Способ получения биомассы клеток растений

Способ получения биомассы клеток растений включает приготовление питательной среды, содержащей неорганические компоненты, подложку, углеводы, витамины и стимуляторы роста, посадку клеток биомассы, культивирование их и получение продукта. На стадии приготовления питательной среды твердой или жидкой в качестве неорганических компонентов используют смесь стеклообразных метафосфатов переменного состава при следующем содержании, мас.%: окись фосфора 40-60, окись калия 10-30, окись кальция 5-20, окись магния 3-13, окись кремния 1-6, окись бора 1-6, окислы других элементов таблицы Менделеева (Со, Cu, Fe, Mo, Mn, Cr, Zn, Ge, Se, V) 0,05-2%. Смесь стеклообразных метафосфатов с указанным выше составом представляет собой вещество, известное под торговой маркой Агровитаква-AVA, стекловидное удобрение пролонгированного действия, разработанное ЗАО «Агровит» г.Санкт-Петербург (ТУ 2189-001-50032241-99). Упрощение на стадии приготовления концентратов для питательных сред снижает риск ошибок за счет «человеческого» фактора, улучшает контроль, повышает надежность производства биотехнологического продукта и повышает его экономичность. 18 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно способам получения биомассы растений для получения сырья и создания новых лекарственных препаратов, а также может быть использовано в пищевой или косметической промышленности.

Клеточные биотехнологии на основе культивируемых in vitro клеток и тканей растений входят в качестве обязательной части во все национальные биотехнологические программы и проекты. Вот только некоторые особенности, которые характеризуют эти технологии:

- способность получать клеточную массу (генетически модифицированную или нет) традиционно используемых экономически важных растений в неограниченном количестве,

- способность синтезировать биологически активные вещества, синтез которых обычным путем труден или дорог или трансформировать дешевые предшественники в конечный ценный продукт,

- создавать принципиально новые продукты, превосходящие традиционные по своим качествам и экологически чистые.

Поэтому создаваемые биотехнологические производства должны быть способными выдерживать конкуренцию с альтернативными системами получения продукта. Последнее в большей мере обеспечивается штаммом культивируемых клеток, его продуктивностью, интенсивностью синтеза целевого продукта, условиями и технологией его культивирования.

Имеется большое количество работ, в которых показано, что на накопление искомого продукта влияют как минеральные, так и гормональные составляющие питательной среды, температура, освещенность и другие факторы.

Одним из обязательных компонентов питательных сред в биотехнологии для всех культур является наличие макро- и микросолей различных элементов, а также наличие стимуляторов роста, углеводов и витаминов. Причем для разных культур этот состав сильно варьируется, но в него обязательно входят минеральные (фосфатные и азотные) соли калия, натрия, хеллата железа, хрома и цинка, меди и бора и других элементов, которые необходимы клеткам как для роста, так и для синтеза продуктов первичного и вторичного метаболизма (см. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. // Изд. «Наука», М., стр.270, Ф.А.Калинин, В.В.Сарнацкая, В.Е.Полищук. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений // Изд. "Наукова думка", Киев, 1980 г., стр. 483). Соотношение этих элементов в разных штаммах может значительно отличаться и подлежит строгому контролю даже на разных этапах роста клеток.

Известен способ получения биомассы женьшеня и других аралиевых по Авторскому свидетельству СССР №1621510, приоритет 08.09.88 г. Этот способ, как наиболее близкий по своей технической сущности, выбран нами за прототип.

Известный способ включает приготовление питательной среды, содержащей неорганические компоненты, углеводы, витамины и стимуляторы роста, посадку клеток биомассы, культивирование их и получение продукта. В качестве неорганических компонентов используют микро- и макросоли по Мурасиге и Скугу, состоящие из 12 различных элементов.

Недостатками прототипа является то, что технологический процесс приготовления концентратов для питательных сред занимает много времени, т.к. каждую соль из стандартного состава надо приготовить в отдельности, кроме того, концентраты приготовленных солей имеют ограниченный срок хранения, а также стоимость солей довольно высокая.

Поэтому возможность замены множества макро- и микросолей одним минеральным компонентом, содержащим все необходимые для клетки соли и другие экологически чистые природные стимуляторы роста, является чрезвычайно актуальной задачей, особенно для промышленной биотехнологии. Можно путем селекции получить клеточную линию, которая будет расти на уменьшенных концентрациях солей, особенно нитратов, что актуально сейчас, когда некоторые штаммы растительных клеток, в том числе и женьшеня, предлагают использовать как биологически активные добавки (БАД).

Процесс культивирования растительных клеток, связанных с их многократной рекультивацией на новых питательных средах с целью получения продукта или сохранения штаммов-продуцентов, очень трудоемок и многостадиен. Поэтому упрощение его на стадии приготовления концентратов для питательных сред снижает риск ошибок за счет «человеческого» фактора, улучшает контроль и повышает надежность производства биотехнологического продукта, а значит и повышает его экономичность.

При создании данного изобретения ставилась задача разработки сравнительно дешевого и безопасного способа производства биомассы клеток растений, который можно использовать в промышленном производстве. Для решения этой задачи в способе получения биомассы клеток растений, включающем приготовление питательной среды, содержащей неорганические компоненты, подложки, углеводы, витамины и стимуляторы роста, посадку клеток биомассы, культивирование их и получение продукта, предлагается на стадии приготовления питательной среды твердой или жидкой в качестве неорганических компонентов использовать смесь стеклообразных метафосфатов переменного состава при следующем содержании, мас.%:

окись фосфора	40-60
окись калия	10-30
окись кальция	5-20
окись магния	3-13
окись кремния	1-6
окись бора	1-6
окислы других элементов таблицы Менделеева
(Со, Cu, Fe, Mo, Mn, Cr, Zn, Ge, Se, V)	0,05-2

причем состав метафосфатов и концентрацию микроэлементов подбирать на основании анализа зольных остатков получаемых растений.

Смесь стеклообразных метафосфатов с указанным выше составом представляет собой вещество, известное под торговой маркой Агровитаква-AVA, стекловидное удобрение пролонгированного действия, разработанное ЗАО «Агровит» г.Санкт-Петербург (ТУ 2189-001-50032241-99). Сырьем для его производства являются фосфорная кислота (70-75%), доломитовая мука, раствор поташа (45-50%) и порошок магнезитовый каустический. На заключительной стадии производства добавляются микроэлементы из числа оксидов элементов 3-5 групп Периодической системы элементов Д.И.Менделеева. Концентрация микроэлементов подбирается на основании анализа зольных остатков получаемых при сжигании интересующих нас растений.

Известно, что микроэлементный состав существенно различается при переходе от одного типа растений к другому. Недостаток в почве железа, кобальта, меди и др. микроэлементов может вызвать болезни и гибель многих растений. Не меньший вред могут оказывать и избыточные количества микроэлементов в грунте, что, кроме того, строго регламентируется законодательством большинства стран мира. Тем не менее, большинство растений толерантно в широких пределах к изменению концентрации микроэлементов при низкой общей концентрации микроэлементов (˜0,1 мас.%) во вносимых удобрениях.

