Способ определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении микроорганизмов
Владельцы патента RU 2327142:
Федеральное государственное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации" (RU)
Изобретение относится к способам определения коэффициентов проницаемости микроорганизмов и может быть использовано для контроля эффективности фильтров тонкой очистки воздуха и средств индивидуальной защиты в биотехнологии, санитарной, медицинской и прикладной микробиологии при работе с микроорганизмами и их токсинами. Способ определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении микроорганизмов заключается в приготовлении жидкого тест-препарата, диспергировании его в аэрозоль до фильтра, отборе проб аэрозоля до и после фильтра, определении в пробах аэрозоля содержания биологического маркера. В качестве маркера используют тест-препарат белков, инициирующих льдообразование, регистрацию льдообразующей активности которых проводят по наличию в пробе центров нуклеации. Техническим результатом изобретения является обеспечение безопасности условий работы. 4 табл.
Изобретение относится к способам определения коэффициентов проницаемости аэрозольных фильтров в отношении бактериальных токсинов белковой природы и может быть использовано для контроля эффективности фильтров тонкой очистки воздуха и средств индивидуальной защиты в биотехнологии, санитарной, медицинской и прикладной микробиологии при работах с микроорганизмами и их токсинами в целях обеспечения безопасности условий труда.
Основной характеристикой фильтров является коэффициент проскока (или проницаемость), равный процентному отношению концентрации частиц в воздухе после фильтра к концентрации частиц в воздухе до фильтра (ГОСТ Р 51251-99. Фильтры очистки воздуха. Классификация. Маркировка: Государственный стандарт Российской Федерации. - М.: ИПК Издательство стандартов, 1999).
Известен способ оценки задерживающей способности аэрозольных фильтров в отношении аэрозолей турбинного масла или диоктилфталата (ГОСТ 10189-62). В нем турбинное масло или диоктилфталат диспергируются в аэрозоль до фильтра с образованием в воздухе частиц размером от 0,17 до 0,36 мкм. Концентрация частиц до и после фильтра определяется без отбора проб нефелометрически.
Недостатками метода являются:
необходимость создания значительных концентраций турбинного масла или диоктилфталата до фильтра для обеспечения чувствительности метода;
диоктилфталат считается потенциально опасным веществом (Carlon H.R., Guelta M.A., Gerber B.V. Some candidate replacement materials for dioctil phthalate in "hot smoke" aerosol penetrometer machines / Aerso) Sci. and Technol. - 1991. - Vol.14, №2. - P.233-246);
загрязнение фильтра маслом;
несоответствие гигроскопических, поверхностных, электростатических и иных значимых физико-химических свойств частиц флуоресцеина натрия, существенных для процессов их задержки фильтрующими материалами, соответствующими свойствам белковых частиц, формируемых бактериальными токсинами.
В практике проверки фильтрующих систем нашло применение аэрозолей флуоресцеина натрия (уранина) (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт), диспергируемых пневматическими распылителями до частиц размером менее 1 мкм. Количественная регистрация уранина в пробах аэрозоля, отбираемых до и после фильтра, осуществляется флуориметрически.
Недостатком метода является:
несоответствие гигроскопических, поверхностных, электростатических и иных значимых физико-химических свойств частиц турбинного масла или диоктилфталата, существенных для процессов их задержки фильтрующими материалами, соответствующими свойствам белковых частиц, формируемых бактериальными токсинами;
загрязнение фильтра красителем, его накопление в помещениях, что приводит к постепенному нарастанию уровню фона в коммуникациях вентиляционных систем и помещениях и необходимости корректировки результатов по уровню фона.
Наиболее близким является способ определения коэффициента проскока аэрозольных фильтров в отношении тест-аэрозолей микроорганизма Serratia marcescens (Основы техники безопасности в микробиологических и вирусологических лабораториях / С.Г.Дроздов, Н.С.Гарин, Л.С.Джиндоян, В.М.Тарасенко. - М.: Медицина, 1987, СП 1.2.731-99. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности: Санитарные правила. - М.: Информ. - изд. центр Госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 1999); СП 1.3.1285-03 Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): Санитарные правила. - М.: Информ. - изд. центр Госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 2003).
Сущность метода состоит в отборе пробоотборниками проб аэрозоля до и после фильтра во время диспергирования суспензии Serratia marcescens перед фильтром при заданных условиях испытаний, определении в пробах концентраций аэрозоля Serratia marcescens и расчете по ним коэффициента проницаемости фильтра (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт).
