает положительное воздействие на побочные иммунные ответы.

После шоков, ожогов, обширных хирургических вмешательств или травматических повреждений функции иммунной системы могут быть гиперстимулированы, что выражается в системном, неизбирательном, интенсивном общем воспалении организма, в то время как другие функции резко угнетены. В случае, когда иммунный ответ хозяина является таким образом неконтролируемым, то разбалансированные состояния клеточной активации, которые наблюдаются, в последующем приводят к проявлению клинических состояний. Подобные состояния могут быть ответной реакцией острой фазы, общим воспалением, анергией, сепсисом, инфекцией или недостаточностью отдельных органов, и в конечном итоге могут привести к полиорганной недостаточности. Полиорганная недостаточность, или дисфункция, является наиболее распространенной причиной смерти в отделениях интенсивной терапии. В настоящее время терапия, направленная на профилактику или лечение неконтролируемого иммунного ответа, неспособна значительно изменить исход таких состояний.

Другими примерами разбалансированных состояний являются случаи, когда иммунная система атакует свой собственный организм. Данные ситуации различаются по природе антигена, который «запускает» атаку, а также механизмам и проявлению атаки. Часто данные реакции относят соответственно к аллергии, гиперчувствительности замедленного типа, аллотрансплантату и аутоиммунным реакциям.

Анергия представляет собой другое разбалансированное состояние, при котором организм не способен реагировать на введенный аллерген или антиген. Полагают, что анергия является результатом межклеточной передачи сигналов после взаимодействия Т-клеточного рецептора (TCR) и антигена пептидпредставляющего главного комплекса гистосовместимости (МНС) при отсутствии «костимулирующего» сигнала. Данный костимулирующий сигнал в норме присутствует на клеточной поверхности антигенпрезентирующих клеток (АРС).

Иммунная система модулирует свою функцию локально и системно. Например, гиперчувствительность замедленного типа может проявляться либо локально в характерной кожной реакции, либо в системной реакции, когда большие количества антигена поступают в кровяное русло, и которая характеризуется лихорадкой, недомоганием, болями в суставах и снижением числа циркулирующих лимфоцитов. В общем, воспаление определяется как локальная ответная реакция на повреждение клеток, в то время как общее воспаление или полиорганная недостаточность представляет системное воспаление.

После травмы моноциты и макрофаги немедленно гиперактивируются с очень интенсивным высвобождением провоспалительных цитокинов. Данное интенсивное высвобождение приводит к развитию общего воспаления с последующим существенным параличом функции клеток у большинства пациентов. Через 3-5 суток данное состояние преодолевается с помощью вновь поступивших моноцитов/макрофагов, у которых, возможно, отсутствует полный спектр активности, вследствие того, что они являются незрелыми. Кроме того, у пациентов также может протекать противовоспалительная стадия (синдром компенсаторной противовоспалительной ответной реакции) и иногда наблюдается смешанная реакция с наличием как про-, так и противовоспалительных компонентов (синдром смешанной антагонистической ответной реакции).

Таким образом, посттравматическое нарушение баланса опосредуемой клетками иммунной регуляции в основном возникает в результате одновременной атаки на направление дифференцировки моноцитов/макрофагов и Т-клетки, вызывая разобщение взаимодействия интактных клеток. Травматический стресс оказывает влияние не только на способность к адекватной и специфической деятельности каждого типа клеток, но также влияет на способность к регуляции и модулирующему контролю, которыми в норме обладают моноциты/макрофаги и Т-клетки по отношению друг к другу в ряде регуляторных путей. Данная потеря регуляторной функции происходит моментально в момент повреждения.

Известными цитокинами воспаления, которые вызывают вышеописанное первоначальное системное гипервоспаление, являются, например, фактор некроза опухолей α (TNF-альфа), интерлейкин-1 (IL-1), IL-6 и гамма-интерферон, которые могут взаимодействовать синергически с TNF-альфа. Результаты клинических испытаний, направленных на даун-регуляцию данных медиаторов, с использованием, например, антител против эндотоксина, TNF-альфа, антагонистов IL-1 или активирующего фактора тромбоцитов, оказались в равной степени разочаровывающими. Было установлено, что данные средства не только не проявляли регулирующего действия, но даже повышали смертность.

Кроме того, в стрессовых условиях легко запускается продукция и высвобождение моноцитами/макрофагами простагландина Е₂(PGE₂), который, возможно, является наиболее сильным эндогенным иммунным супрессором. PGE₂ представляет ингибитор митогенеза Т-клеток, экспрессии рецептора IL-2 и синтеза IgM-антител В-клетками. Посредством внутриклеточного повышения уровня цАМФ, PGE₂ также отрицательно регулирует синтез TNFα и IL-1 моноцитами/макрофагами. PGE₂ может также ингибировать синтез ТН₁-цитокинов (IL-2, IFNγ), но не синтез IL-4 ТН₂-клетками. Таким образом, секреция PGE₂ может изменить баланс в пользу ответа ТН₂-типа, приводя к «запуску» продукции от IgM к IgG1 и IgE В-клетками. Изменение баланса таким образом оказывает влияние на развитие ТН₁- или ТН₂-доминирующего ответа.

Традиционные средства и способы, используемые для регуляции иммунного ответа у пациента, часто приводят к проявлению нежелательных побочных реакций. Например, иммуносупрессоры, такие как циклоспорин А, азатиоприн и преднизон, используются для подавления иммунной системы пациента с аутоиммунным заболеванием или у пациентов, которым были пересажены трансплантаты. Однако подобные препараты подавляют общий иммунный ответ у пациентов, тем самым подавляя способность у пациента к проявлению иммунного ответа против возбудителей инфекционных заболеваний, не являющихся причиной возникновения первоначального заболевания. Вследствие подобных вредных побочных эффектов и значения в медицине регуляции иммунной системы средства и способы регуляции специфических компонентов иммунной системы были предметом изучения в течение многих лет.

Белки матрикса зубной эмали, присутствующие в матриксе зубной эмали, представляют наиболее хорошо известные предшественники зубной эмали. Перед образованием цемента белки матрикса зубной эмали откладываются на поверхности корней в апикальном конце развивающегося корня зуба. Отложенный матрикс зубной эмали является инициирующим фактором образования цемента. Кроме того, образование цемента само по себе связано с развитием периодонтальной связки и альвеолярной кости. Как было показано заявителями настоящей заявки, перед осуществлением настоящего изобретения белки матрикса зубной эмали могут, следовательно, способствовать периодонтальной регенерации посредством имитации естественному прикреплению в зубе (Gestrelius S., Lyngstadaas SP, Hammarströцm L. Emdogain - periodontal regeneration based on biomimicry. Clin. Oral Invest 4:120-125 (2000)).

Матрикс зубной эмали состоит из ряда белков, таких как амелогенин, энамелин, тафт-белок, протеазы и альбумин. Амелогенины, основные составляющие компоненты матрикса зубной эмали, представляют семейство гидрофобных белков, происходящих из одного гена посредством последующего альтернативного сплайсинга и контролируемого постсекреторного процессинга. Они остались высококонсервативными в ходе эволюции позвоночных и проявляют высокий общий уровень гомологии последовательностей среди исследованных высших позвоночных (> 80%). Фактически транскрипт гена амелогенина свиньи и человека различается только на 4% оснований. Так, белки матрикса зубной эмали, несмотря на происхождение от свиней, являются «своими» при попадании в организм человека и могут способствовать регенерации зубов у людей без «запуска» аллергических ответных реакций или других нежелательных реакций.

Белки матрикса зубной эмали и производные матрикса зубной эмали (EMD) были описаны ранее в патентной литературе, как способные к образованию твердой ткани (т.е. образованию эмали, патент США № 4672032 (Slavkin)), связыванию твердых тканей (EP-B-0337967 и EP-B-0263086) и заживлению ран, например, на коже и слизистой (заявка WO 99/43344).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на неожиданной находке, что активные вещества зубной эмали обладают способностью модулировать иммунные механизмы у млекопитающих. В данном случае иммуномодуляция определяется как повышение или снижение уровня иммунного ответа посредством различных специфических и неспецифических средств.

Таким образом, предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет собой применение активного вещества зубной эмали для производства фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения состояния у млекопитающего, где указанное состояние характеризуется дисбалансом иммунного ответа у указанного млекопитающего на иммуноген такой, как внешний или внутренний стимулирующий фактор.

«Дисбаланс иммунного ответа» может иметь место после шоков, ожогов, обширных хирургических вмешательств и/или травматического повреждения. Термин относится к ситуации/состоянию, при котором одна или более функций иммунной системы могут быть либо гиперстимулированы, что выражается в системном, неизбирательном, обширном воспалении, в то время как другие функции могут быть одновременно или независимо подавлены. Термин «дисбаланс иммунного ответа» относится к ситуации/состоянию, при котором иммунологический ответ хозяина не контролируется, и когда небалансированные состояния активации клеток, которые при этом наблюдаются, приводят к последующему проявлению клинических состояний. Подобные состояния могут быть реакцией в острой фазе, общим воспалением, анергией, шоком, сепсисом, инфекцией и/или недостаточностью органа, и в конечном итоге могут привести к полиорганной недостаточности.

Другими примерами «дисбаланса иммунного ответа» являются ситуации/состояния, при которых инертная иммунная система субъекта атакует свой собственный организм. Подобные ситуации различаются по природе антигена, который «запускает» атаку, и механизмам и проявлениям атаки. Часто данные реакции относят соответственно к аллергии, гиперчувствительности замедленного типа, аллотрансплантату и аутоиммунным реакциям.

Термин «дисбаланс иммунного ответа» может относиться как к местным, так и к системным ситуациям, описанным выше. Например, в общем воспаление определяется, как местный ответ на повреждение клеток, в то время как общее воспаление или полиорганная недостаточность представляют примеры системного воспаления.

В настоящем контексте термин «иммуноген» используется для описания любого фактора, который способен вызывать иммунный ответ. Он может представлять собой, например, токсин, грибок, паразит, вирус, бактерию, пыльцу, пыль, загрязняющую частицу, цитокин, гормон, стресс, хирургическую операцию, ожог, трансплантированный орган или кровь, тканевый трансплантат, шок, травму или чужеродный или собственный антиген.

Иммунологические реакции по типу гиперчувствительности представляют иммунные ответы, которые приводят к повреждению тканей или нарушению функции органов. Они подразделяются на пять типов (I-V) согласно механизму повреждения тканей, они принимают участие в развитии многих серьезных заболеваний и нарушений у людей, таких как анафилаксия, астма, пищевая аллергия, тяжелая псевдопаралитическая миастения и системная красная волчанка.

В одном воплощении настоящего изобретения активное вещество зубной эмали используется для производства фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения состоянии у млекопитающего, при котором, по меньшей мере, часть иммунной системы реагирует по типу гиперчувствительности на указанный иммуноген. В предпочтительном воплощении, по меньшей мере, часть иммунной системы указанного млекопитающего таким образом неизбирательно стимулирована.

Состояния, для которых выгодно изобретение, включают состояния, при которых дисбаланс иммунного ответа у указанного млекопитающего является локальным и/или системным. В настоящем контексте "системный" определяется как относящийся к или общий для системы, т.е. поражающий организм в целом, в противоположность местной реакции. Указанное состояние может представлять собой, например, аутоиммунное заболевание, выбранное из группы, состоящей из ревматоидного артрита, заболеваний кожи, аллергии, склероза, артериосклероза, рассеянного склероза, астмы, псориаза, волчанки, системной красной волчанки, сахарного диабета, тяжелой псевдопаралитической миастении, синдрома хронической усталости, фибромиалгии, болезни Крона, тиреоидита Хашимото, болезни Грейвса, болезни Аддисона, синдрома Гиллиана-Барре и склеродермы.

В настоящем контексте термин «аутоиммунное заболевание» относится к широкому ряду более чем 80 различных тяжелых хронических заболеваний. Аутоиммунные заболевания являются третьей основной категорией заболеваний в США после злокачественных опухолей и заболеваний сердца. 75-90% всех аутоиммунных заболеваний имеют место у женщин и, как правило, в детородном возрасте. Помимо органов аутоиммунные заболевания поражают также нервы, мышцы, кровь, соединительные ткани, желудочно-кишечную систему и все системы организма.

Причина аутоиммунных заболеваний полностью не известна или не понятна, однако полагается, что гормоны, наследственность и факторы окружающей среды играют основную роль в их причине и начале развития. Причины большинства данных заболеваний являются чисто индивидуальными и практически непредсказуемыми. Аутоиммунные заболевания не представляют полное нарушение механизма толерантности, а в большей степени отражают возникновение специфической ответной реакции на определенный собственный антиген.