Лекарственные растения имеют специфику, связанную с тем, что они предназначаются для людей с теми или иными заболеваниями. Различные органы человеческого тела содержат микроэлементы в разных концентрациях. В связи с этим огромную роль при выборе удобрений приобретает характер растения и его лекарственное назначение в пределах толерантности растения и пациента к тем или иным микроэлементам. Таким образом выстраивается цепочка (Почва-Удобрение - Толерантность растения - Толерантность человека).

Опыты в области физиологии растений по сжиганию растений и исследованию зольных остатков позволили определить, что плоды, растительная масса и корни характеризуются значительными различиями по концентрации микроэлементов. Проблема микродозирования особенно сложна при выращивании растений для создания лекарственных препаратов, т.к. ферментативный катализ обеспечивается совокупным действием нескольких микроэлементов.

Зная о полезных свойствах различных растений, можно установить пределы содержания различных микроэлементов в удобрении при выращивании лекарственных культур на различных почвах по результатам изучения их зольных остатков. Это позволяет создать оптимальные условия для роста и сознательно управлять свойствами растений.

В качестве подложек в предлагаемом способе могут использоваться агар-агар, фитогель, шелк, бумага, пропиленгликоль и отходы растительных фитомасс.

- углеводов: сахароза, глюкоза, фруктоза;

- витаминов: инозит, тиамин хлорид и т.д.

- стимуляторов роста: кинетин, α-нафтилуксусная кислота и др.

На стадии получения биомассы культивирование ведут на питательной среде измененного состава, а для поддержания стабильности штамма используют среду известного состава, таким образом проводят двухэтапное культивирование штамма: на первом этапе при рекультивации для сохранения стабильности штамма культивирование ведут на стандартной питательной среде, а на втором для получения биомассы используют измененную питательную среду, состав которой приводится в данном изобретении.

Способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе для культивирования биомассы растений используют контрольную питательную среду по Мурасиге и Скугу. В сосудах емкостью по 250 мл помещают биомассу штамма в количестве 2,0-2,5 г на 50 мл питательной среды. Далее ведут культивирование в темноте при температуре 26-27°С в течение 35 суток.

На втором этапе культивирования выросшую биомассу в количестве 2,0-2,5 г переносят в емкости по 250 мл, в которых содержится по 50 мл питательной среды, приготовленной на основе смеси стеклообразных метафосфатов AVA. Культивирование ведут в тех же условиях, что и на первом этапе. По окончании культивирования определяют основные показатели биомассы.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Материалом для данных исследований являлся штамм женьшеня - Panax ginseng С.А. Меу., культивируемый в Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПХФА) с 1969 года (шифр коллекции - «Д»). Это был один из первых в России биотехнологических штаммов, который был широко внедрен на многих биотехнологических производствах СССР. Сегодня этот штамм остается одним из основных в фитобиотехнологии лекарственных растений in vitro, который не только используется для решения ряда теоретических и практических задач, но также для получения ценных лекарственных препаратов и БАД.

Сегодня очень остро стоит вопрос о разработке биотехнологии этого и многих других ценных лекарственных растений, одни из которых варварски истреблены в природе и разрушена их сельскохозяйственная культура, например у женьшеня, а у других базы их культивирования теперь находятся на территории других государств (Украине, Грузии, Казахстане).

Кроме данного штамма женьшеня, была использована селективная линия штамма женьшеня, полученная в СПХФА на питательной среде, не содержащей нитрата аммония и стимулятора роста кинетина (шифр коллекции СПХФА «Д-»).

Вместо микро- и макросолей по Мурасиге и Скугу использовалась смесь стеклообразных метафосфатов переменного состава, имеющая товарную марку Агровитаква-AVA трех вариантов:

1. AVA-1 (шифр AVA-1, Универсал) следующего состава, %:

окись фосфора	50
окись калия	21
окись кальция	15
окись магния	6
окись кремния	1.0
окись бора	1.8
окислы других элементов таблицы Менделеева
(Со, Cu, Fe, Mo, Mn, Cr, Zn, Ge, Se, V)	0,05-2

Со	0,03
Cu	0,02
Fe	0,5
Mo	0,03
Mn	0,1
Cr	0,002
Zn	0,01
Ge	0,001
Se	0,00005
V	0,001

2. AVA с гуминовыми кислотами (97% AVA + 3% гумата) (шифр-АУА + ГУМ) следующего состава, %:

окись фосфора	50
окись калия	21
окись кальция	15
окись магния	6
окись кремния	1.0
окись бора	1.8
азот	0,8
углерод	1.3
(Со, Cu, Fe, Mo, Mn, Cr, Zn, Ge, Se, V)	0.05-2

Со	0,03
Cu	0,02
Fe	0,5
Мо	0,03
Mn	0,1
Cr	0,002
Zn	0,01
Ge	0,001
Se	0,00005
V	0,001

3. AVA с карбомидом мочевины (85% AVA + 15% карбомида мочевины) (шифр AVA + М) следующего состава, %:

окись фосфора	52
окись калия	18
окись кальция	14
окись магния	5
окись кремния	1.5
окись бора	1.2
окислы других элементов таблицы Менделеева
(Со, Cu, Fe, Мо, Mn, Cr, Zn, Ge, Se, V)	0,05-2

Со	0,02
Cu	0,01
Fe	0,7
Мо	0,02
Mn	0,05
Cr	0,003
Zn	0,01
Ge	0,002
Se	0,0001
V	0,001

Остальные компоненты контрольной питательной среды соответствовали стандартной среде и содержали: сахар - 3%, агар-агар - 0,6%, инозит - 0,08 г/л, гидролизат казеина - 0,5 г/л, железа хеллат - 5,0 мл/л, α-нафтилуксусную кислоту - 2 мл/л и кинетин - 1 мл/л.

Штаммы культивировали в стандартных условиях при температуре 26-28°С на агаризованной среде в колбах на 250 мл на 50 мл питательной среды, приготовленной в следующих вариантах:

№1. Контрольная среда - макросоли по Мурасиге и Скугу - 50,0 мл/л

микросоли по Мурасиге и Скугу - 1 мл/л

сахар - 3%, агар-агар - 0,6%

инозит - 0,08 г/л, гидролизат казеина - 0,5 г/л

железа хелат - 5 мл/л

α-нафтилуксусная кислота - 2 мл/л

кинетин - 1 мл/л.

№2. Штамм женьшеня (Д) среда: вместо макро- и микросолей даны AVA-1-1 г/л, остальные компоненты по прописи контрольной среды, но без стимулятора роста кинетина.

№3. Штамм женьшеня (Д) среда: вместо макро- и микросолей даны AVA + ГУМ - 1 г/л, остальные компоненты по прописи контрольной среды, но без стимулятора роста кинетина.

№4. Штамм женьшеня (Д) среда: вместо макро- и микросолей даны AVA + М - 1 г/л, остальные компоненты по прописи контрольной среды, но без стимулятора роста кинетина.

№5. Штамм женьшеня (Д-) среда: вместо макро- и микросолей даны AVA + ГУМ - 1 г/л, остальные компоненты по прописи контрольной среды, но без стимулятора роста кинетина.

№6. Штамм женьшеня (Д-) среда: вместо макро- и микросолей даны AVA + М - 1 г/л, остальные компоненты по прописи контрольной среды, но без стимулятора роста кинетина.

