Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве питательных сред для суспензионного культивирования клеток. Питательная среда содержит натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, L-цистин, пантотенат кальция, пиридоксаль HCl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, сыворотку крупного рогатого скота, амфотерицин, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат и дистиллированную воду. Изобретение позволяет получить качественную и экономически выгодную питательную среду. 2 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение. Область биотехнологии, сфера питательных сред, суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка (ВНК - 21).

Уровень техники. Из литературных данных известны прописи питательных сред для суспензионного культивирования клеток:

- среда Купера (Методические рекомендации по работе с клеточными культурами и средами /Под ред.А.А.Сомниной.- Ленинград.- 1975. - стр.38-40),

- специальная среда для культивирования клеток ВНК-2.1 (Голубев Д.Б., Сомнина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии.- Л.: Медицина, 1976. стр.19),

- среда Мак-Коя для суспензионного культивирования RPMI - 1640 (Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии / Под ред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситькова В.И. - М.: Компания Спутник, 2000. стр.53- 55).

В состав перечисленных питательных сред входят: неорганические соли, аминокислоты, витамины, углеводы. Из указанных аналогов наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является среда RPMI-1640 (табл.1).

В представленной таблице к существенным отличительным признакам патентуемой питательной среды относятся те, что среда дополнительно содержит гидролизат мышечных белков ферментативный сухой и гидролизат лактальбумина ферментативный и только пять аминокислот вместо 20 аминокислот в прототипе.

Раскрытие изобретения.

(1) Сведения, раскрывающие сущность изобретения.

(1.1) Сущность изобретения: подобран состав компонентов питательной среды, включающий: гидролизат мышечных белков ферментативный сухой и гидролизат лактальбумина ферментативный; аминокислоты - аргинин, глутамин, тирозин, триптофан и цистин, обеспечивающий накопление клеток, при суспензионном культивировании перевиваемой линии ВНК-21 до 3,5·10⁶ кл./см³.

(1.2.) Техническим результатом заявляемого изобретения является создание экономически выгодной питательной среды для суспензионного культивирования клеток ВНК-21 в условиях массового биопроизводства при изготовлении культуральных вакцин.

Технический результат достигнут введением в состав питательной среды оптимального количественного соотношения компонентов, представленных в таблице 2.

Осуществление изобретения.

Изобретение относится к композиции в которую входят ингредиенты в соотношениях количества граммов на 1 литр дистиллированной воды, указанных в таблице 2.

Способ получения композиции следующий: навески отдельных компонентов берут, соблюдая правила взвешивания для весов соответствующего класса. Учитывая объем приготавливаемой смеси, допускается взвешивание солей, гидролизатов, глюкозы на весах 3-го класса; навески отдельных аминокислот, витаминов и антибиотиков - на аналитических весах 2-го класса с соблюдением точности до второго знака после запятой.

Процесс приготовления питательной среды заключается в приготовлении солевой основы среды, которой является раствор Хенкса, и растворении в нем антибиотиков, солей, глюкозы, гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного по 1,25 г/л с конечной концентрацией суммы гидролизатов в питательной среде, равной 0,25%, пяти аминокислот, сыворотки, витаминов, бикарбоната натрия.

Растворение компонентов питательной среды ведут в дистиллированной воде, имеющей температуру 35-40°С, при непрерывном перемешивании. В начале растворяют антибиотики и навески солей поочередно NaCl, KCl, MgSO₄·7H₂O, Na₂HPO₄·12H₂O (развести в горячей воде), KH₂PO₄ до полного растворения предыдущей навески, вносят навеску глюкозы 3,6 г/л среды. Дополнительно к механическому перемешиванию осуществляют перемешивание сжатым воздухом, т.е. барботированием в течение 10 минут. После растворения навесок убирают барботирование. В глюкозосолевой раствор осторожно, тонкой струйкой при механическом перемешивании вносят хлористый кальций (CaCl₂) в виде 40%-ного раствора и вновь барботируют. Из указанного в табл.2 количества гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного готовят 10%-ный раствор и вносят его в полученный глюкозосолевой раствор, и растворяют в течение 10 минут перемешиванием и барботированием.

Отдельно растворяют аминокислоты. Растворение навесок проводят последовательно согласно прописи питательной среды в таблице 2. L-цистин и l-тирозин растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании до кипения с добавлением по каплям концентрированной соляной кислоты (d=1,19) до полного просветления раствора. Сначала растворяют l-цистин, затем l-тирозин. Если при внесении l-тирозина раствор помутнел, необходимо вновь вносить по каплям концентрированную HCl, до полного растворения навески. Вместо l-цистина можно использовать l-цистин HCl и растворять l-цистин HCl просто в кипящей воде.

Все витамины, кроме рибофлавина и фолиевой кислоты, последовательно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры. При этом каждую последующую навеску растворяют только после полного растворения предыдущей. Рибофлавин и фолиевую кислоту растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры с добавлением по каплям 20%-ного раствора NaOH до полного растворения навесок. Сначала растворяют рибофлавин, затем фолиевую кислоту, при растворении которой необходимо вновь по каплям вносить 20%-ный р-р NaOH до полного просветления раствора.

В глюкозосолевой раствор вносят растворы аминокислот, витаминов, сыворотку, натрий двууглекислый и перемешивают. После внесения в среду всех необходимых компонентов добавляют дистиллированную воду до необходимого объема, перемешивают, стерилизуют фильтрацией в реактор для культивирования клеток.

Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих, содержащая натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, L-цистин, пантотенат кальция, пиридоксаль HCl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, сыворотку крупного рогатого скота, амфотерицин, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат и дистиллированную воду, при следующем содержании компонентов, г/л:

Натрий хлористый	8,0
Калий хлористый	0,4
Магний сернокислый	0,2
Натрий фосфорнокислый
двузамещенный	0,15
Калий фосфорнокислый
однозамещенный	0,06
Кальций хлористый	0,14
Натрий двууглекислый	0,35
L-аргинин	0,042
L-глутамин	0,584
L-тирозин	0,02
L-триптофан	0,015
L-цистин	0,032
Пантотенат кальция	0,0034
Пиридоксаль HCl	0,0034
Тиамин	0,0034
Мезо-инозит	0,0068
Никотинамид	0,0034
Рибофлавин	0,00034
Фолиевая кислота	0,0034
Глюкоза	3,6
Ферментативный гидролизат
мышечных белков	1,25
Ферментативный
гидролизат лактальбумина	1,25
Сыворотка крупного
рогатого скота	70,0 мл
Амфотерицин	2·103 ед
Бензилпеницилина
натриевая соль	1·105 ед
Канамицина сульфат	1·105 ед
Дистиллированная вода	Остальное