Другие состояния, в равной степени предусмотренные для настоящего изобретения, характеризуются как системные воспаления и/или инфекции, и они могут быть связаны с травмой, ожогами, хирургической операцией, диализом, шоком и/или бактериальной или вирусной инфекцией. В предпочтительном воплощении изобретения системное состояние связано с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЕСМО), шока, синдрома системной воспалительной реакции (SIRS) сепсиса, полиорганной недостаточности, отторжения имплантата, такого как орган и/или протез, хирургической операции по поводу шунтирования сердца и легких, хронического воспаления, астмы и/или стресса, связанного с заболеванием легких, бактериальной инфекции, гангрены, инфекции мягких тканей и инфекции ран.

Некоторые тяжелые травмы, такие как обширная хирургическая операция, системное воспаление, ожоги или шок, могут привести к тяжелому нарушению иммунологической реактивности у пациента, клиническим последствием которого является высокая чувствительность индивидуума с травмой к возникновению тяжелой системной инфекции, которая может привести к обширному разрушению тканей и недостаточности органов.

В одном воплощении настоящего изобретения активные вещества зубной эмали используются таким образом для производства фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения состояния у млекопитающего, где, по меньшей мере, часть иммунной системы атакует молекулы, клетки или ткани организма, продуцировавшего их. В данном случае активные вещества зубной эмали используются для производства фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения состояния у млекопитающего, где состояние характеризуется как системное воспаление и/или инфекция.

При системном, неизбирательном, обширном воспалении части иммунной системы стимулированы, в то время как другие функции в комплексе опосредованного клетками иммунитета (CMI) в значительной степени подавлены. Нарушения иммунной системы как последствия травмы происходят в виде последовательности состояний активации клеток и внутри сложной очередности событий, которые еще не совсем хорошо понятны. Одним известным фактом является то, что травматический стресс вызывает разобщение взаимодействия интактных моноцитов с Т-клетками, которое связано с существенными изменениями в регуляции моноцитов и значительным подавлением функции Т-клеток. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения активные вещества зубной эмали используются таким образом для производства фармацевтической композиции для восстановления баланса во взаимодействии моноцитов с Т-клетками у пациента, т.е. для восстановления нормальной регуляции моноцитов и функции Т-клеток.

В настоящем контексте воспаление определяется как местная ответная реакция на повреждение клеток, для которого характерно расширение капилляров, инфильтрация лейкоцитов, краснота, жар, боль, отечность и/или потеря функции, и что в норме служит в качестве механизма начала элиминации вредных агентов и отторжения поврежденной ткани.

Активные вещества зубной эмали в настоящем изобретении используются для производства фармацевтической композиции для модуляции концепции активации Т-хелперных клеток у млекопитающих. Активное вещество зубной эмали, входящее в фармацевтическую композицию, в данном случае может модулировать уровень экспрессии, высвобождения и/или функцию меж- и/или внутриклеточных сигнальных соединений. Активное вещество зубной эмали, входящее в состав фармацевтической композиции, может альтернативно модулировать уровень экспрессии, высвобождения и/или функцию, по меньшей мере, одного цитокина, принимающего участие в механизме иммунитета у указанного млекопитающего или модулировать клеточный сигнальный путь, участвующий в механизме иммунитета у того же указанного млекопитающего.

Многие распространенные и клинически важные болезненные состояния, такие как ревматоидный артрит, астма, туберкулез, лепра, шистосомоз, хронический гепатит, тиреоидит и рассеянный склероз, представляют примеры хронического воспаления и его последствия. Хроническое воспаление может возникнуть в результате неспособности элиминировать возбудитель острого воспаления, от аутоиммунного ответа до собственного антигена, или может быть вызвано врожденным хроническим раздражителем низкой интенсивности, который присутствует. Оно характеризуется одновременным протеканием воспаления и восстановления, с притоком и активацией макрофагов, лимфоцитов и других клеток, «запущенных» скоординированным действием цитокинов и факторов роста. Предпочтительное воплощение настоящего изобретения включает применение активного вещества зубной эмали для производства фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики хронического воспаления.

Хроническое воспаление наиболее подходящим образом определяется как процесс, при котором практически не прекращающееся воспаление и пытающееся реализоваться заживление ткани восстановлением происходят одновременно. Несмотря на то, что часто оно просто определяется по времени протекания, например, при наличии очагов поражения в течение более 6 недель, его традиционно по продолжительности относят к хроническому, любое подобное определение в целом является произвольным. В некоторых случаях на микроскопическом уровне хроническое воспаление определяют по клеточной ответной реакции, хотя этот критерий бывает различным и вместе с тем не совсем надежным.

Характерные признаки данного процесса наилучшим образом оцениваются при его сравнении с острой воспалительной реакцией. В противоположность острому воспалению, при котором ответная реакция хозяина приводит к элиминации раздражителя, с последующей регенерацией или восстановлением затронутых тканей, хроническое воспаление в большей мере характеризуется одновременным проявлением воспаления и восстановления, чем последовательным протеканием этих процессов. Восстановление всегда является признаком хронического воспаления, поскольку оно связано с раздражителями, которые вызывают разрушение структуры тканей. Как правило, восстановление достигается врастанием грануляционной ткани, которая включает макрофаги, фибробласты и новые кровеносные сосуды.

Другие важные отличия между острым и хроническим воспалением относятся к относительному балансу между экссудацией и притоком клеток, а также типам клеток, которые преобладают в воспалительной ответной реакции. При хроническом воспалении, как правило, имеется менее выраженная экссудативная реакция и повышенный приток воспалительных клеток, что может сопровождаться местной клеточной пролиферацией. В противоположность острому воспалению, которое обычно характеризуется притоком большого количества нейтрофилов, при всех формах хронического воспаления преобладающими инфильтрующими клетками являются макрофаги. В зависимости от природы раздражителя в месте воспаления продуцируются различные профили медиаторов воспаления и факторов роста (в общем называемых цитокинами), приводя к развитию различных морфологических типов хронического воспаления.

Системные эффекты воспаления более выражены при хронических воспалительных заболеваниях, и они могут вносить существенный вклад в клинические последствия. Данные системные эффекты в значительной степени опосредуются цитокинами. В то время как наиболее типичными системными эффектами острого воспаления являются жар и лейкоцитоз, для хронического воспаления, как правило, характерны усталость, сонливость, потеря массы тела и истощение.

Когда состояние и/или заболевание, относящееся к настоящему изобретению, характеризуется как инфекция, то указанное состояние может быть вызвано обсеменением бактерией, выбранной, но не ограничиваясь этим, из группы, состоящей из грамотрицательных бактерий и грамположительных бактерий 1) G+: например, стафилококки и стрептококки, которые способны высвобождать эндотоксин пептидогликан (PepG), который является специфическим компонентом клеточной оболочки G+ бактерий. 2) G-: например, колиформы и другие бактерии, высвобождающие липополисахариды (LPS) из их внешней клеточной оболочки во время заражения. В данном случае иммунологическое состояние вызывается эндотоксином и/или экзотоксином, продуцированным инфицирующей бактерией.

В настоящем изобретении клеточные ответные реакции в крови человека, вызванные эндотоксинами из Staphylococcus aureus (PepG) и Escherichia coli (LPS), эффективно модулируются введением амелогенинов, как представлено в примере 1. Данные результаты четко показывают потенциальное модулирующее действие активных веществ зубной эмали на иммунный механизм у млекопитающих.

В другом опыте, проведенном заявителями и документально представленном в настоящей заявке в примере 2, при использовании модели сепсиса на свиньях, потенциальное терапевтическое действие производных матрикса зубной эмали исследуется в условиях in vivo.

EMD, даже при доставке в больших болюсах-инъекциях, как это показано в опыте 2, являются безопасными при системном введении в высоких дозах. Кроме того, в данном случае доказано, что системные инъекции производных матрикса зубной эмали нейтрализуют действие эндоксина (LPS) у свиней. В целом можно придти к заключению, что начало септического шока у обработанных свиней замедляется по сравнению с контрольными свиньями. Задержка зависит от дозы, доза 1 мг/кг массы тела приводит к непродолжительной задержке (примерно на 30 мин), в то время как доза 5 мг/кг защищает, или, по меньшей мере, достоверно замедляет (> 5 час), начало септического шока и связанную с ним полиорганную недостаточность.

Одним возможным механизмом, с помощью которого можно объяснить положительное действие производных матрикса зубной эмали в отношении индуцированного LPS шока, является то, что производные матрикса зубной эмали связывают LPS и таким образом инактивируют его токсическое действие. Другой, в равной степени предполагаемой возможностью, является то, что производные матрикса зубной эмали конкурируют с LPS за один и тот же рецептор(ы), например, на лейкоцитах, макрофагах, остеокластах и/или тучных клетках. Таким образом, предпочтительное воплощение изобретения относится к применению активного вещества зубной эмали для получения фармацевтической композиции, где указанное активное вещество зубной эмали инактивирует токсическое действие эндотоксина и/или экзотоксина, продуцированного микроорганизмом, непосредственным связыванием с указанным эндотоксином и/или экзотоксином, и/или связыванием с клеточным рецептором указанного эндотоксина и/или экзотоксина.

Третьим и, с большей долей вероятности, возможным механизмом является то, что производные матрикса зубной эмали модулируют иммунный ответ непосредственно регуляцией, положительным образом, экспрессии каскада цитокинов и сигнальных молекул, которые играют важную роль в развитии индуцированного LPS септического шока. Основываясь на ранее проведенных опытах ex vivo, не описанных в настоящей заявке, представляется разумным отнести, по меньшей мере, частично действие производных матрикса зубной эмали к последнему механизму. Кроме того, на основании проведенного анализа крови также можно предположить, что производные матрикса зубной эмали оказывают прямое действие на экспрессию цитокинов в лейкоцитах. Действие является специфическим, имеющим сильное влияние на TNF и IL-6, но не на IL-1β. Наконец, вполне возможно, что принимают участие все предложенные механизмы и что это является комбинацией данных эффектов, которые и приводят к положительному действию производных матрикса зубной эмали на данной модели.

Задержка начала развития септического шока, о которой сообщается в примере 2, имеет большое клиническое значение. В одном предполагаемом воплощении изобретения задержка непосредственно связана с количеством «свободного» LPS в крови, и производные матрикса зубной эмали будут, таким образом, доставляться в качестве вспомогательного средства для антибиотиков при тяжелой бактериемии и инфекциях, подобных менингиту, для задержки и/или снижения действия токсинов. Подобное лечение будет решающим для выживания пациента в критические часы с последующим началом лечения антибиотиками.

В другом в равной степени предпочтительным воплощении действие производных матрикса зубной эмали вызвано непосредственной модуляцией воспалительной ответной реакции, и таким образом производные матрикса зубной эмали можно использовать в широком ряду клинических ситуаций, когда шок является возможным осложнением. Сюда входят все обширные хирургические операции, трансплантации, травмы, ЕСМО, острый диализ, тяжелые инфекции, тяжелые аллергии и многое другое.

Не намереваясь ограничить объем настоящего изобретения, одним теоретическим объяснением механизма, с помощью которого описанное здесь активное вещество зубной эмали может модулировать иммунную систему млекопитающего, является его взаимодействие с клеточным поверхностным рецептором и/или клеточной поверхностной структурой, выбранной из группы, состоящей из ICAM, HLA-антигена, рецептора интерлейкина 1, рецептора интерлейкина 2, рецептора интерлейкина 3, рецептора интерлейкина 4, рецептора интерлейкина 5, рецептора интерлейкина 6, рецептора интерлейкина 7, рецептора интерлейкина 8, рецептора интерлейкина 9, рецептора интерлейкина 10, рецептора интерлейкина 11, рецептора интерлейкина 12, рецептора интерлейкина 13, рецептора интерлейкина 14, рецептора интерлейкина 15, рецептора интерлейкина 16, рецептора интерлейкина 17, рецептора интерлейкина 18, рецептора IFNα, рецептора IFNβ, рецептора IFN▵, рецептора IFNγ, рецептора IFN Ω, рецепторов PDGF, рецепторов TGF, рецептора TNF, рецептора EGF, вариантов CD44 и семейства рецепторов интегрина.

Клеточные поверхностные рецепторы являются хорошо известными медиаторами коммуникации клеток, когда они активируются их соответствующей сигнальной молекулой, лигандом. Клеточный поверхностный рецептор связывается с лигандом с высокой или низкой аффинностью и превращает данное внеклеточное событие в один и более внутриклеточных сигналов, которые изменяют поведение клетки-мишени. Таким образом, активные вещества зубной эмали могут быть способны модулировать иммунную систему изменением поведения клетки-мишени аналогичным образом. Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения активные вещества зубной эмали активируют клеточный поверхностный рецептор, тем самым индуцируя специфический межклеточный путь передачи сигналов рецепторами и изменяя экспрессию одного или более генов, что в конечном итоге приводит к изменению поведения указанной клетки.