Цикл культивирования во всех вариантах составлял 35 суток.

В конце цикла определяли сырую и сухую массы ткани, белок по Лоури, водорастворимые полисахариды ВРП и суммарную гликозидную фракцию - СГФ.

Контролируемыми параметрами во всех вариантах являлся постоянный контроль за ростом биомассы по показателям сырой и воздушно-сухой массы тканей в условиях культуры in vitro в банке СПХФА на протяжении одного цикла выращивания - 35 суток.

Так же определяли содержания водорастворимых полисахаридов (ВРП) и суммы гликозидов (СГФ) как одних из основных действующих веществ в конце цикла культивирования.

Можно отметить, что в данном варианте опытов полностью отсутствовали инфицированные сосуды. Рост биомассы во всех вариантах проходил по характерной "S"-образной кривой с сокращением "lag"-периода с 5 дней в контроле до 3-х дней в опытных вариантах.

Морфологически биомасса клеток женьшеня во всех вариантах отличалась более желтым цветом, чем в контроле, оставаясь в нижней части светлой, крупнозернистой и часто клетки биомассы врастали в питательную среду. Это свидетельствовало о хорошем потреблении солей из агар-агара.

В конце цикла культивирования на 35 сутки (срок наблюдения) биомасса была отделена от остатков питательной среды и высушена в инфракрасной сушилке. В воздушно-сухой биомассе была определена сумма водорастворимых полисахаридов-ВРП и сумма гликозидов-СГФ как основных биологически активных веществ, с которыми связывают широкий спектр фармакологической активности препаратов женьшеня.

Ростовые параметры (сырой и воздушно-сухой массы) в процессе оптимизации среды и роста штамма учитывали общепринятым методом. Во всех вариантах учитывали данные из пяти однотипных сосудов, все данные обработаны статистически.

Ниже приведены показатели сырой и сухой массы тканей штамма женьшеня при выращивании на экспериментальных средах (табл.1).

Таблица 1 Показатели сырой и сухой массы тканей штамма женьшеня на экспериментальных средах
Вариант среды	Штамм	Сырая масса, г/50 мл среды	Сухая масса, г/50мл среды
Контроль	Д	31,40±1,2	1,00±0,01
AVA - 1	Д	20,76±2,7	0,95±0,02
AVA + ГУМ	Д	16,80±2,8	0,81±0,02
AVA + М	Д	19,30±1,5	0,96±0,05
Контроль	Селективный Д-	36,10±03	1,59±0,03
AVA - 1	Селективный Д-	20,48±0,5	1,10±0,02
AVA + M	Селективный Д-	15,6±0,6	0,91±0,01
AVA + ГУМ	Селективный Д-	16,80±0,4	0,94±0,01

Из приведенных данных видно, что на всех вариантах сред с AVA накопление сырой массы клеток значительно снижалось на 40-50%. В то же время воздушно-сухая масса клеток практически не отличалась от контрольного варианта у штамма женьшеня и незначительно уступала в случае с селективным штаммом (без нитрата аммония и кинетина). Возможно, что в первом случае (штамм Д) на рост биомассы сказалось отсутствие стимулятора роста кинетина в среде, что вызвало меньшее растяжение клеток и их обводненность и замедлило рост, а также стресс, очевидно связанный с заменой некоторых компонентов питательной среды. Снижение сырой массы клеток у селективного штамма (Д-) также возможно связано со стресс-воздействием.

В связи с этим представляло интерес сравнить накопление белка в клетках в процессе культивирования на средах со стеклообразными метафосфатами AVA (табл.2).

Таблица 2 Показатели накопления белка в биомассе клеток штамма женьшеня при культивировании на средах со смесью стеклообразных метафосфатов
Штамм	Вариант	Содержание белка, мг/г биомассы
Женьшень - Д	Контроль	2,30±0,05
Женьшень - Д	AVA - 1	3,01±0,03
Женьшень - Д	AVA + ГУМ	2,85±0,02
Женьшень - Д	AVA + M	2,62±0,01
Селективный женьшень	- Контроль	3,60±0,05
Селективный женьшень	- AVA - 1	3,25±0,03
Селективный женьшень	- AVA + ГУМ	3,10±0,02
Селективный женьшень	- AVA + M	3,20±0,01

Приведенные показатели свидетельствуют, что содержание белка в клетках женьшеня (штамм-Д) не только не уступало контрольному варианту, но даже превосходило последний, несмотря на отсутствие стимулятора роста. Селективный штамм также показал высокий уровень накопления белка в клетках биомассы на всех вариантах питательных сред с AVA. Это свидетельствует о том, что макро- и микроэлементный состав стеклообразных метафосфатов AVA во всех вариантах был достаточен для прохождения всех метаболических процессов синтеза белка.

Была определена активность ферментов антиоксидантной защиты в штаммах женьшеня на конечном этапе роста культур на средах с различным содержанием стеклообразных метафосфатов AVA (табл.3).

Таблица 3 Показатели удельной активности антиоксидантных ферментов в биомассе штаммов женьшеня при росте на питательных средах со смесью стеклообразных метафосфатов AVA
Штамм	Вариант среды	Каталаза, Е/г белка	СОД, Е/г белка
Женьшень (Д)	Контроль	75,5±10,5	56,7±5,1
Женьшень (Д)	AVA - 1	15,2±3,5	31,8±2,0
Женьшень (Д)	AVA + M	15,2±3,5	31,8±2,0
Женьшень (Д)	AVA + ГУМ	12,4±1,5	29,0±1,5
Селективный Д -	Контроль	28,0±2,0	12,1±0,2
Селективный - Д-	AVA - 1	30,0±2,0	13,5±0,5
Селективный - Д-	AVA + M	27,5±3,0	9,45±0,5
Селективный - Д-	AVA + ГУМ	28,6±1,0	13,3±0,2

Полученные данные показывают, что уровень активности обоих ферментов антиоксидантной защиты в биомассе у штамма женьшеня во всех вариантах питательных сред со стеклянными метафосфатами AVA в 1,5-2 раза был ниже, чем в контроле. В то же время у селективного штамма, адаптированного к росту без нитрата аммония и кинетина, как уровень активности каталазы, так и супероксиддисмутазы (СОД) практически не отличался от уровня активности этих ферментов в контрольном варианте.

Это можно объяснить тем, что токсических перекисных радикалов при использовании данных удобрений во всех вариантах образуется меньше, что возможно связано с уменьшением интенсивности дыхания.

Учитывая, что гликозиды женьшеня и полисахариды являются одними из основных биологически активных продуктов метаболизма, был проведен сравнительный анализ данных веществ в биомассе штаммов женьшеня (табл.4).

Таблица 4 Показатели содержания суммарной гликозидной фракции (СГФ) и водорастворимых полисахаридов (ВРП) в биомассе штамма женьшеня
Штамм	Вариант среды	СГФ, %	ВРП, %
Женьшень - Д	Контроль	4,10±0,2	8,00±0,51
Женьшень - Д	AVA + ГУМ	4,30±0,3	4,15±0,20
Женьшень - Д	AVA + M	4,50±0,2	3,50±0,10
Женьшень - Д	AVA - 1	3,85±0,1	5,21±0,11
Селективный - Д	Контроль	4,17±0,5	10,00±0,60
Селективный - Д-	AVA - 1	3,69±0,3	8,85±0,40
Селективный - Д	AVA + M	4,20±0,2	5,45±0,25
Селективный - Д-	AVA + ГУМ	4,53±0,4	6,75±0,30

Таким образом, анализируя полученные данные, можно сделать заключение, что содержание суммарной гликозидной фракции (СГФ) в штамме женьшеня во всех вариантах практически не зависит от внесенных AVA.