К недостаткам данного метода следует отнести:
невозможность характеристики проникания через фильтрующие материалы белковых веществ, характеризующихся значительно меньшими размерами, чем клетки Serratia marcescens;
длительность определения, связанная с бактериологическим методом определения количества жизнеспособных клеток;
значительная инактивация клеток при прохождении коммуникаций вентиляционных систем и фильтров, влияющая на достоверность определения коэффициента проскока;
необходимость использования дорогостоящих питательных сред;
необходимость осуществления организационных и технических мероприятий по обеспечению биологической безопасности в связи с тем, что микроорганизм Serratia marcescens относится к IV группе патогенности (СП 1.2.731-99. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности: Санитарные правила. - М.: Информ. - изд. центр Госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 1999).
Общими с заявленным способом являются
приготовление жидкого тест-препарата;
диспергирование тест-препарата в аэрозоль до фильтра;
отбор проб аэрозоля до фильтра и после него в процессе диспергирования тест-препарата;
определение в пробах аэрозоля содержания биологического маркера (трассера) - жизнеспособных бактериальных клеток или активных ЦН;
расчет коэффициента проскока фильтра.
Задачей изобретения является разработка способа определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении бактериальных токсинов, представляющих собой глобулярные белковые комплексы, сформированные из нескольких субъединиц и имеющие размеры, существенно меньшие, чем микробные клетки.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе определения проницаемости аэрозольных фильтров предусмотрено использование:
препаратов бактериальных белков, инициирующих льдообразование (БИЛ), в качестве маркера, регистрация льдообразующей активности которых проводится по наличию в пробе центров нуклеации (ЦП) переохлажденной воды, формируемых белками этого типа;
микрокапельной криоскопической методики для количественного обнаружения ЦН в пробах, суть которой заключается в подсчете относительного числа кристаллизующихся микрокапель серийных разведений исследуемых проб при определенной температуре переохлаждения и использовании известной зависимости концентрации ЦН от доли замерзающих микрокапель, подчиняющейся распределению Пуассона;
рациональной температуры анализа, находящейся в интервале от минус 7°С до минус 11°С, т.к. при этой температуре чистая вода и разбавленные растворы солей, не содержащие гетерогенных ядер нуклеации, в микрокаплях сохраняются в переохлажденном состоянии продолжительное время;
мини-криостата с регулируемой температурой, сконструированного на основе элементов Пельтье, обеспечивающего охлаждение и термостабилизацию рабочей поверхности с точностью ±0,1°С в интервале температур от минус 1°С до минус 13°С;
активных штаммов-продуцентов БИЛ, например микроорганизмов Erwinia herbicola, штаммов 1211 или 1123 (также возможно использование Pseudomonas syringae, штамм 1567 или Pseudomonas fluorescens, штамм 1475), - штаммы из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Данные бактерии продуцируют в значительных количествах белковые комплексы класса С, инициирующие кристаллизацию переохлажденной воды при температуре от минус 7°С и ниже, представляющие собой глобулярные образования из нескольких субъединиц, имеющие молекулярную массу около 150 килодальтон и изоэлектрическую точку в кислой зоне рН, что аналогично ботулиническому нейротоксину (Виноградова И.Д., Уварова Р.Н., Иванов К.К. и др. Получение нейротоксина и гемаглютинина Cl. botulinum типа А и характеристика нейротоксина // Бихимия. - 1983. - т.48, вып.5. - С.788-795; Govindarajan A.G., Lindow S.E. Size of bacterial ice nucleation sites measured in situ by radiation inactivation analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1988. - Vol.85, - P.1334-1338).
Способ включает следующие этапы:
приготовление белкового тест-препарата;
диспергирование тест-препарата в аэрозоль до фильтра;
отбор проб аэрозоля до фильтра и после него в процессе диспергирования тест-препарата;
определение в пробах аэрозоля содержания активных ЦН;
расчет коэффициента проскока фильтра.
Способ выполняется следующим образом.
Для получения тест-препарата выращивают культуру продуцента, из которой выделяют БИЛ.
Выращивание микробов-продуцентов осуществляют на плотной питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса, содержащей аминный азот в количестве (110±10) мг% и имеющей величину рН (7,2±0,2) ед. рН. Получение микробных культур производят при температуре (24±2)°С в течение 3 суток с последующим смывом колоний физиологическим раствором хлористого натрия с добавлением стеклянных бус.
Выделение белка БИЛ осуществляют путем разрушения клеток суспензии микроорганизмов встряхиванием со стеклянными бусами или ультразвуковой обработкой. БИЛ осаждают из культуральной жидкости солевым методом в присутствии гексаметафосфата натрия или сульфата аммония при рН среды 3,5-5,0 ед. с последующим центрифугированием.