В другом воплощении настоящего изобретения активное вещество зубной эмали может активировать клеточный поверхностный рецептор, который непосредственно функционирует в качестве фермента, так называемого каталитического рецептора, примером является трансмембранный белок с цитоплазматическим доменом, который функционирует в качестве тирозинкиназы.

В еще одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения активное вещество зубной эмали активирует G-белок-связанный поверхностный рецептор, который непосредственно активирует или инактивирует определенный, связанный с мембраной фермент плазмы или ионный канал. Взаимодействие между рецептором и ферментом и/или ионным каналом, как правило, опосредуется третьим белком, таким как G-белок (GTP-связывающий регуляторный белок), который активирует внутриклеточные медиаторы такие как, но не ограничиваясь этим, циклический АМР, InsP3 и Ca²⁺.

Все цитокины, такие как интерлейкины, IFNγ и TNFα, играют решающую роль в регуляции иммунного ответа. Особый интерес вызывает регуляция гена цитокина, как часть дифференциации Т-клеток в подгруппы ТН₁ и ТН₂. Действие цитокина может, например, опосредоваться через его специфический рецептор, который инициирует путь трансдукции сигнала, который сам по себе может привести к высвобождению цитокинов по принципу обратной связи.

Как показано в примере 1, амелогенин обладает модулирующим действием на высвобождение цитокинов и регуляцию поверхностных рецепторов воспаления в ответ на продукты клеточной оболочки бактерий. Таким образом, воплощение настоящего изобретения включает применение активного вещества зубной эмали для производства фармацевтической композиции для модуляции иммунного ответа опосредованием сигнала через рецептор цитокина, такой как IL-2R, IL-4R, IL-10R, IFNγR и TNFαR. Альтернативно, поскольку высвобождение цитокинов регулируется уровнем их экспрессии, активное вещество зубной эмали также может модулировать иммунный ответ инициацией повышающей и/или понижающей регуляцией уровня экспрессии одного или более цитокина(ов) у млекопитающего, тем самым модулируя высвобождение и/или функцию одного или более цитокина(ов).

В особо предпочтительном воплощении настоящего изобретения активное вещество зубной эмали опосредует регуляцию иммунного ответа через TNFαR. Рецепторы TNFα экспрессируются на всех типах соматических клеток за исключением эритроцитов. Описано два рецептора массой 55 кДа (TNF-R1; также обозначаемый CD120а, также относящийся к члену 1А надсемейства рецепторов TNF (TNF-RSF1A) и массой 75 кДа (TNF-R2; также обозначаемый CD120b, также относящийся к члену 1В надсемейства рецепторов TNF (TNF-RSF1B). TNFαR имеет отношение к рецептору NGF с низкой аффинностью и к человеческому клеточному поверхностному антигену CD40 и эффективно экспрессируется на стимулированных Т-клетках и В-лимфоцитах. Третий подтип рецепторов экспрессируется в печени здорового человека. Он связывается с TNFα, но не с TNFβ.

Были установлены различные эффекты двух подтипов рецепторов. Оказалось, что участие р55-рецептора специфически приводит к индукции молекул клеточной адгезии ICAV-1, E-селектина, V-CAM-1 и CD44, в то время как участие р55- и р75-рецепторов индуцирует экспрессию α-2-интегрина. Помимо связанных с мембраной рецепторов описано несколько растворимых белков, которые связываются с TNF. Данные белки массой примерно 30 кДа, называемые Т-ВР-1 и Т-ВР-2 (белки, связывающиеся с фактором некроза опухолей), происходят из TNF-связывающего домена мембранного рецептора. Возможно, они функционируют в качестве физиологических регуляторов активности TNF посредством ингибирования связывания TNF с его рецептором.

Биологическая активность IL-2 опосредуется мембранным рецептором, который экспрессируется практически исключительно на активированных, но не находящихся в покое, Т-клетках. IL-5 и IL-6 модулируют экспрессию рецептора IL-2. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения представляется, что активное вещество зубной эмали опосредует регуляцию иммунного ответа через IL-2R.

Выделяют три различных типа рецепторов IL-2, которые экспрессируются различно и независимо. Рецептор IL-2 с высокой аффинностью составляет примерно 10% всех рецепторов IL-2, экспрессируемых клетками. Данный рецептор является мембранным рецепторным комплексом, состоящим из двух субъединиц IL-2R-альфа (антиген ТАС = антиген активации Т-клеток; р55) и IL-2R-бета (р75; новое обозначение CD122). р75 экспрессируется конститутивно на находящихся в покое Т-лимфоцитах, NK-клетках и ряде других типах клеток, в то время как экспрессия р55, как правило, наблюдается только после активации клеток. р75 участвует в IL-2-опосредуемой трансдукции сигналов. Кроме того, рецептор IL-2 связан с рядом других белков (р22, р40, р100), которые, как полагают, принимают участие в опосредовании конформационных изменений в цепях рецепторов, опосредуемом рецептором эндоцитозе и других процессах трансдукции сигналов. Одним из идентифицированных белков является молекула клеточной адгезии ICAM-1 массой 95 кДа, которая, возможно, концентрирует IL-2-рецепторы в областях контактов клеток с клетками и, таким образом, может опосредовать паракринные активности, например, во время опосредуемой IL-2 стимуляции Т-клеток. Другим белком, связанным с р75, является тирозинспецифическая протеинкиназа, называемая Ick, другие киназы также могут быть связаны с IL-2-рецепторами. Были идентифицированы две такие киназы, называемые fyn и lyn. Кроме того, передача сигнала с участием рецептора IL-2 может опосредоваться также vav. Недавно была описана третья субъединица IL-2-рецептора с молекулярной массой 64 кДа, обозначенная гамма. Данная субъединица необходима для генерации рецепторов IL-2 с высокой и средней аффинностью, но сама она не связывается с IL-2. Недавно было показано, что гамма-субъединица рецептора IL-2 является компонентом рецепторов IL-4 и IL-7. Возможно также, что она является компонентом рецептора IL-13.

Активированные лимфоциты постоянно секретируют фрагмент ТАС-антигена с молекулярной массой 42 кДа. Данный фрагмент циркулирует в сыворотке и плазме крови и функционирует в качестве растворимого IL-2-рецептора (sIL-2R). Концентрации данного растворимого рецептора заметно варьируют при различных патологических состояниях.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения активное вещество зубной эмали активирует IFNγR. Для IFNγR был описан целый ряд связывающихся белков с молекулярной массой в пределах от 70 до 160 кДа. Они экспрессируются на всех типах человеческих клеток за исключением зрелых эритроцитов. Экспрессированный в моноцитах и других гемопоэтических клетках рецептор имеет молекулярную массу, равную 140 кДа. В других типах клеток обнаружили белок с молекулярной массой 54 кДа.

Биологическая активность IL-4 опосредуется рецептором IL-4 (IL-4R). В предпочтительном воплощении настоящего изобретения активное вещество зубной эмали активирует IL-4R. Внеклеточный домен рецептора IL-4 связан с рецепторами Ер0, IL-6 и бета-цепью рецептора IL-2. Он был назван CD124. Описано две формы рецептора, одна из которых секретируется. Секретируемый рецептор включает только внеклеточный связывающий IL-4 домен и способен блокировать активность IL-4. Было показано, что связывающий IL-4 белок (IL-4-ВР), который связывается с IL-4 с такой же аффинностью, что и IL-4-рецептор, является растворимым вариантом IL-4-рецептора. Возможно, растворимые рецепторы функционируют в качестве физиологических регуляторов активности цитокинов, ингибируя связывание рецептора или действуя в качестве транспортных белков. Механизм IL-4-опосредуемой внутриклеточной трансдукции сигналов остается в значительной мере неизвестным. IL-4 оказывает влияние на концентрацию кальция внутри клеток и также на метаболизм инозитфосфолипидов и протеинкиназу С.

У людей IL-10 продуцируется активированными CD8⁺ Т-клетками периферической крови, клонами Th₀-, Th₁- и Th₂-подобных CD4⁺ Т-клеток после антигенспецифической и поликлональной активации, лимфомой из В-клеток и LPS-активированными моноцитами и тучными клетками. IL-4 и IL-10 ингибируют синтез IL-10 моноцитами. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения активное вещество зубной эмали активирует IL-10-рецептор (IL-10R). Мышиный IL-10-рецептор был клонирован. Данный рецептор представляет белок с молекулярной массой примерно 110 кДа, который специфически связывается с мышиным IL-10. Данный рецептор в структурном отношении близок к рецепторам IFN.

При воздействии производных матрикса зубной эмали на периферические лимфоциты было показано, что производное свиного амелогенина Emdogain^® индуцирует незначительное повышение пролиферации СD25/СD4-положительных лимфоцитов в условиях in vitro и сопутствующее снижение СD19-положительных В-лимфоцитов (Petinaki E., S.Nikolopoulos and E.Castanas, 1998. Low stimulation of peripheral lymphocytes, following in vitro application of Emdogain. J. Clin Periodontol. 25:715-20). Хотя авторы не смогли продемонстрировать какое-либо существенное влияние на продукцию иммуноглобулинов и/или цитокинов (IL-2 и IL-6).

Заявители с интересом обнаружили, что различные клеточные культуры фибробластов (эмбриональных, дермальных, полученных из периодонтальной связки, плавника рыб или кожи птиц) продуцировали трансформирующий рост фактор (TGF-β1) в два раза больше при стимуляции Emdogain^® (BIORA AB, Швеция) по сравнению с нестимулированными культурами. Данные факты подтверждают концепцию о потенциальном модулирующем влиянии активных веществ зубной эмали на дисбалансные иммунные ответы.

Матрикс зубной эмали является предшественником зубной эмали, и может быть получен из любого подходящего природного источника, т.е. от млекопитающего, у которого зубы находятся на стадии развития. Подходящим источником является развивающиеся зубы от убитых животных, таких как телята, свиньи и ягнята. Другим источником является кожа рыб.

Матрикс зубной эмали можно получить из развивающихся зубов, как описано ранее (ЕР-В-0337967 и ЕР-В-0263086). Матрикс зубной эмали соскребают и производные матрикса зубной эмали (EMD) получают, например, экстракцией водным раствором, таким как буфер, разбавленная кислота или щелочь, или смесь воды/растворителя с последующим проведением гель-хроматографии, обессоливанием или другими стадиями очистки, альтернативно с последующим высушиванием замораживанием. Альтернативно ферменты можно дезактивировать обработкой теплом или растворителями, в этом случае производные можно хранить в жидкой форме без высушивания вымораживанием.

В качестве альтернативного источника производных или белков матрикса зубной эмали можно также использовать общие применяемые синтезы, хорошо известные специалистам в данной области, или использовать культивированные эукариотные и/или прокариотные клетки, альтернативно модифицированные ДНК-методами. Белки матрикса зубной эмали могут быть, таким образом, рекомбинантного происхождения или альтернативно генетически модифицированными (смотри, например, Sambrook J. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

В настоящем контексте производные матрикса зубной эмали или белковые производные матрикса зубной эмали (EMD) являются производными матрикса зубной эмали, которые включают один или несколько белков матрикса зубной эмали или фракции таких белков, продуцированных в естественных условиях альтернативным сплайсингом или процессингом, или ферментативным или химическим расщеплением природного полноразмерного белка, или синтезом полипептидов в условиях in vitro или in vivo (методами рекомбинантной ДНК или культивированием диплоидных клеток, либо растительных, либо животных клеток). Белковые производные матрикса зубной эмали также включают близкие полипептиды или белки. Полипептиды или белки могут быть связаны с подходящей биодеградируемой молекулой-носителем, такой как полиаминные кислоты или полисахариды, или их сочетания. Кроме того, термин производные матрикса зубной эмали также включает синтетические аналоги соединений.

Белки являются биологическими макромолекулами, состоящими из остатков аминокислот, связанных пептидными связями. Белки, как линейные полимеры аминокислот, также называются полипептидами. Как правило, белки включают 50-800 аминокислотных остатков и, следовательно, имеют молекулярную массу в пределах примерно от 6000 до примерно несколько сотен тысяч дальтон или выше. Небольшие белки также называют пептидами или олигопептидами.