Содержание водорастворимых полисахаридов снизилось по сравнению с контролем почти в два раза, но все-таки оно осталось достаточно высоким. Возможно при увеличении дозы "AVA + ГУМ" и "AVA + М" содержание ВРП может повыситься. Как показали наши предыдущие исследования с " AVA - 1", при их концентрации 3 г/л проходило повышение содержания ВРП в штамме женьшеня до 10,7%.

Подводя итоги выполненным исследованиям, можно сделать заключение, что использование новых стекообразных метафосфатов AVA в модификациях с гуматом и карбомидом мочевины вместо комплекса макро- и микросолей по прописи Мурасиге и Скуга в контрольной среде не влияло на накопление воздушно-сухой биомассы штаммов женьшеня даже при первом пассаже при отсутствии одного из стимуляторов роста - кинетина.

Биологическая продуктивность по накоплению белка в биомассе штаммов женьшеня не уступала контрольным вариантам, а в некоторых случаях даже была выше. Содержание основных действующих веществ: суммы гликозидов и водорастворимых полисахаридов также оставались достаточно высокими.

Пример 2

Штамм панакса пятилистного, так же как и штамм женьшеня, был впервые получен Л.И.Слепян и Р.Г.Бутенко от 6-летнего оранжерейного корня из коллекции Ботанического Института АН СССР. С 1969 г. штамм находится в коллекции банка СПХФА (шифр Ам).

Штамм культивируют на такой же питательной среде, как и штамм женьшеня, с циклом 35 суток в сосудах на 250 мл на 50 мл питательной среды при температуре 25-26°С. Биомасса светло желтого цвета, рыхлая, легко отделяется от питательной среды в конце цикла культивирования. Доказано, что он содержит основные гликозиды, близкие к гликозидам женьшеня, - это Rb₁, Re, Rd и Re. В отличие от женьшеня гликозиды Rb₁ и Rg₁, оказывающие стимулирующий эффект, в американском женьшене практически отсутствуют. Поэтому американский женьшень проявляет мягкое седативное действие и так же, как и женьшень, обладает антиканцерогенным действием. Установлено, что он повышает защиту клеток крови против повреждающего действия эффекта О-ЛПНП. Кроме этого, в американском женьшене идентифицированы гинзенозиды F₂, псевдогинзенозид F₁₁ и квинквелозид R₁.

Наряду с гинзенозидами растение содержит активные пептиды и полисахариды, с которыми связывают иммунологическую и радиопротекторную активность. Эфирные масла, витамины и микроэлементы и незаменимые аминокислоты, определяющие антидепрессивное действие и антиоксидантное и другие свойства этого вида женьшеня. Липофильная фракция, представленная жирными кислотами, липидами, β-ситостерином и панаценом. Последний оказывает болеутоляющее и седативное действие. Этот набор веществ в комплексе и определяет тот широкий рынок препаратов и продуктов, которые сегодня завоевывает корень американского женьшеня. Поэтому культура ткани in vitro штамма панакса пятилистного не менее перспективна и была выбрана в качестве второго объекта исследований.

В связи с этим были проведены эксперименты по изучению влияния стеклообразных метафосфатов AVA на рост и биологическую продуктивность штамма панакса пятилистного (шифр Ам) и селективного штамм американского женьшеня, адаптированного к росту на питательной среде без аммонийного азота и стимулятора роста кинетина (шифр Ам-)

Все варианты питательной среды с AVA были взяты в таких же концентрациях, как и в предыдущих опытах для штамма женьшеня.

В конце сроков культивирования биомасса была отделена от агар-агара, высушена в инфракрасной сушилке и в ней были определены сырая и воздушно-сухая масса, суммарная гликозидная фракция и содержание водорастворимых полисахаридов. В сырой биомассе определяли содержание белка и активность антиоксидантных ферментов.

Во всех вариантах учитывали также данные из пяти однотипных сосудов. Все данные обработаны статистически.

Ниже приведены показатели сырой и сухой биомассы штамма панакса пятилистного при выращивании на экспериментальных средах (табл.5).

Таблица 5 Показатели сырой и сухой биомассы штамма панакса пятилистного
Штамм	Вариант среды	Сырая масса, г/ 50 мл	Сухая масса, г/ 50 мл
Панакс - Ам -	Контроль	43,5±2,5	1,5±03
Панакс - Ам -	AVA + ГУМ	16,4±4,2	0,84±0,5
Панакс - Ам -	AVA + M	18,5±2,1	1,1±0,3
Панакс - Ам -	AVA - 1	18,1±1,8	0,8±0,2
Панакс - Ам	Контроль	41,3±1,0	1,5±0,2
Панакс - Ам	AVA + ГУМ	20,6±1,2	1,2±0,1
Панакс - Ам	AVA + M	19,8±1,6	1,2±0,2
Панакс - Ам	AVA - 1	20,2±1,0	1,2±0,1

Из представленных данных видно, что, как и в случае со штаммом женьшеня, в данном случае также наблюдалось значительное снижение сырой массы, в то время как воздушно-сухая масса оставалась во всех вариантах опытов практически на уровне контроля.

Это свидетельствовало о том, что основные метаболические процессы в клетках биомассы панакса американского в данных экспериментах проходят на том же уровне, как и при росте штамма на контрольной среде, даже в тех случаях, когда из среды был исключен стимулятор роста кинетин.

Таблица 6 Показатели накопления белка в биомассе клеток штамма панакса пятилистного при культивировании на средах с удобрениями AVA
Штамм	Вариант среды	Содержание белка, мг/г
Панакс - Ам -	Контроль	3,65±0,2
Панакс - Ам -	AVA + ГУМ	5,2±0,2
Панакс - Ам -	AVA + M	4,35±0,05
Панакс - Ам -	AVA - 1	4,3±0,15
Панакс Ам	Контроль	3,1±0,1
Панакс Ам	AVA + ГУМ	3,95±0,05
Панакс Ам	AVA + M	4,25±0,2
Панакс Ам	AVA - 1	4,7±0,1

Можно предположить, что минеральный состав AVA в комбинациях с гуматом и карбомидом мочевины вполне заменили основные минеральные компоненты среды Мурасиге и Скуга, даже усилив при этом белковый обмен. Данные по содержанию белка в биомассе штамма панакса пятилистного представлены в табл.6.

Таблица 7 Показатели удельной активности антиоксидантных ферментов в биомассе штамма панакса пятилистного при росте на питательных средах со смесью стеклообразных метафосфатов AVA
Штамм	Вариант среды	Удельная активность каталазы, Е/г белка	Удельная активность СОД, Е/г белка
Панакс - Ам	Контроль	65,0±4,5	56,3±2,4
Панакс - Ам	AVA + ГУМ	30,1±1,2	35,4±0,5
Панакс - Ам	AVA + M	42,0±2,1	22,5±0,5
Панакс - Ам	AVA - 1	46,2±4,0	15,0±6,5
Селективн. Ам-	Контроль	40,0±3,5	20,0±2,5
Селективн. - Ам-	AVA + ГУМ	21,0±1,5	14,0±1,0
Селективн. - Ам -	AVA + M	22,5±2,5	13,0±0,5
Селективн. - Ам-	AVA - 1	25,2±3,0	15,0±0,7

Полученные данные по уровню удельной активности ферментов антиоксидантной защиты имели такую же направленность, как в случае с культивированием штамма женьшеня. На экспериментальных питательных средах с метафосфатами AVA во всех модификациях наблюдали снижение активности обоих ферментов в клетках биомассы штамма панакса пятилистного при сохранении достаточно высокого, в данном случае на уровне контроля, метаболизма белка и активного синтеза других биологически активных веществ, суммы гликозидов и водорастворимых полисахаридов.

Таблица 8 Показатели содержания суммарной гликозидной фракции (СГФ) и водорастворимых полисахаридов (ВРП) в биомассе штамма панакса пятилистного
Штамм	Вариант среды	Содержание СГФ, %	Содержание ВРП, %
Панакс - Ам	Контроль	3,5±0,3	15,0±5,0
	AVA + ГУМ	4,3±1,2	7,0±1,2
	AVA + M	3,6±0,5	4,0±0,5
	AVA - 1	3,8±0,2	5,8±0,2
Селективн. Ам -	Контроль	3,0±0,7	17,0±3,6
	AVA + ГУМ	5,5±0,4	6,7±2,4
	AVA + M	3,5±0,2	4,5±1,0
	AVA - 1	4,0±0,2	4,0±0,5

Полученные результаты свидетельствуют, что накопление суммы гликозидов на всех вариантах питательных сред с удобрениями AVA в биомассе штамма панакса пятилистного было или на уровне контрольного штамма, или даже превышало этот показатель в варианте с гуматом. Для селективного штамма была отмечена та же закономерность. Можно предположить, что более высокое, чем в микроэлементах Мурасиге и Скуга в контроле, содержание таких микроэлементов, как Cu, Zn и Fe, в этих метафосфатах активизировало синтез гликозидов.

Подводя итоги выполненным экспериментам по замене макро- и микросолей по прописи Мурасиге и Скуга в стандартной питательной среде для штаммов женьшеня и панакса пятилистного и их селективных линий на стеклообразные метафосфаты AVA в трех модификациях с гуматом и карбомидом мочевины, можно сделать заключение, что эти метафосфаты вполне могут быть использованы в биотехнологии для культивирования данных штаммов. При этом были установлены как общие, так и индивидуальные особенности ответной реакции биологической активности по накоплению сухой массы, белка, СГФ и ВРП в зависимости от штамма.

Рост штаммов проходил по обычной "S″-образной кривой с сокращением "lag"-периода с 5-ти суток в контроле до 3-х в эксперименте. Морфологически биомасса штаммов не менялась, оставаясь крупнозернистой, рассыпчатой, но оба штамма приобретали более темную желтую окраску по сравнению с контрольным вариантом.

Для обоих штаммов в первом пассаже отмечено снижение сырой массы клеток во всех вариантах питательных сред с AVA. В то же время показатели сухой биомассы клеток во всех вариантах оставались на достаточно высоком уровне, что свидетельствовало о том, что процессы синтеза основных метаболитов идут в пределах стандартной (контрольной) среды.

Так, содержание белка в клетках женьшеня (штамм-Д) не только не уступало контрольному варианту, но даже превосходило последний, несмотря на отсутствие стимулятора роста. Селективные штаммы как женьшеня, так и панакса пятилистного также показали высокий уровень накопления белка в клетках биомассы на всех вариантах питательных сред с удобрениями AVA. Это свидетельствует о том, что макро- и микроэлементный состав стеклообразных удобрений AVA во всех вариантах был достаточен для прохождения всех метаболических процессов синтеза белка.

Содержание суммарной гликозидной фракции (СГФ) в штамме женьшеня во всех вариантах практически не зависело от внесенных AVA.

Содержание водорастворимых полисахаридов в обоих штаммах снижалось по сравнению с контролем почти в два раза, но все-таки оно осталось достаточно высоким. Возможно при увеличении дозы "AVA + ГУМ" и "AVA + М" содержание ВРП может быть увеличено.

Полученные данные по уровню удельной активности ферментов антиоксидантной защиты (СОД и каталазы) как в случае с культивированием штамма женьшеня, так и панакса пятилистного носили однотипный характер. На экспериметальных питательных средах с AVA во всех модификациях наблюдали снижение активности обоих ферментов в клетках. Можно предположить, что в данных экспериментах не происходит накопления агрессивного перекисного радикала и поэтому не активируются и антиоксидантные ферменты защиты.

Накопление суммы гликозидов в биомассе штамма панакса пятилистного на всех вариантах питательных сред с AVA было или на уровне контрольного штамма, или даже превышало этот показатель в варианте с гуматом. Для селективного штамма панакса американского была отмечена та же закономерность.

Очевидно, более высокое, чем в микроэлементах Мурасиге и Скуга в контроле, содержание таких микроэлементов, как Cu, Zn и Fe, в этих удобрениях активизировало синтез гликозидов.

Использование стеклообразных метафосфатов предполагает их постепенное растворение и поступление в растения, поэтому возможно использование их в биотехнологии при культивировании в жидкой питательной среде в ферментерах было бы также перспективно и экономично.

Пример 3

Штамм тропического аралиевого Polyscias filicifolia Bailey был введен в культуру изолированных тканей in vitro в 1972 году в ЛХФИ (ныне СПХФА) Грушвицким И.В., Арнаутовым Н.Н. и Слепян Л.И. от корня интактного оранжерейного растения.

Предварительное изучение нативного растения позволило выявить локализацию тритерпеновых гликозидов в паренхимных клетках коры корня. Экспланты, выделенные из зоны коры корня, после обработки в стерильных условиях высаживали на питательных средах разного состава. Было изучено три варианта сред с минеральной основой по прописи Мурасиге и Скуга, отличающихся составом витаминов и стимуляторов роста.

Для дальнейших исследований были отобраны образцы биомассы штамма, характеризующиеся интенсивным ростом массы клеток уже на 5-7 сутки. К 60-м суткам прирост ткани в этом случае составлял 15,3 г сухой массы с 1 л питательной среды и содержал тритерпеновые гликозиды, характерные для нативного растения. Данный штамм был передан в ВСКККВР под номером 24 как штамм с адаптогенным и иммуномодулирующим эффектами, но в дальнейшем он там был потерян. В настоящее время штамм Polyscias filicifolia Bailey сохраняется как исходный штамм, в котором были изучены химический состав и фармакологические свойства, в банке штаммов лекарственных растений СПХФА, имеется в ХБО при РАН в фирме " ВИТА" (Санкт-Петербург) и научно-производственной фирме " Биофармтокс" (Санкт-Петербург).

В результате фитохимических исследований, проведенных в ЛХФИ Н.В.Михайловой, были выделены и идентифицированы два тритерпеновых гликозида (А и Б), агликоном которых является хедерагенин - производное олеанана].