Белки матрикса зубной эмали являются белками, которые в норме присутствуют в матриксе зубной эмали, т.е. предшественнике зубной эмали (Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinson: Eur. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Suppl. 1:282-91), или белками, которые можно получить расщеплением данных белков. В основном, подобные белки имеют молекулярную массу ниже 120000 Да и включают амелогенины, неамелогенины, богатые пролином неамелогенины и тафтелины.

Примерами белков для применения по изобретению являются амелогенины, богатые пролином неамелогенины, тафтелины, тафт-белки, сывороточные белки, белки слюны, амелобластин, шитлин и их производные, и их смеси. Препарат, содержащий активное вещество зубной эмали, для применения по изобретению может также содержать, по меньшей мере, два из вышеуказанных белковых соединения. Кроме того, другие белки для применения по изобретению представлены в виде промышленно доступного продукта Emdogain^® (BIORA AB, Швеция).

Emdogain^® (BIORA AB, S-205 12 Malmö, Швеция) содержит 30 мг белка матрикса зубной эмали, подвергнутого тепловой обработке в течение 3 ч при температуре примерно 80°С для инактивации остаточных протеаз, и 1 мл раствора-носителя (альгинат пропиленгликоля), которые смешиваются перед применением, хотя белок и носитель тестируются по отдельности. Соотношение масс составляет примерно 80/8/12 для основных белковых пиков, соответствующих белкам с молекулярной массой 20, 14 и 5 кДа.

В целом основные белки матрикса зубной эмали известны, как амелогенины. Они составляют примерно 90% (мас./мас.) белков матрикса. Оставшиеся 10% (мас./мас.) включают богатые пролином неамелогенины, тафтелины, тафт-белки, сывороточные белки и, по меньшей мере, один белок слюны; однако, могут присутствовать другие белки, такие как амелин (амелобластин, шитлин), которые были идентифицированы как связанные с матриксом зубной эмали. Кроме того, различные белки могут быть синтезированы и/или получены с несколькими различными размерами (т.е. с различной молекулярной массой). Так, было установлено, что преобладающие белки в матриксе зубной эмали, амелогенины, находятся в виде белков с несколькими различными размерами, которые вместе образуют надмолекулярные агрегаты. Они являются в значительной степени гидрофобными соединениями, которые в физиологических условиях образуют агрегаты. Они могут нести или быть носителями для других белков или пептидов.

Амелогенины развивающейся зубной эмали являются тканеспецифичными белками, богатыми пролином, лейцином, гистидином и глутамиловыми остатками, и синтезируются амелобластами внутреннего эпителия зубной эмали. Данные белки составляют основную массу внеклеточного матрикса, который минерализуется с помощью гидроксиапатита, становясь зрелой зубной эмалью. Определение аминокислотных последовательностей амелогенинов, происходящих от ряда млекопитающих, показывает высокую степень эволюционной консервативности последовательностей, предполагая их специализированную функцию. Недавно было показано, что многие компоненты амелогенина, обнаруженные в матриксе, продуцируются либо в результате постсекреторного протеолитического процессинга, либо в результате экспрессии альтернативно сплайсированных мРНК, происходящих из гена(ов) амелогенина, которые расположены в шести хромосомах. В результате физико-химических исследований рекомбинантных амелогенинов было показано, что они проходят самосборку в условиях in vitro, образуя надмолекулярные «наносферные» структуры, и недавние наблюдения in vivo указывают на функциональную роль наносфер в ультраструктурной организации секреторного матрикса зубной эмали, способствующих организованному развитию самых ранних минеральных кристаллитов.

В недавно проведенных исследованиях по экспрессии амелогенина было показано, что в результате альтернативного сплайсинга РНК мышиного амелогенина образуется семь различных мРНК, кодирующих белки амелогенины, содержащие от 194 до 44 аминокислотных остатков по длине.

Другие белковые соединения также рассматриваются как подходящие для применения по настоящему изобретению. Примеры включают белки, такие как богатые пролином белки и полипролин. Другими примерами соединений, которые считаются пригодными для применения по настоящему изобретению, являются агрегаты таких белков, производных матрикса зубной эмали и/или белков матрикса зубной эмали, а также метаболиты матрикса зубной эмали, производные матрикса зубной эмали и белки матрикса зубной эмали. Метаболиты могут быть любого размера в пределах от размера белков до коротких пептидов.

Как уже упоминалось выше, белки, полипептиды или пептиды для применения по изобретению, как правило, имеют молекулярную массу, по большей мере, примерно 120 кДа, например, такую как 100 кДа, 90 кДа, 80 кДа, 70 кДа или 60 кДа, по данным электрофореза SPS-PAGE.

Белки для применения по настоящему изобретению обычно находятся в виде препарата, в котором содержание белка в активном веществе зубной эмали в препарате находится в пределах примерно от 0,005 до 100% (мас./мас.), так, например, примерно 0,5-99% (мас./мас.), примерно 1-95% (мас./мас.), примерно 10-95% (мас./мас.), примерно 10-90% (мас./мас.), примерно 15-90% (мас./мас.), примерно 20-90% (мас./мас.), примерно 30-90% (мас./мас.), примерно 40-85% (мас./мас.), примерно 50-80% (мас./мас.), примерно 60-70% (мас./мас.), примерно 70-90% (мас./мас.) или примерно 80-90% (мас./мас.).

Препарат активного вещества зубной эмали для применения по изобретению может также содержать смесь активных веществ зубной эмали с различной молекулярной массой.

Белки матрикса зубной эмали можно разделить на высокомолекулярную фракцию и низкомолекулярную фракцию, и было установлено, что хорошо определенная фракция белков матрикса зубной эмали обладает ценными свойствами в отношении лечения периодонтальных дефектов (т.е. периодонтальных ран). Данная фракция содержит экстрагируемые уксусной кислотой белки, в основном относящиеся к амелогенинам, и составляет низкомолекулярную фракцию матрикса зубной эмали (сравни ЕР-В-0 337967 и ЕР-В-0 263086).

В настоящем контексте активные белки не ограничиваются низкомолекулярной фракцией матрикса зубной эмали. В данном случае предпочтительные белки включают белки матрикса зубной эмали, такие как амелогенин, тафтелин и т.д., с молекулярной массой (определенной в условиях in vitro с помощью SDS-PAGE) ниже примерно 60000 Да, но белки, имеющие молекулярную массу выше 60000 Да, также обладают весьма обещающими свойствами в качестве кандидатов для усиления роста соединительной ткани.

Следовательно, полагается, что активное вещество зубной эмали для применения по изобретению обладает молекулярной массой примерно до 40000 Да, например молекулярной массой в пределах примерно от 5000 Да до примерно 25000 Да.

Можно выделить амелогенины с различной молекулярной массой разделением белков, например, осаждением, ионообменной хроматографией, препаративным электрофорезом, гель-хроматографией, обратнофазовой хроматографией или аффинной хроматографией.

Комбинация амелогенинов по молекулярной массе может быть различной, от преобладающего соединения с массой 20 кДа до агрегата амелогенинов со многими различными молекулярными массами в пределах от 40 до 5 кДа и до преобладающего соединения с массой 5 кДа. Можно добавить, и они будут находиться на носителе, представляющем агрегат из амелогенина, другие белки матрикса зубной эмали, такие как тафтелин или протеолитические ферменты, присутствующие в норме в матриксе зубной эмали.

В особо предпочтительном воплощении настоящего изобретения указанное активное вещество зубной эмали, используемое для производства фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения состояния у млекопитающего, характеризующегося дисбалансом иммунного ответа у указанного млекопитающегося на иммуноген, выбрано из группы, состоящей из любого растворимого пептида на основе амелогенина с молекулярной массой, равной 2-13 кДа, включая растворимый пептид на основе амелогенина с молекулярной массой в пределах 2-4,5 кДа, 3-5,5 кДа, 4-6,5 кДа, 5-7,5 кДа или 5-13 кДа, который входит в элюат, представленный третьим и/или четвертым пиком при анализе ВЭЖХ процессированного амелогенина, как показано на фиг. 2.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения указанный процессированный продукт амелогенина представляет полипептид массой 5 кДа.

По настоящему изобретению активное вещество зубной эмали можно использовать вместе с другими активными лекарственными препаратами такими, как антибактериальные, противовоспалительные, противовирусные, противогрибковые соединения или в сочетании с местной химиотерапией, индукторами апоптоза, факторами роста, например, такими как TGFβ, PDGF, IGF, FGF, EGF, фактором роста кератиноцинов или их пептидными аналогами. Ферменты - либо врожденно присутствующие в матриксе зубной эмали, либо их препарат, либо добавленные - можно также использовать в сочетании с матриксом зубной эмали, производным матрикса зубной эмали и/или белком матрикса зубной эмали, особенно протеазы.

Для введения индивидууму (животному или человеку) активное вещество зубной эмали и/или его препарат предпочтительно включают в состав фармацевтической композиции, содержащей активное вещество зубной эмали и необязательно один или более фармацевтически приемлемых наполнителей.

Композицию, включающую активное вещество зубной эмали, предназначенную для введения, можно адаптировать для введения любым подходящим путем, например для системного введения пациенту через зонд, шприц, спрей или устройство для орошения. Кроме того, композицию можно адаптировать для введения применительно к операции, например, в виде системного введения инфузией в кровь, лимфу, асцитную жидкость или спинномозговую жидкость, или ингаляцией.

Ниже представлены примеры подходящих композиций, содержащих активные вещества зубной эмали.

Для введения индивидууму (животному или человеку) вещество(а) предпочтительно включают в состав фармацевтической композиции, содержащей вещество(а) и необязательно один или более фармацевтически приемлемых наполнителей.

Композиции могут быть, например, в виде жидких, полутвердых или твердых композиций таких как, но не ограничиваясь этим, жидкости для трансфузии, такие как стерильный физиологический раствор, раствор Рингера, растворы глюкозы, раствор фосфатного буфера, кровь, плазма или вода, порошки, микрокапсулы, микросферы, наночастицы, спреи, аэрозоли, устройства для ингаляции, растворы, дисперсии, суспензии, эмульсии, смеси.

Композиции можно готовить с использованием обычной фармацевтической практики, смотри, например, "Remington: The science and practice of pharmacy" 20^th ed. Mack Publishing, Easton PA, 2000 ISBN 0-912734-04-3, и "Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", edited by Swarbrick J. & J.C.Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988 ISBN 0-8247-2800-9.

Фармацевтическая композиция, содержащая активное вещество, служит в качестве системы доставки лекарственного препарата. В настоящем контексте «система доставки лекарственного препарата» означает фармацевтическую композицию (фармацевтическую форму или лекарственную форму), которая при введении доставляет активное вещество в организм человека или животного. Так, термин «система доставки лекарственного препарата» включает простые фармацевтические композиции, такие как жидкости, порошки и спреи.

Выбор фармацевтически приемлемых наполнителей в композиции для применения по изобретению и их оптимальные концентрации, как правило, невозможно предсказать заранее и их следует установить на основе экспериментального определения. Кроме того, насколько фармацевтически приемлемый наполнитель подходит для применения в фармацевтической композиции в основном зависит от вида выбранной лекарственной формы. Однако специалист в области лекарственных форм может найти необходимые указания, например, в "Remington: The science and practice of pharmacy" 20^th ed. Mack Publishing, Easton PA, 2000 ISBN 0-912734-04-3.

Фармацевтически приемлемый наполнитель представляет соединение, которое в основном безвредно для индивидуума, которому будут вводить композицию. Подобный наполнитель обычно отвечает требованиям, предъявляемым национальными агентствами по надзору за лекарственными препаратами. В официальных фармакопеях, таких как Британская Фармакопея, Американская Фармакопея в США и Европейская Фармакопея, представлены стандарты хорошо известных фармацевтически приемлемых наполнителей.

Ниже дается обзор по соответствующим фармацевтическим композициям для применения по изобретению. Обзор основан на конкретном пути введения. Однако понятно, что в тех случаях, когда фармацевтически приемлемый носитель может использоваться в различных лекарственных формах или композициях, применение конкретного фармацевтически приемлемого носителя не ограничивается конкретной лекарственной формой или конкретной функцией наполнителя.

Композиции для парентерального введения

Для системного применения композиции по изобретению могут содержать обычные нетоксичные, фармацевтически приемлемые носители и наполнители соответственно включаемым микросферам и липосомам.

Композиции для применения по изобретению включают все виды твердых, полутвердых и жидких композиций. Композициями, представляющими особый интерес, например, являются растворы, суспензии, эмульсии.

Фармацевтически приемлемые наполнители могут включать растворители, буферные агенты, консерванты, хелатообразующие агенты, антиокислители, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, разбавители. Примеры различных агентов смотри ниже.

В наиболее предпочтительном воплощении лиофилизованный порошок Emdogain^® (BIORA AB, Malmц, Швеция) растворяется в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) до конечной концентрации 30 мг/мл.