Хроматографический анализ углеводной части гликозидов показал, что для гликозида А она представлена галактозой и рамнозой, а для гликозида Б - галактозой, рамнозой и глюкозой.

Биомасса штамма содержит также β-ситостерин (до 2%), кампестерин, фруктозу, аминокислоты (аспарагиновую кислоту, лизин, аргинин, цистеин, гистидин, триптофан и др.), насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты (лауриновую, миристиновую, пальмитиновую, олеиновую).

Штамм полисциаса папоротниколистного является одним из перспективных биотехнологических штаммов, препараты которого обладают ценными фармакологическими свойствами и который находится в коллекции нескольких фирм-производителей.

Процесс культивирования штамма, связанный с его многократной рекультивацией на новых питательных средах (в жидкой или агаризованой среде), очень трудоемок и многостадиен. Поэтому упрощение его на стадии приготовления концентратов питательных сред снижает риск ошибок и улучшает контроль производства, повышая его надежность.

Подводя итоги вышеперечисленному, представляло интерес изучить возможность культивирования в биотехнологии штамма полисциаса как сырья для лекарственных препаратов или БАД с использованием нового вида экологически чистых стеклообразных метафосфатов AVA, разработанных в ЗАО " АГРОВИТ ".

Штамм культивируется в СПХФА с 1972 г. на модифицированной агаризованной питательной среде с макро- и микросолями по прописи Мурасиге и Скуга в стационарных условиях культивирования при температуре 25+1°С в сосудах на 250 мл на 50 мл питательной среды. Цикл культивирования 40 суток и в темном помещении.

Биомасса в конце цикла, как продукт рекультивации и сырье, представлена рыхлой массой клеток белого цвета, без органогенеза, с характерным запахом свежей зелени (при перемешивании ткани) и специфическим ароматным запахом после высушивания.

С этой целью для культивирования штамма полисциаса (шифр Pol.) (коллекция СПХФА) на стандартной питательной среде макро- и микросоли по прописи Мурасиге и Скуга были заменены на новые стеклообразные метафосфаты трех вариантов AVA:

1. AVA - 1 (шифр AVA - 1, Универсал);

2. AVA с гуминовыми кислотами (97% AVA + 3% гумата) (шифр-AVA + ГУМ);

3. AVA с карбомидом мочевины (85% AVA + 15% карбомид мочевины) (шифр AVA + М).

Остальные компоненты контрольной питательной среды соответствовали стандартной среде для полисциаса, исключая стимулятор роста кинетин. Штаммы культивировали в стандартных условиях на питательных средах, приготовленных в следующих вариантах:

№1 Контрольная среда - макросоли по Мурасиге и Скугу - 750,0 мл/л;

микросоли по Мурасиге и Скугу - 1,5 мл/л,

сахар - 3%, агар-агар - 0,6%,

инозит - 0,100 г/л, гидролизат казеина - 0,5 г/л,

железа хелат - 5 мл/л,

α-нафтилуксусная кислота - 3 мл/л,

кинетин - 1 мл/л.

№2. Штамм полисциас (Pol) среда: вместо макро- и микросолей даны AVA - 1 - 1 г/л, остальные компоненты по прописи контрольной среды без стимулятора роста кинетина.

№3. Штамм полисциас (Pol) среда: вместо макро- и микросолей даны AVA + ГУМ - 1 г/л, остальные компоненты по прописи контрольной среды без стимулятора роста кинетина.

№4. Штамм полисциас (Pol) среда: вместо макро- и микросолей даны AVA + М - 1 г/л, остальные компоненты по прописи контрольной среды без стимулятора роста кинетина.

Цикл культивирования во всех вариантах составлял 40 суток.

В конце цикла определяли сырую и сухую массы ткани, белок по Лоури, водорастворимые полисахариды - ВРП и суммарную гликозидную фракцию - СГФ.

Контролируемыми параметрами во всех вариантах являлся постоянный контроль за ростом биомассы по показателям сырой и воздушно-сухой массы тканей в условиях культуры in vitro в банке СПХФА на протяжении одного цикла выращивания - 40 суток. После чего часть клеток биомассы штамма была вновь рекультивирована на второй пассаж на те же варианты питательной среды, как и в первом пассаже.

Морфологически биомасса клеток полисциаса во всех вариантах опытов в первом пассаже оставалась светлой, такой же рыхлой, как и в контроле, и практически не отличалась от контрольного варианта. Это свидетельствовало о том, что основные метаболические процессы, связанные с ростом, проходили в клетках с той же активностью, как и на контрольной среде, хотя из нее был исключен стимулятор роста кинетин и заменены макро- и микросоли.

В конце цикла культивирования на 40 сутки (срок наблюдения) биомасса была отделена от остатков питательной среды и высушена в инфракрасной сушилке. В воздушно-сухой биомассе была определена сумма водорастворимых полисахаридов-ВРП и сумма гликозидов - СГФ.

Ростовые параметры (сырой и воздушно-сухой массы) в процессе роста штамма на экспериментальных средах учитывали общепринятым методом. Во всех вариантах учитывали данные из пяти однотипных сосудов, все данные обработаны статистически.

Ниже приведены показатели сырой и сухой массы тканей штамма полисциаса при выращивании на экспериментальных средах (табл.9).

Из приведенных данных видно, что при замене макро- и микросолей Мурасиге и Скуга на метафосфатах AVA - 1 сырая масса клеток снижалась, но сухая масса клеток данного штамма практически не отличалась от контрольного варианта.

Таблица 9 Показатели сырой и сухой массы тканей штамма полисциаса на экспериментальных средах
Вариант среды	Штамм	Сырая масса, г/50 мл среды	Сухая масса, г/50мл среды
Контроль	Pol	44,43±2,0	1,54±0,1
AVA - 1	Pol	39,6±1,5	1,65±0,2
AVA - ГУМ	Pol	28,7±2,3	1,40±0,1
AVA - M	Pol	30,78±1,0	1,50±0,2

Несколько снижалась она по сырой массе (на 10% ) в варианте AVA с карбомидом мочевины, но оставалась практически такой же по воздушно-сухой массе. В варианте AVA с гуматом снижение сырой массы клеток было более значительным, хотя сухая масса также была близка к контролю.

Таким образом, можно заключить, что в первом пассаже замена традиционных солей Мурасиге и Скуга в питательной среде на новые стеклообразные метафосфаты AVA в различных модификациях практически не влияла на морфологию клеток и прирост биомассы штамма полисциаса даже при отсутствии стимулятора роста кинетина.

В связи с этим представляло интерес сравнить накопление белка в клетках полисциаса в процессе культивирования на средах со стеклообразными метафосфатами AVA (табл.10).

Таблица 10 Показатели накопления белка в биомассе клеток штамма полисциаса при культивировании на средах со смесью стеклообразных метафосфатов AVA
Штамм	Вариант среды	Содержание белка, мг/г биомассы
Полисциас - (Pol)	Контроль	2,80±0,01
Полисциас - (Pol)	AVA - 1	3,45±0,02
Полисциас - (Pol)	AVA + ГУМ	2,80±0,01
Полисциас - (Pol)	AVA + M	2,65±0,01

Приведенные показатели свидетельствуют, что содержание белка в клетках полисциаса на экспериментальных средах с AVA не уступало контрольному варианту и даже превосходило последний (в варианте с AVA - 1). Это свидетельствует о том, что макро- и микроэлементный состав стеклообразных метафосфатов AVA во всех вариантах был достаточен для прохождения метаболических процессов синтеза белка. Очевидно, высокое содержание гумуса (до 7%, в AVA + ГУМ), калия (К₂O), фосфора (Р₂O₅) и магния (MgO), а также таких микроэлементов, как Cu, S, В, Fe, и других достаточно активируют ферменты белкового синтеза, влияя на его активацию.