Примером другого, в равной степени предпочтительного воплощения, является лиофилизованный порошок Emdogain^® (BIORA AB, Malmц, Швеция), растворенный в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) до конечной концентрации в пределах 0,01-50 мг/мл, так, например, 0,01-10 мг/мл, 0,1-10 мг/мл, 0,01-5 мг/мл, 0,1-5 мг/мл, 0,01-1 мг/мл, 0,1-1 мг/мл или 0,01-0,05 мг/мл, включая концентрации примерно 0,01 мг/мл, 0,02 мг/мл, 0,03 мг/мл, 0,04 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,06 мг/мл, 0,07 мг/мл, 0,08 мг/мл, 0,09 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 10 мг/мл, 20 мг/мл, 30 мг/мл, 35 мг/мл, 40 мг/мл, 45 мг/мл или 50 мг/мл.

Кроме того, как показано в примере 2, масса дозы производных матрикса зубной эмали, вводимых млекопитающему, при их необходимости, конечно, доводится, исходя из конкретной массы тела млекопитающего, которое подвергается лечению, и желаемой эффективности EMD, и наиболее предпочтительно будет находиться примерно в пределах 0,01-100 мг EMD/кг массы тела, так, например, примерно 0,01-50 мг EMD/кг, 0,05-10 мг EMD/кг, 0,01-1 мг EMD/кг, 0,1-50 мг EMD/кг, 0,1-25 мг EMD/кг, 0,1-15 мг EMD/кг или 0,1-10 мг EMD/кг или 0,1-1 мг EMD/кг массы тела, дополнительно в зависимости от того, применяются производные матрикса зубной эмали в высокой или низкой дозе.

Так, обычная низкая доза будет включать, по большей мере, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,12, 0,15, 0,17, 2,0, 0,5, 1,0, 1,2, 1,5, 1,6, 1,8, 2, 2,5, 5, 6, 7, 8, 9 или 9,9 мг EMD/кг массы тела, в то время как высокая доза будет включать, по меньшей мере, 10, 15, 18, 20, 25, 50, 75 или 100 мг EMD/кг массы тела.

Представленные выше дозы будут применяться, по меньшей мере, один раз в неделю, так, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более раз в неделю, по меньшей мере, в течение 1-30 дней и альтернативно, по меньшей мере, в течение 10-90 дней или дольше.

Примеры различных агентов

Примерами растворителей являются, но они не ограничиваются этим, вода, спирты, кровь, плазма, спинномозговая жидкость, асцитная жидкость и лимфа.

Примерами буферных агентов являются, но они не ограничиваются этим, лимонная кислота, уксусная кислота, винная кислота, молочная кислота, фосфорная кислота, бикарбонаты, фосфаты, диэтиламин и т.д.

Примерами хелатообразующих агентов являются, но они не ограничиваются этим, натриевая соль ЭДТА и лимонная кислота.

Примерами антиоксидантов являются, но они не ограничиваются этим, бутилированный оксианизол (ВНА), аскорбиновая кислота и ее производные, токоферол и его производные, цистеин и их смеси.

Примерами порошкообразных компонентов являются, но они не ограничиваются этим, альгинат, коллаген, лактоза, порошок, способный образовывать гель при нанесении на рану (абсорбирует жидкость/раневой экссудат).

Примерами разбавителей и разрыхляющих веществ являются, но они не ограничиваются этим, лактоза, сахароза, эмдекс, фосфаты кальция, карбонат кальция, сульфат кальция, маннит, крахмалы и микрокристаллическая целлюлоза.

Примерами связывающих агентов являются, но они не ограничиваются этим, сахароза, сорбит, аравийская камедь, альгинат натрия, желатин, крахмалы, целлюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, поливинилпирролидон и полиэтиленгликоль.

Надписи к чертежам

Фиг.1:

Пробы цельной крови, обработанные LPS, PepG и белковыми композициями матрикса инкубировали с 10 мкл FITC- или РЕ-конъюгированных моноклональных антител. Экспрессию антигенов анализировали проточной цитометрией с использованием 10 мкл анти-CD14-, анти-CD44-, анти-ICAM-антител, а также изотипных анти-IgG₁- и анти-IgG₂-антител в качестве отрицательного контроля. Все пробы анализировали на FACS-сортере с использованием программного обеспечения CellQuest.

Фиг.2:

Амелогенины экстрагировали из незрелой зубной эмали свиней по способу Gestrelius et al., 1997. После растворения в 30% ацетонитриле пробы разделяли на хроматографе Jasco для ВЭЖХ с использованием колонки для гель-хроматографии. Комплекс представлен четырьмя пиками, соответствующими полноразмерному белку и растворимым, процессированным пептидам амелогенина.

Фиг.3:

Производные матрикса зубной эмали вызывали снижение продукции альфа-фактора некроза опухолей (TGF-α), цитокина провоспаления, с параллельным повышением высвобождения противовоспалительного цитокина IL-10.

Источники

1. Foster, S. J. 1992. Analysis of the autolysins of Bacillus subtilis 168 during vegetative growth and differentiation by using renaturing polyacrylamide gel electrophoresis. J Bacteriol. 174:464-70.

2. Gestrelius, S., C. Andersson, D. Lidstrom, L. Hammarstrom, and M. Somerman. 1997. In vitro studies on periodontal ligament cells and enamel matrix derivative. J Clin Periodontol. 24:685-92.

3. Hoang, A. M., T. W. Oates, and D. L. Cochran. 2000. In vitro wound healing responses to enamel matrix derivative [In Process Citation]. J Periodontol. 71:1270-7.

4. Petinaki, E., S. Nikolopoulos, and E. Castanas. 1998. Low stimulation of peripheral lymphocytes, following in vitro application of Emdogain. J Clin Periodontol. 25:715-20.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ

Опыт 1

Целью настоящего опыта было исследование потенциального модулирующего действия амелогенина на естественные иммунные механизмы в цельной крови человека. Особый интерес представляло высвобождение цитокинов и регуляция поверхностных рецепторов воспаления в ответ на продукты клеточной оболочки бактерий.

Материалы и реактивы

Периферическую венозную кровь получали от здоровых сотрудников и собирали в вакуумные контейнеры, содержащие 0,129 цитрата натрия (Becton Dickinson Vacutainer Systems Eur, Meylan Cedex, Франция). Лиофилизованный порошок Emdogain^® (BIORA AB, Malmц, Швеция) растворяли в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) до конечной концентрации 30 мкг/мл. Липополисахарид Escherichia coli 026:B6 (LPS; Difco Laboratories, Detroit, MI, США) суспендировали в непирогенном стерильном физиологическом растворе и 10 нг/мл LPS непосредственно вносили в пробы крови в микроцентрифужных пробирках. Липотеихоевую кислоту (LTA) получали от Sigma chemicals (St. Louis, Miss., США). Пептидогликан (PepG) выделяли из Staphylococcus aureus, как описано ранее (Foster S.J. 1992 J. Bacteriol. 174:464-70). Анализ аутолизинов Bacillus subtilis 168 во время вегетативного роста и дифференциации проводили с использованием ренатурационного электрофореза в полиакриламидном геле, аутолизины вносили непосредственно в пробы крови в концентрации 10 мкг/мл.

Опыты с цельной кровью

Периферическую венозную кровь получали от здоровых сотрудников и собирали в вакуумные контейнеры, содержащие 0,129 цитрата натрия (Becton Dickinson Vacutainer Systems Eur, Meylan Cedex, Франция). Аликвотные порции цельной крови по 1,5 мл вносили в микроцентрифужные пробирки (Sorenson, BioScience Inc., Salt Lake City, Utah, США). Перед стимуляцией LPS, PepG или LTA пробы крови предварительно инкубировали при 37°С в течение 2 ч с растворенным Emdogain^® при конечной концентрации 0, 45, 150, 300, 450, 600 или 750 мкг/мл.

Затем пробы крови стимулировали 10 нг/мл LPS, 10 мкг/мл PepG или 100 мкг/мл LTA альтернативно в течение 4 или 6 ч. Затем кровь охлаждали на льду и центрифугировали (14000 g в течение 1 мин), отделяли плазму крови для определения белков цитокинов. В качестве контролей вместо бактериальных продуктов добавляли эквивалентные объемы 0,9% NaCl. Фоновые концентрации цитокинов определяли сразу же после взятия проб крови.

В предварительных исследованиях было показано, что PepG и LTA приводят к максимальным значениям TNF-α через 6 ч стимуляции по сравнению с 4 ч после стимуляции LPS. Следовательно, выбирали продолжительность стимуляции LPS в течение 4 ч и стимуляции PepG и LTA в течение 6 ч.

ELISA. Концентрацию TNF-α, IL-6 и IL-10 определяли с помощью промышленно доступного набора для постановки твердофазного «сэндвич» иммуноферментного анализа (ELISA) (PeliKine Compact, CLB Labs, Amsterdam, Нидерланды), следуя инструкциям изготовителя. Пределы определения TNF-α, IL-6 и IL-10 с помощью ELISA составляли соответственно 3, 0,4 и 3 пкг/мл. Планшеты «читали» при 450 нм на ридере для ELISA (термомакс-ридер для планшетов для микротитрования, Molecular Devices, Menlo Park, CA., США).

Мечение антител и проточная цитометрия. После стимуляции пробы цельной крови сразу же разливали по 100 мкл в полистироловые пробирки Falcon (Becton Dickinson, Lincoln Park, New Jersey, США) и инкубировали с 10 мкл FITS- или РЕ-конъюгированных моноклональных антител в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Перед отмывкой и фиксацией эритроциты лизировали с использованием лизирующего раствора для FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA., США). Пробы три раза промывали раствором для отмывки клеток (Becton Dickinson) перед фиксацией 1% формальдегидом (CellFIX, Becton Dickinson, Erembodegem, Бельгия). Экспрессию антигенов анализировали проточной цитометрией с использованием 10 мкл анти-CD14-(18D11, Diatec AS, Oslo, Норвегия), анти-CD44-(Diatec AS, Oslo, Норвегия), анти-ICAM-1-антител (Diatec AS, Oslo, Норвегия), а также изотипных анти-IgG₁-(1В9) и анти-IgG₂-антител (5А7) (оба производства Diatec AS) в качестве отрицательного контроля. Все пробы анализировали на FACS-сортере (Becton Dickinson) с использованием программного обеспечения CellQuest. Результаты представлены на фиг.1.

В каждом опыте популяцию моноцитов идентифицировали как CD14-положительные клетки по характерному положению на диаграмме рассеяния. Интенсивность флуоресценции (FI) определяли в популяции моноцитов после соответствующей установки дискриминационного окна по данным признакам и среднее значение FI (геометрическое среднее) регистрировали для каждого определения.

Статистический анализ. Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего значения (SEM). Данные анализировали односторонним вариационным анализом (ANOVA) с последующей обработкой тестом Tukey. Р < 0,05 считалось достоверным.

Как представлено на фиг. 3, производные матрикса зубной эмали вызывали снижение продукции цитокина провоспаления альфа-фактора некроза опухолей (TNF-α), наряду с параллельным повышением высвобождения противовоспалительного цитокина IL-10. Данные результаты указывают на то, что производные матрикса зубной эмали обладают сильными иммуномодулирующими свойствами. Также возможно предположить, что производные матрикса зубной эмали могут обладать потенциальным лечебным действием при сепсисе с полиорганной недостаточностью. Кроме того, производные матрикса зубной эмали могут обладать потенциальным лечебным действием в отношении других заболеваний, связанных с острым или хроническим воспалением, таких как воспалительное заболевание кишечника, отторжение трансплантированных органов или ортопедических имплантатов, ревматоидный артрит, артериосклероз и некоторые другие.

Опыт 2

В данном опыте оценивали потенциальное терапевтическое действие производных матрикса зубной эмали в условиях in vivo с использованием модели сепсиса на свиньях. Данная модель основана на непрерывной инфузии LPS E. coli, что приводит к возникновению острой воспалительной ответной реакции. Через некоторое время (как правило, через 0,5-1 ч после введения LPS) у животных развивается септический шок, отражающий важные патофизиологические признаки тяжелого сепсиса. Модель представляет эффективный инструмент, связывающий результаты, полученные in vitro, с возможными клиническими испытаниями.