Аналогичную ответную реакцию мы наблюдали и в случае использования удобрений AVA для культивирования штаммов женьшеня и панакса пятилистного.

Учитывая, что гликозиды (СГФ) и водорастворимые полисахариды (ВРП) являются одними из основных биологически активных веществ в клетках полисциаса, был проведен сравнительный анализ данных веществ в биомассе этого штамма на экспериментальных средах (табл.11).

Таблица 11 Показатели содержания суммарной гликозидной фракции (СГФ) и водорастворимых полисахаридов (ВРП) в биомассе штамма полисциаса
Штамм	Вариант среды	СГФ, %	ВРП, %
Полисциас-(Pol)	Контроль	2,36±0,2	6,0±0,55
Полисциас-(Pol)	AVA + ГУМ	4,21±0,3	4,50±0,25
Полисциас-(Pol)	AVA + M	3,38±0,1	4,10±0,15
Полисциас-(Pol)	AVA - 1	2,50±0,2	4,11±0,05

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что культивирование штамма полисциаса на экспериментальных средах с удобрениями AVA приводило к увеличению синтеза гликозидов почти в 1,5 раза при использовании AVA с гуматом, но при этом содержание ВРП снизилось по сравнению с контролем почти также в 1,5 раза.

Это представляет определенный интерес, так как микроэлементы Cu и Zn, которые присутствуют в большей концентрации в AVA, в первую очередь, были использованы для активации синтеза гликозидов как эндогенных гормонов при стрессе, а синтез ВРП при этом не активировался и часть из них использовалась на адаптацию клеток.

Далее в биомассе штамма полисциаса была определена активность ферментов антиоксидантной защиты. Данные представлены в табл.12.

Таблица 12 Показатели удельной активности антиоксидантных ферментов в биомассе штамма полисциаса при росте на питательных средах со стеклообразными метафосфатами AVA
Штамм	Вариант среды	Удельная активность каталазы, Е/г белка	Удельная активность СОД, Е/г белка
Полисциас - Pol	Контроль	63,0±3,5	50,3±5,4
Полисциас - Pol	AVA + ГУМ	37,1±5,2	45,4±1,5
Полисциас - Pol	AVA + M	47,0±3,5	32,5±2,5
Полисциас - Pol	AVA - 1	43,0±4,0	27,0±4,5

Из представленных данных видно, что на всех экспериментальных питательных средах с AVA наблюдали снижение активности ферментов антиоксидантной защиты в конце цикла культивирования. Учитывая, что это субстратзависимые ферменты, можно предположить что микроэлементы AVA не влияли на накопление перекисных радикалов в клетках.

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать вывод, что культивировние штамма полисциаса на экспериментальных питательных средах с метафосфатами AVA в различных модификациях на первом пассаже практически не отразилось на морфологических и биохимических показателях биомассы данного штамма.

Поэтому в конце срока культивирования после первого пассажа часть биомассы штамма полисциаса была рекультивирована во втором пассаже на те же варианты питательных сред со стеклообразными метафосфатами AVA.

В процессе роста биомассы во втором пассаже было отмечено замедление роста биомассы, увеличение lag-периода до 7-10 дней и значительное побурение клеток. К концу срока культивирования было отмечено значительное снижение сырой и воздушно-сухой массы клеток (табл.13).

Таблица 13 Показатели сырой и воздушно-сухой массы клеток полисциаса на экспериментальных средах во втором пассаже
Вариант среды	Штамм	Сырая масса, г/50 мл среды	Сухая масса, г/50мл среды
Контроль	Pol	44,43±2,0	1,54±0,1
AVA - 1	Pol	22,1±2,5	0,55±0,1
AVA - ГУМ	Pol	18,2±5,3	0,50±0,3
AVA - M	Pol	15,78±1,0	0,51±0,2

Возможно снижение роста во втором пассаже на экспериментальных средах было связано не столько с метафосфатами AVA, как с тем, что в питательной среде отсутствовал один из стимуляторов роста - кинетин. Известно, что кинетин участвует в активации клеточных делений, поэтому отсутствие данного стимулятора во втором пассаже могло сказаться и на делении клеток и, как следствие, уменьшении сырой и сухой массы.

Для определения активности процессов метаболизма было проведено определение количества белка в конце цикла выращивания клеток на втором пассаже. Данные представлены в табл.14.

Таблица 14
Показатели накопления белка в биомассе клеток штамма полисциаса при культивировании на средах со стеклообразными метафосфатами AVA на втором пассаже
Штамм	Вариант среды	Содержание белка, мг/г
Полисциас (Pol)	Контроль	3,5±0,2
Полисциас (Pol)	AVA + ГУМ	2,54±0,1
Полисциас (Pol)	AVA + M	2,74±0,3
Полисциас (Pol)	AVA - 1	2,81±0,2

Из приведенных данных можно заключить, что синтез белка в клетках полисциаса во втором пассаже во всех вариантах снизился. Это возможно связано со снижением питания клеток как за счет подсыхания агар-агара и снижением поступления солей AVA, так и из-за отсутствия кинетина.

Таблица 15 Показатели удельной активности антиоксидантных ферментов в биомассе штамма полисциаса при росте на питательных средах с метафосфатами AVA на втором пассаже
Штамм	Вариант среды	Удельная активность каталазы, Е/г белка	Удельная активность СОД, Е/г белка
Полисциас(Pol)	Контроль	59,0±2,5	53,0±1,4
Полисциас(Pol)	AVA + ГУМ	70,1±3,5	61,4±0,5
Полисциас(Pol)	AVA + M	89,0±2,1	70,5±1,5
Полисциас(Pol)	AVA - 1	82,2±4,0	91,0±2,5

Как видно из полученных данных, произошло повышение активности ферментов антиоксидантной защиты во всех вариантах питательных сред с AVA. Общее побурение массы клеток во втором пассаже говорит, что идет активация полифенолоксидазы и образование вторичных метаболитов, связанных со стрессом и перестройкой общего метаболизма клеток. При этом отмечались некоторые участки биомассы нормального белого цвета и при последовательной селекции этих клеток можно будет получить линию, устойчивую в дальнейшем к росту без кинетина и на метафосфатах AVA.

Таблица 16 Показатели содержания суммарной гликозидной фракции (СГФ) и водорастворимых полисахаридов (ВРП) в биомассе штамма полисциаса во втором пассаже
Штамм	Вариант среды	Содержание СГФ, %	Содержание ВРП, %
Полисциас(Pol)	Контроль	2,0±0,2	5,0±0,5
Полисциас(Pol)	AVA + ГУМ	2,3±0,3	3,6±0,2
Полисциас(Pol)	AVA + M	1,6±0,5	3,0±0,5
Полисциас(Pol)	AVA - 1	1,8±0,2	3,8±0,2

Содержание основных биологически активных веществ в клетках штамма полисциаса на втором пассаже снизилось по сравнению с первым пассажем, хотя содержание СГФ оставалось на уровне контроля или несколько выше, в частности с AVA - 1.