Производные матрикса зубной эмали (в максимальной дозе 5 мг/кг массы тела, что соответствует расчетной концентрации в сыворотке крови, равной примерно 100 мг/л) вводили в/в в виде болюс-инъекции свиньям за 30 мин до начала сепсиса (= инъекция LPS, 1,7 мкг/кг массы тела/час). Сообщалось, что период полувыведения производных матрикса зубной эмали составляет 240 мин. Таким образом, для поддержания терапевтической концентрации EMD в сыворотке крови использовали в/в трансфузию для введения 50 мг производных матрикса зубной эмали в 100 мл раствора Рингера (рН = 6) в час. В качестве контроля трех свиней обрабатывали аналогично, за исключением введения EMD, которые заменяли на инъекцию и трансфузию сывороточного альбумина («плацебо»).

Постоянно регистрировали параметры гемодинамики, каждый час до конца опыта, т.е. через 5 ч после инфузии бактериальных токсинов (LPS). Отбирали пробы крови и проводили определение клинических параметров до начала опыта (0 время), сразу же после начала введения производных матрикса зубной эмали или плацебо (0-а время), сразу же после начала введения LPS (1 время) и каждый час после начала развития сепсиса из печеночной и воротной вены, брюшной артерии и легочной артерии, и анализировали параметры гомеостаза крови, показатели функционального состояния органов (активность сывороточной аспартатаминотрансферазы (ASAT), сывороточной аланинаминотрасферазы (ALAT) и сывороточной щелочной фосфатазы в качестве показателей функции печени, и активность гамма-глютамилтрансферазы (γ-GT) и креатинин в качестве показателей функции почек) и медиаторы воспаления (TNF-α, IL-1β и IL-6). Показатели функционального состояния органов анализировали в крови, отбираемой у свиней каждый час во время проведения опыта в заранее определенные временные точки. Пробы крови анализировали с использованием обычных, применяемых в клинической практике методов в гематологической лаборатории Норвежского национального госпиталя. Маркеры воспаления определяли в тех же пробах крови с использованием ELISA, с набором для определения ELISA свиного TNF-α/TNFSF2 Quantikine Р (# PTA00), набора для иммуноанализа свиного IL-6 Quantikine P (# P6000) и набора для определения ELISA свиного IL-1β/IL-1F2 Quantikine P (# PTA00), все производства R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, США). Использовали стандартные методы согласно инструкциям изготовителя без каких-либо пропусков или адаптаций.

После проведения опыта (падеж животного или через 5 ч после непрерывного введения производных матрикса зубной эмали или плацебо и LPS) животных усыпляли и проводили вскрытие. Макроскопически исследовали внутренние органы кровообращения и отбирали пробы тканей для гистологических исследований согласно схеме опытов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Свинья 1

Физические данные: самка; общая масса тела 23,5 кг; здоровая.

Операция: без осложнений.

Лечение: плацебо (25 мг сывороточного альбумина в 50 мл болюс-инъекции в PBS, 10 мг SA в 100 мл раствора Рингера в час трансфузии, суммарная доза SA = 75 мг), LPS (40 мкг/час в 4 мл PBS, непрерывная инъекция в течение 5 ч; суммарная доза LPS = 200 мкг).

Гемодинамика: у животного отсутствовала ответная реакция на введение плацебо. Наблюдали сильную первоначальную реакцию на введение LPS с последующим развитием септического шока, который продолжался в течение всего опыта. Начало шока наблюдали примерно через один час после начала введения LPS.

Анатомия и макроскопическая картина органов кровообращения на момент смерти: все органы кровообращения имели нормальную анатомию. Признаки патологии наблюдали только в печени, где имелись признаки застоя и гемостаза.

Гематология: первоначально у животного наблюдали нормальные гематологические показатели. Большая часть показателей оставалась в пределах нормы во время всего опыта. Единственным исключением, наблюдаемым через 4 и 5 ч после введения LPS, было повышение количества В-нейтрофилов и снижение числа В-лимфоцитов.

Биохимия: активность всех ферментов и уровень креатинина оставались в пределах нормы в течение всего опыта. Наблюдали незначительное, но стабильное снижение концентрации креатинина, но показатели никогда не опускались ниже нормы. У свиньи первоначально наблюдали незначительное повышение активности ALP, но этот показатель нормализовался перед введением LPS. Значения активности ASAT были также выше в течение опытного периода, но достоверно не отличались после введения LPS.

Цитокины: у свиньи отмечали быстрое повышение значений уровня TNF после введения LPS. Показатель был выше предела определения (1500 мкг/л) через 1 ч после начала введения LPS и оставался на этом уровне в течение всего опыта. Также быстро повышался уровень IL-6 после начала введения LPS. Уровень IL-6 стабильно повышался в течение всего опытного периода со значением в конце опыта 3500 мкг/мл. Наблюдали медленное повышение уровня IL-1β, вызванное введением LPS, с конечным значением примерно 700 мкг/л через 5 ч.

Примечания: к концу опыта параметры гемодинамики указывали на наличие недостаточности печени и легких. Низкий и уменьшающийся диурез свидетельствовал о почечной недостаточности. Первые признаки недостаточности органов наблюдали через 2 ч после начала введения LPS. Через 30 мин после введения LPS наблюдали тремор. Значения гематологических и биохимических показателей указывали, что поддерживающие жизнь системы функционировали нормально и что наблюдаемые эффекты были вызваны введением токсина, а не травмой в результате операции. Воспалительный статус указывал на то, что у свиньи имел место септический шок. Отсутствовали признаки восстановления уровней цитокинов. Представляется маловероятным, чтобы данная свинья выжила в опыте.

Свинья 2

Физические данные: самка; общая масса тела 21,5 кг; здоровая.

Операция: без осложнений.

Лечение: производные матрикса зубной эмали (21,5 мг производных матрикса зубной эмали в 50 мл болюс-инъекции в PBS, 10 мг производных матрикса зубной эмали в 100 мл раствора Рингера в час трансфузии, суммарная доза производных матрикса зубной эмали = 71,5 мг), LPS (37 мкг/час в 4,5 мл PBS, непрерывное введение в течение 5 ч; суммарная доза LPS = 185 мкг).

Гемодинамика: у животного отсутствовала ответная реакция на болюс-инъекцию EMD. Наблюдали очень быструю и сильную первоначальную реакцию на введение LPS (тахикардия и повышенный артериальный кровоток) с последующим началом развития септического шока примерно через 1 ч после начала введения LPS. На данной стадии наблюдали ранние признаки полиорганной недостаточности. Однако позднее показатели гемодинамики стабилизировались и функциональное состояние органов восстанавливалось.

Анатомия и макроскопическая картина органов кровообращения на момент смерти: все органы кровообращения имели нормальную анатомию. Макроскопические признаки патологии не наблюдали в обследованных органах.

Гематология: первоначально у животного наблюдали нормальные гематологические показатели. Все показатели оставались в пределах нормы во время всего опыта.

Биохимия: активность всех ферментов и уровень креатинина оставались в пределах нормы в течение всего опыта. Первоначально у свиньи наблюдали незначительное повышение активности ALP, но данный показатель оставался без изменений после введения производных матрикса зубной эмали или LPS. Значения активности ASAT к концу опыта несколько повышались, но достоверные изменения отсутствовали после введения производных матрикса зубной эмали или LPS.

Цитокины: введение производных матрикса зубной эмали не вызывало какого-либо повышения уровня анализируемых циркулирующих цитокинов. Однако у свиньи наблюдали быстрое повышение значений концентрации TNF после введения LPS. Показатель был выше предела определения (1500 мкг/л) через 1 ч после начала введения LPS и оставался на этом уровне в течение примерно 4 ч. Через 4 ч уровень TNF снижался, и имелась тенденция к его нормализации. Также уровень IL-6 быстро повышался после начала введения LPS. Уровень IL-6 стабильно повышался в течение опыта с максимальным значением 4800 мкг/л через 4 ч. Через 5 ч уровень IL-6 снижался, но в результате (спланированного) окончания опыта данная тенденция не была подтверждена. Наблюдали медленное повышение уровня IL-1β, вызванное введением LPS, и в конце опыта, т.е. через 5 ч он составлял 1000 мкг/л.

Примечания: очевидно, животное восстанавливалось от явного септического шока и начала развития недостаточности органов, о чем судили по параметрам гемодинамики и восстановлению функции почек (диурезу) и уменьшению асцита. Тремор имел место через 1 ч после введения LPS. Данные факты являются необычными, особенно после сильной первоначальной ответной реакции на эндотоксин (LPS). Значения гематологических и биохимических показателей указывали, что поддерживающие жизнь системы функционировали нормально и что наблюдаемые эффекты были вызваны введением токсина, а не травмой в результате операции. Воспалительный статус указывал на то, что первоначально у свиньи имел место септический шок. Однако имели место признаки медленного восстановления показателей IL-6 и TNF. По-видимому, введение производных матрикса зубной эмали не оказывало влияния на уровень IL-1β. С учетом данного периода времени и продолжающего снижения концентрации цитокинов воспаления, вероятно, данная свинья выжила бы в опыте.

Свинья 3

Физические данные: самка; общая масса тела 25,0 кг; здоровая.

Операция: без осложнений.

Лечение: плацебо (125 мг SA в 100 мл болюс-инъекции в PBS, 50 мл SA в 100 мл раствора Рингера в час трансфузии, суммарная доза SA = 375 мг), LPS (43 мкг/час в 4,5 мл PBS, непрерывное введение в течение 5 ч; суммарная доза LPS = 215 мкг).

Гемодинамика: у животного отсутствовала ответная реакция на введение плацебо. Наблюдали первоначальную ответную реакцию на введение LPS от низкой до средней интенсивности с последующим развитием септического шока, который продолжался в течение всего опытного периода. Начало шока наблюдали примерно через один час после введения LPS.

Анатомия и макроскопическая картина органов кровообращения на момент смерти: все органы кровообращения имели нормальную анатомию. Признаки патологии наблюдали только в печени, где имелись признаки застоя (набухание и краснота) и гемостаза.

Гематология: первоначально у животного наблюдали нормальные гематологические показатели. Большая часть показателей оставалась в пределах нормы во время всего опыта. Единственным исключением, наблюдаемым через 4 и 5 час после введения LPS, было повышение количества В-нейтрофилов и снижение числа В-лимфоцитов.

Биохимия: активность большинства ферментов оставалась в пределах нормы в течение всего опыта. Наблюдали медленное, но стабильное снижение концентрации креатинина, и через 2 ч после введения LPS уровень креатинина снижался до значений ниже нормы и оставался низким в оставшееся время опыта. У свиньи первоначально наблюдали повышение активности ALP, но данный показатель был стабильным, и введение LPS не оказывало на него влияния. Воспалительный статус свидетельствовал о развитии у свиньи септического шока. Отсутствовали признаки восстановления значений уровня цитокинов. Представляется маловероятным, чтобы данная свинья выжила в опыте.

Цитокины: у свиньи отмечали быстрое повышение значений TNF после введения LPS. Показатель был выше предела определения (1500 мкг/л) через 1 ч после начала введения LPS и оставался на этом уровне в течение всего опыта. Также быстро повышался уровень IL-6 после начала введения LPS. Уровень IL-6 стабильно повышался в течение всего опытного периода с максимальным значением 5000 мкг/мл через 3 ч после введения LPS и со значением 3900 мкг/л в конце опыта. Наблюдали медленное повышение уровня IL-1β, вызванное введением LPS, с конечным значением примерно 700 мкг/л через 5 ч.

Примечания: к концу опыта значения параметров гемодинамики указывали на наличие недостаточности печени. Низкий диурез свидетельствовал о почечной недостаточности. Признаки недостаточности органов наблюдали через 3 ч после начала введения LPS. Через 30 мин после введения LPS наблюдали тремор. Значения гематологических и биохимических показателей указывали, что поддерживающие жизнь системы функционировали нормально и что наблюдаемые эффекты были вызваны введением токсина, а не травмой в результате операции. Воспалительный статус указывал на то, что у свиньи имел место септический шок. Отсутствовали признаки восстановления уровней цитокинов. Представляется маловероятным, чтобы данная свинья выжила в опыте.

Свинья 4

Физические данные: самка; общая масса тела 24,5 кг; здоровая.

Операция: без осложнений.

Лечение: производные матрикса зубной эмали (125 мг производных матрикса зубной эмали в 100 мл болюс-инъекции в PBS, 50 мг производных матрикса зубной эмали в 100 мл раствора Рингера в час трансфузии, суммарная доза производных матрикса зубной эмали = 375 мг), LPS (42 мкг/час в 4,5 мл PBS, непрерывное введение в течение 5 ч; суммарная доза LPS = 210 мкг).

Гемодинамика: у животного отсутствовала ответная реакция на болюс-инъекцию EMD. Наблюдали сильную первоначальную реакцию на введение LPS с последующим медленным развитием септического шока примерно через 3 ч после начала введения LPS. На данной стадии наблюдали ранние признаки недостаточности легких. Однако позднее показатели гемодинамики стабилизировались и функциональное состояние органов восстанавливалось.

Анатомия и макроскопическая картина органов кровообращения на момент смерти: все органы кровообращения имели нормальную анатомию. Макроскопические признаки патологии не наблюдали в обследованных органах.

Гематология: первоначально у животного наблюдали нормальные гематологические показатели. Все показатели оставались в пределах нормы во время всего опыта.

Биохимия: активность всех ферментов и уровень креатинина оставались в пределах нормы в течение всего опыта. У свиньи первоначально наблюдали незначительное повышение активности ALP, но данный показатель оставался без изменений при введении производных матрикса зубной эмали или LPS. Значения активности ASAT были несколько выше к самому концу опыта, но достоверные изменения, непосредственно связанные с введением производных матрикса зубной эмали и LPS, отсутствовали.

Цитокины: введение производных матрикса зубной эмали не вызывало какого-либо повышения уровня анализируемых циркулирующих цитокинов. Однако у свиньи наблюдали быстрое повышение значений концентрации TNF после введения LPS. Показатель был выше предела определения (1500 мкг/л) через 1 ч после начала введения LPS и оставался на этом уровне в течение всего опыта. Также уровень IL-6 быстро повышался после начала введения LPS. Уровень IL-6 стабильно повышался в течение опыта до значения выше предела определения (> 5000 мкг/л) через 3 ч. Через 4 ч уровень IL-6 снижался, и эта тенденция также подтверждалась и через 5 ч. Наблюдали медленное, стабильное повышение уровня IL-1β, вызванное введением LPS, в конце опыта, т.е. через 5 ч он составлял примерно 700 мкг/л.

Примечания: очевидно, животное было защищено от тяжелого септического шока и недостаточности органов, о чем судили по клиническим признакам и показателям гемодинамики. Недостаточность органов отсутствовала, но диурез был низким в течение всего опытного периода. Имело место только незначительное образование асцитной жидкости, и тремор не наблюдали. Данные факты являются необычными, особенно после сильной первоначальной ответной реакции на эндотоксин (LPS). Значения гематологических и биохимических показателей указывали, что поддерживающие жизнь системы функционировали нормально и что наблюдаемые эффекты были вызваны введением токсина, а не травмой в результате операции. Воспалительный статус свидетельствовал о начале развития септического шока у свиньи. Однако имели место признаки медленного восстановления уровней IL-6 и TNF. По-видимому, введение производных зубной эмали не оказывало влияния на концентрацию IL-1β. С учетом данного периода времени и продолжающегося снижения концентрации цитокинов воспаления, а также положительной гемодинамики, вероятно, данная свинья выжила бы в опыте.

Свинья 5

Физические данные: самка; общая масса тела 25,0 кг; здоровая.

Операция: без осложнений.

Лечение: производные матрикса зубной эмали (125 мг производных матрикса зубной эмали в 100 мл болюс-инъекции в PBS, 50 мг производных матрикса зубной эмали в 100 мл раствора Рингера в час трансфузии, суммарная доза производных матрикса зубной эмали = 375 мг), LPS (43 мкг/час в 4,5 мл PBS, непрерывное введение в течение 5 ч; суммарная доза LPS = 215 мкг).

Гемодинамика: у животного наблюдали первоначальное повышение кровяного давления в легких в ответ на начало болюс-инъекции EMD. Эффект был быстропроходящим (исчислялся в минутах) и не зависел от дозы, указывая на то, что производные матрикса зубной эмали оказывали короткое сосудосуживающее действие на легочные капилляры. Наблюдаемый эффект проходил еще до окончания болюс-инъекции. Никаких других эффектов от введения производных зубной эмали не наблюдали. У животного отсутствовала какая-либо выраженная реакция на введение LPS. Отсутствовали признаки септического шока, и функция органов кровообращения была стабильной в течение всего опыта. Скорость инфузии LPS и положение катетера для введения LPS контролировали несколько раз во время опыта для гарантии того, что LPS вводили согласно схеме опытов.

Анатомия и макроскопическая картина органов кровообращения на момент смерти: все органы кровообращения имели нормальную анатомию. Макроскопические признаки патологии отсутствовали в исследованных органах.

Гематология: первоначально у животного наблюдали нормальные гематологические показатели, за исключением достоверного повышения числа лейкоцитов (в 2 раза по сравнению с нормой) после начала операции (0 проба). Однако относительное количество различных лейкоцитов было в норме, и данный показатель оставался стабильным в течение опыта. Все другие показатели оставались в пределах нормы в течение всего опытного периода.

Биохимия: активность всех ферментов и уровень креатинина оставались в пределах нормы в течение всего опытного периода, за исключением ALP, активность которой повышалась в начале опыта, но оставалась стабильной в течение периода наблюдения. Значения активности ALP не изменялись после введения производных матрикса зубной эмали или LPS. Значения активности ASAT несколько повышались после введения LPS к самому концу опыта. Однако данное повышение было очень незначительным и слегка только превышало пределы нормы.

Цитокины: введение производных матрикса зубной эмали не вызывало какого-либо повышения уровня анализируемых циркулирующих цитокинов. Однако у данной свиньи наблюдали достоверно более высокий уровень TNF даже перед началом опыта (> 1500 мкг/л). Данный показатель оставался выше предела определения в период до 2 ч после введения LPS. Однако затем наблюдали быстрое снижение уровня TNF, и к концу опыта уровень TNF практически нормализовался. Концентрация IL-6 быстро возрастала после начала введения LPS. Уровень IL-6 стабильно повышался в период до 2 ч после введения LPS с максимальным значением 2500 мкг/л. Затем концентрация IL-6 снижалась, достигая нормального уровня через 5 ч после введения LPS. Наблюдали медленное, стабильное повышение уровня IL-1β, вызванное введением LPS, со значением 900 мкг/л через 5 ч, т.е. в конце опыта.

Примечания: очевидно, животное было полностью защищено от септического шока и недостаточности органов, вызванных LPS, о чем судили по клиническим признакам и показателям гемодинамики. Недостаточность органов отсутствовала, и диурез был высоким и стабильным в течение опыта. Имело место только незначительное образование асцитной жидкости, и тремор не наблюдали. Является очень необычным, что животные не реагировали, таким образом, на введение эндотоксина центрального действия (LPS). Значения гематологических и биохимических показателей указывали, что поддерживающие жизнь системы функционировали нормально и что наблюдаемые эффекты были вызваны введением токсина, а не травмой в результате операции. Воспалительный статус указывал на то, что у свиньи имело место медленное начало септического шока. Однако отсутствовали четкие признаки быстрого восстановления значений уровня IL-6 и TNF. Введение производных матрикса зубной эмали не оказывало влияния на уровень IL-1β. Без сомнений можно полагать, что данное животное, при предоставленной возможности, выжило бы в опыте.

Свинья 6

Физические данные: самка; общая масса тела 23,0 кг; здоровая.

Операция: без осложнений.

Лечение: производные матрикса зубной эмали (115 мг производных матрикса зубной эмали в 100 мл болюс-инъекции в PBS, 50 мг производных матрикса зубной эмали в 100 мл раствора Рингера в час трансфузии, суммарная доза производных матрикса зубной эмали = 365 мг), LPS (39 мкг/час в 4,5 мл PBS, непрерывное введение в течение 5 ч; суммарная доза LPS = 195 мкг).

Гемодинамика: у животного наблюдали первоначальное повышение кровяного давления в легких в ответ на начало болюс-инъекции EMD. Эффект был спонтанным и быстропроходящим (исчислялся в минутах), и не зависел от дозы, указывая на то, что производные матрикса зубной эмали оказывали кратковременное сосудосуживающее действие на легочные капилляры. Наблюдаемый эффект проходил еще до окончания болюс-инъекции.

Наблюдали сильную первоначальную ответную реакцию на введение LPS (быстрое, проходящее увеличение сердечных сокращений и артериального кровотока) с последующим средним состоянием, сохраняющимся в течение опыта. Признаки септического шока отсутствовали, как и какие-либо признаки недостаточности органов.

Анатомия и макроскопическая картина органов кровообращения на момент смерти: все органы кровообращения имели нормальную анатомию. Макроскопические признаки патологии отсутствовали в исследованных органах.

Гематология: первоначально у животного наблюдали нормальные гематологические показатели. Все значения показателей оставались в пределах нормы в течение всего опыта.

Биохимия: активность всех ферментов и уровень креатинина оставались в пределах нормы в течение всего опытного периода, за исключением ALP и ASAT, активность которых слегка повышалась в начале опыта, но оставалась стабильной в течение периода наблюдения. Значения активности ALP и ASAT оставались без изменений после введения производных матрикса зубной эмали или LPS.

Цитокины: введение производных матрикса зубной эмали не вызывало какого-либо повышения уровня анализируемых циркулирующих цитокинов. Однако у свиньи наблюдали быстрое повышение уровня TNF после введения LPS. Показатель был выше предела определения (1500 мкг/л) через 1 ч после начала введения LPS и оставался на этом уровне примерно в течение 3 ч. Через 3 ч уровень TNF быстро снижался и нормализовался к концу периода наблюдения. Также уровень IL-6 быстро повышался после начала введения LPS. Максимальную концентрацию IL-6, 2700 мкг/л, наблюдали через 2 ч после введения LPS. Однако в конце опыта уровень IL-6 снижался практически до нормального значения (350 мкг/л). Наблюдали медленное, стабильное повышение уровня IL-1β, вызванное введением LPS, с максимальным значением 1200 мкг/л через 4 ч.

Примечания: очевидно, животное было полностью защищено от тяжелого септического шока и недостаточности органов, о чем судили по показателям гемодинамики и клиническим признакам. Недостаточность органов отсутствовала, и диурез был высоким и стабильным в течение опыта. Имело место только незначительное образование асцитной жидкости, и тремор наблюдали только примерно через 4 ч после инфузии LPS. Данные факты являются необычными, особенно после наблюдаемой сильной первоначальной ответной реакции на эндотоксин (LPS). Значения гематологических и биохимических показателей указывали на то, что поддерживающие жизнь системы функционировали нормально и что наблюдаемые эффекты были вызваны введением токсина, а не травмой в результате операции. Воспалительный статус свидетельствовал о том, что у свиньи первоначально имел место септический шок (быстрое, значительное увеличение уровня TNF и IL-6). Однако имели место четкие признаки общей ремиссии в отношении значений уровня IL-6 и TNF. Введение производных матрикса зубной эмали не оказывало влияния на уровень IL-1β. Без сомнений можно полагать, что данное животное, при предоставленной возможности, выжило бы в опыте.

Краткое заключение

Контрольные животные (свиньи 1 и 3)

У обоих контрольных животных поведение было адекватным, т.е. у обоих развился септический шок примерно через 30 мин после начала введения LPS. Обе свиньи оставались живыми в течение 5 ч введения LPS, однако у них отмечались четкие клинические признаки тяжелого, неконтролируемого септического шока с повышенной температурой, полиорганной недостаточностью, почечной недостаточностью, гипотензией и пониженным сердечным выходом. Также анализ крови свидетельствовал о четких признаках септического шока. Воспалительный статус соответствовал индуцированному токсином острому септическому шоку с высокой экспрессией TNF-α и интерлейкина-6. Состояние данных свиней к концу опыта было настолько тяжелым, что оно было классифицировано как несовместимое с жизнью.

Введение производных матрикса зубной эмали в низкой дозе (свинья 2)

У свиньи, которой производные матрикса зубной эмали вводили в низкой дозе, также развился септический шок. Однако начало острой воспалительной реакции на введение LPS было замедленным примерно на 30-60 мин по сравнению с контрольными животными. После начала сепсиса состояние свиней стабилизировалось, и затем они медленно восстанавливались после шока. У данного животного отмечались несколько лучшие клинические показатели, и отсутствовали признаки почечной недостаточности (определяли по диурезу). Как и было запланировано, свинью усыпили через 5 ч после начала введения LPS. Болюс-инъекция и последующая трансфузия производных матрикса зубной эмали в низкой дозе не привела к проявлению каких-либо клинических признаков побочных реакций у данной свиньи или к изменению каких-либо контролируемых параметров в ответ на введение производных матрикса зубной эмали.

Также у свиньи наблюдалась тенденция к снижению уровня TNF и IL-6. На основании этого наблюдения, наряду с клиническими наблюдениями, можно предположить, что животное восстановилось бы от шока.