Для большей наглядности все результаты, полученные в приведенных в заявке примерах, сведены в одну таблицу 17.

В данной таблице в качестве контрольной питательной среды использовалась стандартная питательная среда с макро- и микросолями по прописи Мурасиге и Скуга. А в качестве заявляемых вариантов питательной среды рассматривались три варианта среды:

1. AVA - 1

(шифр AVA - 1, Универсал), состав тот же, что и в примере 1;

2. AVA с гуминовыми кислотами (97% AVA + 3% гумата) (шифр AVA + ГУМ), состав тот же, что и в примере 1;

3. AVA с карбомидом мочевины (85% AVA + 15% карбомид мочевины) (шифр AVA + М), состав тот же, что и в примере 1.

Таблица 17
Показатели
Штамм	Вариант среды	Сырая масса, г/50 мл среды	Сухая масса, г/50 мл среды	Сод. Белка, мг/г биомассы	Уд.активность каталазы, Е/г белка	Уд.активность СОД, Е/г белка	СГФ, %	ВРП, %
Женьшень (Д)	Контроль	31,4±1,2	1,00±0,01	2,3±0,05	75,5±10,5	56,7±5,1	4,1±0,2	8,00±0,51
	Заявляемый вариант	1	20,76±2,7	0,95±0,02	3,01±0,03	17,5±1,0	30,1±1,0	3,85±0,1	5,21±0,11
		2	16,80±2,8	0,81±0,02	2,85±0,02	12,4±1,5	29,0±1,5	4,30±0,3	4,15±0,20
3	19,30±1,5	0,96±0,05	2,62±0,01	15,2±3,5	31,8±2,0	4,50±0,2	3,5±0,10
Селективный женьшень (Д-)	Контроль	36,10±0,3	1,59±0,03	3,6±0,05	28,0±2,0	12,1±0,2	4,17±0,5	10,00±0,60
	Заявляемый вариант	1	20,48±0,5	1,1±0,02	3,25±0,03	30,0±2,0	13,5±0,5	3,69±0,3	8,85±0,40
		2	16,80±0,4	0,94±0,01	3,1±0,02	28,6±1,0	13,3±0,2	4,53±0,4	6,75±0,30
3	15,6±0,6	0,91±0,01	3,2±0,01	27,5±3,0	9,45±0,5	4,20±0,2	5,45±0,25
Панакс (Ам)	Контроль	41,3±1,0	1,5±0,2	3,1±0,1	65,0±4,5	56,3±2,4	3,5±0,3	15,0±5,0
	Заявляемый вариант	1	20,2±1,0	1,2±0,1	4,7±0,1	46,2±4,0	15,0±6,5	3,8±0,2	5,8±0,2
		2	20,6±1,2	1,2±0,1	3,95±0,05	30,1±1,2	35,4±0,5	4,3±1,2	7,0±1,2
3	19,8±1,6	1,2±0,2	4,25±0,2	42,0±2,1	22,5±0,5	3,6±0,5	4,0±0,5
Селективный панакс (Ам-)	Контроль	43,5±2,5	1,5±0,3	3,65±0,2	40,0±3,5	20,0±2,5	3,0±0,7	17,0±3,6
	Заявляемый вариант	1	18,1±1,8	0,8±0,2	4,3±0,15	25,2±3,0	15,0±0,7	4,0±0,2	4,0±0,5
		2	16,4±4,2	0,84±0,5	5,2±0,2	21,0±1,5	14,0±1,0	5,5±0,4	6,7±2,4
3	18,5±2,1	1,1±0,3	4,35±0,05	22,5±2,5	13,0±0,5	3,5±0,2	4,5±1,0
Полисциас (Pol)	Контроль	44,43±2,0	1,54±0,1	2,8±0,01	63,0±3,5	50,3±5,4	2,36±0,2	6,0±0,55
	Заявляемый вариант	1	39,6±1,5	1,65±0,2	3,45±0,02	43,0±4,0	27,0±4,5	2,5±0,2	4,11±0,05
		2	28,7±2,3	1,40±0,1	2,8±0,01	37,1±5,2	45,4±1,5	4,21±0,3	4,5±0,25
3	30,78±1,0	1,50±0,2	2,65±0,01	47,0±3,5	32,5±2,5	3,38±0,1	4,1±0,15

Из приведенных в таблице данных можно сделать следующие выводы:

1. Несмотря на снижение сырой биомассы клеток, масса воздушно-сухая во всех случаях превышала или была равна сухой массе клеток в контрольном образце.

2. Содержание белка во всех случаях превышало контрольные образцы.

3. Содержание основных действующих веществ (гуматы, гликозиды и т.д.) соответствовало контрольным образцам.

4. Активность ферментов антиоксидантной защиты (СОД, каталазы и пр.) колебалась в связи с изменяющимися условиями культивирования, но оставалась достаточной для нормального уровня метаболизма клеток растений.

Таким образом, использование предложенной питательной смеси приводит к снижению количества операций при приготовлении смеси, так как ряд солей заменяется одним веществом - стекловидным удобрением - AVA, при этом уменьшается риск ошибок при составлении смеси, повышается надежность биосистемы.

Предложенная питательная смесь является экономически выгодной и физиологически приемлемой для широкого использования в биотехнологии культивирования лекарственных растений с многочисленными пересевами.

Использование предложенной питательной смеси значительно снижает трудозатраты, повышает экономичность и надежность данного способа культивирования растений.

Сравнительные экономические показатели использования традиционных методов приготовления питательной среды для выращивания биомассы растений и методов с применением комплекса AVA приведены в таблице 18.

Таблица 18 Стоимость использования традиционных методов приготовления питательной среды и новых методов с применением комплекса «AVA»
Питательная среда	Число операций на приготовление 1 л среды	Время трудозатрат, мин	Стоимость, руб./кг	Стоимость, руб./литр	Частота приготовления	Экологический вред
Контрольная
питательная
среда MS				5-6	1 раз/месяц	нет
- макро	14	90	10-15
- микро				3-4
- стимуляторы
- углеводы				1-2
- витамины
Питательная
среда на
основе
комплекса	8	20	60-80	2-4*	1 раз/месяц	нет
«AVA»
- макро
- микро
- стимуляторы
- углеводы
- витамины
*Концентрация AVA в питательной среде 1 г/литр

Способ получения биомассы клеток растений путем культивирования биомассы культуры клеток на питательной среде, содержащей неорганические компоненты, подложку, углеводы, витамины и стимуляторы роста, отличающийся тем, что в составе питательной среды в качестве неорганических компонентов используют смесь стеклообразных метафосфатов переменного состава следующего содержания, мас.%:

окись фосфора	40-60
окись калия	10-30
окись кальция	5-20
окись магния	3-13
окись кремния	1-6
окись бора	1-6
окислы элементов таблицы Менделеева
(Со, Fe, Cu, Мо, Mn, Cr, Zn, Ge, Se, V)	0,05-2