Введение производных матрикса зубной эмали в высоких дозах (свинья 4, свинья 5 и свинья 6)

Ни у одного из трех животных, которым производные матрикса зубной эмали вводили в высоких дозах, не развился тяжелый септический шок после введения LPS. У двух животных (свинья 4 и свинья 6) имело место первоначальная, но быстропроходящая ответная реакция на эндотоксин, но состояние быстро стабилизировалось, и животные быстро восстанавливались и оставались «контролируемыми» в течение всего опыта. Третье животное (свинья 5) совсем не отреагировало на введение LPS. Ни у одного из данных животных не отмечали признаков полиорганной недостаточности или почечной недостаточности. Только у одной свиньи (свинья 6) имел место характерный тремор, вызванный введением LPS. Начало тремора было достоверно замедленным (4 ч) по сравнению с контрольными животными. Как и было запланировано, свиней усыпили через 5 ч после начала введения LPS.

Болюс-инъекция и последующая трансфузия производных матрикса зубной эмали в высоких дозах не привели к проявлению каких-либо устойчивых клинических признаков побочных реакций у данных свиней. У двух свиней (свинья 5 и свинья 6) наблюдали первоначальную ответную реакцию на болюс-инъекцию. Данная ответная реакция проявлялась в виде быстрого, но кратковременного повышения легочного артериального давления, указывая на то, что введение в болюс-инъекции раствора производных матрикса зубной эмали в высоких концентрациях (примерно 1,25 мг/мл) вызывает спонтанное сужение легочных артериол и/или капилляров. Действие было мгновенным и не зависело от дозы. Наблюдаемый эффект проходил уже в течение нескольких минут, и у свиней было стабильное состояние с нормальными показателями гемодинамики и клиническим статусом еще до окончания болюс-инъекции.

У данных свиней также имелась тенденция к снижению значений уровня TNF и IL-6 практически первоначальной ответной реакции на LPS. Фактически у двух из трех животных (свинья 5 и свинья 6) уровень TNF и IL-6 почти нормализовался перед окончанием периода наблюдения. На основании данного наблюдения, наряду с клиническими наблюдениями, можно предположить, что животные были защищены от индуцированного LPS шока и последующей полиорганной недостаточности. Введение производных матрикса зубной эмали данным свиньям защитило животных от тяжелого повреждения в результате введения токсина и таким образом избавило животных от септического шока. Все три животных выжили бы в опыте.

1. Применение активного вещества зубной эмали, выбранного из группы, состоящей из амелогенинов, энамелинов, неамелогенинов, обогащенных пролином неамелогенинов, тафтелинов, тафт-белков, амелобластина, шитлина и их смесей, и/или препарата активного вещества зубной эмали для производства фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения системного воспаления и/или инфекции.

2. Применение по п.1, где указанное активное вещество зубной эмали модулирует функцию механизма иммунитета у указанного млекопитающего.

3. Применение по п.1, где, по меньшей мере, часть иммунной системы реагирует по типу гиперчувствительности на указанный иммуноген.

4. Применение по п.1, где, по меньшей мере, часть указанной иммунной системы стимулируется неизбирательно.

5. Применение по п.1, где состояние характеризуется как аутоиммунное заболевание.

6. Применение по п.5, где указанное аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, заболеваний кожи, аллергии, склероза, артериосклероза, рассеянного склероза, астмы, псориаза, волчанки, сахарного диабета, тяжелой псевдопаралитической миастении, синдрома хронической усталости, фибромиалгии, болезни Крона, тиреоидита Хашимото, болезни Грейвса, болезни Аддисона, синдрома Гиллиана-Барре и склеродермы.

7. Применение по п.1, где указанное системное состояние связано с травмой, ожогами, хирургической операцией, диализом, шоком и/или бактериальной или вирусной инфекцией.

8. Применение по п.1, где указанное системное состояние связано с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЕСМО), шока, синдрома системной воспалительной реакции (SIRS), сепсиса, полиорганной недостаточности, отторжения имплантата, такого как орган и/или протез, хирургической операции по поводу шунтирования сердца и легких, хронического воспаления, астмы и/или стресса, связанного с заболеванием легких, бактериальной инфекции, гангрены, инфекции мягких тканей и инфекции ран.

9. Применение по п.1, где указанная инфекция вызвана обсеменением бактерией, выбранной из группы, состоящей из грамотрицательных бактерий и грамположительных бактерий.

10. Применение по п.9, где указанная инфекция вызвана эндотоксином и/или экзотоксином, продуцированным указанной бактерией.

11. Применение по п.10, где указанная инфекция вызвана эндотоксином пептидогликана из Staphylococcus aureus.

12. Применение по п.10, где указанная инфекция вызвана липополисахаридами из Escherichia coli.

13. Применение по одному из пп.7-12, где указанное активное вещество зубной эмали и/или указанный препарат, входящий в состав указанной фармацевтической композиции, инактивирует токсическое действие эндотоксина и/или экзотоксина, продуцированного указанной бактерий, связыванием указанного эндотоксина и/или экзотоксина, продуцированного указанной бактерией.

14. Применение по одному из пп.7-12, где указанное активное вещество зубной эмали и/или указанный препарат, входящий в состав указанной фармацевтической композиции, инактивирует токсическое действие эндотоксина и/или экзотоксина, продуцированного указанной бактерий, связыванием клеточного рецептора указанного эндотоксина и/или экзотоксина, продуцированного указанной бактерией.

15. Применение по п.1, где указанное активное вещество зубной эмали и/или указанный препарат, входящий в состав указанной фармацевтической композиции, модулирует уровень экспрессии и/или высвобождения, по меньшей мере, одного цитокина, принимающего участие в механизме иммунитета у указанного животного.

16. Применение по п.1, где указанная фармацевтическая композиция вводится системно.

17. Применение по п.1, где указанное активное вещество зубной эмали выбрано из группы, состоящей из белков и/или пептидов амелогенинов и их смесей.

18. Применение по п.1, где указанное активное вещество зубной эмали имеет молекулярную массу по большей мере примерно 120 кДа, так, например, по большей мере 100 кДа, 90 кДа, 80 кДа, 70 кДа или 60 кДа, определенную электрофорезом SDS-PAGE.

19. Применение по п.1, где указанное активное вещество зубной эмали и/или указанный препарат содержит процессированный продукт амелогенина с массой не более чем 13 кДа.

20. Применение по п.19, где указанный процессированный продукт амелогенина выбран из группы, состоящей из растворимых пептидов на основе амелогенина с молекулярной массой в пределах примерно 2-13 кДа, включая растворимый пептид на основе амелогенина с молекулярной массой в пределах 2-4,5 кДа, 3-5,5 кДа, 4-6,5 кДа, 5-7,5 кДа или 5-13 кДа.

21. Применение по п.1, где указанный процессированный продукт амелогенина представляет полипептид с молекулярной массой 5 кДа.

22. Применение по п.1, где указанное активное вещество зубной эмали имеет молекулярную массу примерно до 40000.

23. Применение по п.1, где указанное активное вещество зубной эмали имеет молекулярную массу в пределах примерно от 5000 до примерно 25000.

24. Применение по п.1, где основная фракция указанного активного вещества зубной эмали имеет молекулярную массу примерно 20 кДа.

25. Применение по п.1, где указанный препарат активного вещества зубной эмали содержит смесь активных веществ зубной эмали с различной молекулярной массой.

26. Применение по п.1, где указанный препарат активного вещества зубной эмали содержит, по меньшей мере, два вещества, выбранных из группы, состоящей из амелогенинов, богатых пролином неамелогенинов, тафтелина, тафт-белков, белков слюны, амелобластина и шитлина.

27. Применение по п.1, где содержание белка в указанном активном веществе зубной эмали в препарате находится в пределах примерно от 0,005% мас./мас. до 100% мас./мас., так, например, примерно 5-99% мас./мас., примерно 10-95% мас./мас., примерно 15-90% мас./мас., примерно 20-90% мас./мас., примерно 30-90% мас./мас., примерно 40-85% мас./мас., примерно 50-80% мас./мас., примерно 60-70% мас./мас., примерно 70-90% мас./мас. или примерно 80-90% мас./мас.

28. Применение по п.1, где фармацевтическая композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый наполнитель.

29. Применение по п.28, где фармацевтически приемлемый наполнитель представляет забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).

30. Способ лечения и/или профилактики системного воспаления и/или инфекции у млекопитающего при его необходимости введением эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей активное вещество зубной эмали, выбранное из группы, состоящей из амелогенинов, энамелинов, неамелогенинов, обогащенных пролином неамелогенинов, тафтелинов, тафт-белков, амелобластина, шитлина и их смесей, и/или препарат активного вещества зубной эмали.

31. Способ по п.30, где активное вещество зубной эмали модулирует функцию механизма иммунитета у млекопитающего при его необходимости.

32. Способ по п.30, где дисбаланс иммунного ответа представляет реакцию по типу гиперчувствительности на указанный раздражитель.

33. Способ по п.30, где дисбаланс иммунного ответа характеризуется неспособностью реагировать на указанные раздражители.

34. Способ по п.30, где дисбаланс иммунного ответа характеризуется неизбирательной стимуляцией указанной иммунной системы.

35. Способ по п.30, где системное состояние связано с травмой, ожогами, хирургической операцией, диализом, шоком и/или бактериальной или вирусной инфекцией.

36. Способ по п.30, где системное состояние связано с экстракорпоральной мембранной оксигенацией (ЕСМО), шоком, синдромом системной воспалительной реакции (SIRS), сепсисом, полиорганной недостаточностью, отторжением имплантата, такого как орган и/или протез, хирургической операцией по поводу шунтирования сердца и легких, хроническим воспалением, астмой и/или стрессом, связанным с заболеванием легких, бактериальной инфекцией, гангреной, инфекцией мягких тканей и инфекцией ран.

37. Способ по п.30, где инфекция вызвана обсеменением бактерией, выбранной из группы, состоящей из грамотрицательных бактерий и грамположительных бактерий.

38. Способ по п.30, где инфекция вызвана эндотоксином и/или экзотоксином, продуцированным указанной бактерией.

39. Способ по любому из пп.30-34, где дисбаланс иммунного ответа является аутоиммунным заболеванием.

40. Способ по п.39, где аутоиммунное заболевание выбрано, но не ограничиваясь этим, из ревматоидного артрита, заболеваний кожи, аллергии, склероза, артериосклероза, рассеянного склероза, астмы, псориаза, волчанки, сахарного диабета, тяжелой псевдопаралитической миастении, синдрома хронической усталости, фибромиалгии, болезни Крона, тиреоидита Хашимото, болезни Грейвса, болезни Аддисона, синдрома Гиллиана-Барре и склеродермы.

41. Способ по п.30, где активное вещество зубной эмали в фармацевтической композиции модулирует уровень экспрессии и/или высвобождения цитокинов, принимающих участие в механизме иммунитета у указанного животного.

42. Способ по п.30, где фармацевтическая композиция, содержащая активное вещество зубной эмали, вводится системно.

43. Способ по п.30, где активное вещество зубной эмали имеет молекулярную массу по большей мере примерно 120 кДа, так, например, по большей мере 100 кДа, 90 кДа, 80 кДа, 70 кДа или 60 кДа, определенную электрофорезом SDS-PAGE.

44. Способ по п.30, где препарат активного вещества зубной эмали содержит смесь активных веществ зубной эмали с различной молекулярной массой.

45. Способ по п.30, где препарат активного вещества зубной эмали содержит, по меньшей мере, два вещества, выбранных из группы, состоящей из амелогенинов, богатых пролином неамелогенинов, тафтелина, тафт-белков, белков слюны, амелобластина и шитлина.

46. Способ по п.30, где указанное активное вещество зубной эмали имеет молекулярную массу примерно до 40000.

47. Способ по п.30, где активное вещество зубной эмали имеет молекулярную массу в пределах примерно от 5000 до примерно 25000.

48. Способ по п.30, где основная фракция активного вещества зубной эмали имеет молекулярную массу примерно 20 кДа.

49. Способ по п.30, где содержание белка в активном веществе зубной эмали в препарате находится в пределах примерно от 0,005% мас./мас. до 100% мас./мас., так, например, примерно 5-99% мас./мас., примерно 10-95% мас./мас., примерно 15-90% мас./мас., примерно 20-90% мас./мас., примерно 30-90% мас./мас., примерно 40-85% мас./мас., примерно 50-80% мас./мас., примерно 60-70% мас./мас., примерно 70-90% мас./мас. или примерно 80-90% мас./мас.

50. Способ по п.30, где фармацевтическая композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый наполнитель.

51. Способ по п.50, где фармацевтически приемлемый наполнитель представляет забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).

52. Способ по п.51, где фармацевтическая композиция содержит 30 мкг белка матрикса зубной эмали и 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).

Приоритет по пунктам:

14.09.2001 по пп.1-12, 15-52;

06.09.2002 по пп.13, 14.