На основе полученной белковой пасты готовят тест-препарат, имеющий удельную активность не менее 5,0·108 ЦН·см-3 (при диспергировании в течение не менее 10 минут не менее 10 см3 тест-препарата при коэффициенте перевода в аэрозоль 0,3 отн.ед. данная концентрация ЦН обеспечивает получение в аэрозоле до фильтра с минимальной производительностью 750 м3/ч требуемой концентрации трассера около 1·107 у.е.·м-3 (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт) для расчета коэффициента проскока на уровне 1·10-4%).
Используемые генераторы аэрозоля должны обеспечивать создание перед фильтром аэрозоля с концентрацией порядка 1·107 ЦН·м-3, состоящего в основном из частиц размером менее 10 мкм.
Для регистрации ЦН в пробах проводят следующие операции.
По описанию, прилагаемому к криостату, готовят прибор к работе. Устанавливают рабочую температуру минус 7°С или ниже.
Разводящую жидкость - фосфатный буферный раствор - готовят на основе растворов солей однозамещенного и двузамещенного фосфорнокислого калия и дистиллированной воды. Концентрация водородных ионов должна находиться в пределах 7,3-7,6 ед. рН. Приготовленный фосфатный буферный раствор подвергают автоклавированию при 120°С в течение 30 минут. Стерильный фосфатный буферный раствор проверяют на наличие абиогенных центров нуклеации. Для этого его разливают в стерильные пробирки по 4-10 см3 и замораживают в криостате при температуре минус (7-9)°С в течение 5 мин. Замерзшие при этой температуре пробирки выбраковывают.
Стерильные мерные пробирки в количестве, необходимом для выполнения требуемых десятикратных разведений, заполняют 4,5 см3 фосфатным буферным раствором.
Приготовление парафинированных кювет из алюминиевой фольги, необходимых для размещения микрокапель исследуемой жидкости, осуществляют следующим образом. Кюветы готовят в виде круга диаметром 8-10 см с загнутыми краями с высотой бортов 5-10 мм. Из переплавленного парафина готовят 3% раствор в ксилоле или хлороформе. Раствор парафина наносят на рабочую поверхность кюветы с избытком. Излишек раствора сливают. Кюветы подсушивают в течение 2-3 минут над пламенем спиртовки для испарения растворителя.
В качестве сорбирующей жидкости для пробоотборников используют физиологический раствор или фосфатный буферный раствор, приготовленный вышеприведенным способом.
Диспергируют тест-препарат пневматическим распылителем, оснащенным отсекателем грубой фракции частиц генерируемого аэрозоля, в воздуховод до фильтра в течение не менее 10 минут для получения аэрозоля с преимущественным размером частиц менее 1 мкм.
Отбирают пробы аэрозоля до и после фильтра в соответствии с требованиями ОСТ Д-504-91ССБТ.
Исследуемую пробу сорбирующей жидкости из пробоотборников тщательно перемешивают и 0,5 см3 вносят в первую пробирку с фосфатным буфером. Дальнейшие разведения осуществляют десятикратным шагом. Анализу подвергают исходную пробу и все 5-8 десятикратных разведений.
Микропипеткой наносят на поверхность алюминиевой парафинированной кюветы по 20-40 капель (объемом 0,01 см3) контролей (фосфатный буферный раствор и сорбирующая жидкость) и каждого анализируемого разведения отобранной из аэрозоля пробы. Кюветы устанавливают в камеру криостата и визуально определяют количество замерзших капель на каждой кювете через три минуты с момента начала кристаллизации. Замерзание капель регистрируют по их помутнению. Изменяют температуру охлаждающей поверхности криостата и через 3 мин повторяют подсчет числа замерзших микрокапель при новой температуре.
При расчете концентрации ЦН используют кюветы, в которых отмечено замерзание части нанесенных капель. Анализ считается зачетным, если в контролях (фосфатном буферном растворе и сорбирующей жидкости) ЦН при выбранной температуре не регистрируются.
Расчет концентрации ЦН в пробе ведут следующим порядком.
Для каждого разведения пробы (i) по формулам (1) и (2) рассчитывают долю замерзших капель - эффект кристаллизации (fi) и соответствующую этому эффекту концентрацию центров нуклеации (Cfi):
где fi - эффект кристаллизации, доля;
Сfi - концентрация БИЛ в исследуемой жидкости, ЦН см-3;
Noi - общее количество зачетных капель исследуемого разведения на данной кювете;
N3i - число замерзших капель исследуемого разведения на данной кювете;
d - степень разведения;
V - объем капли на кювете (например 0,01 см3).
На основе полученных значений методом наименьших квадратов рассчитывают концентрацию ЦН, соответствующую 50% эффекту кристаллизации.
Статистическую обработку результатов параллельных определений выполняют в соответствии с общепринятыми методами.
Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами показано в табл. 1.
| Таблица 1 | |||
| Сведения о причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами | |||
| Виды технического результата и их размерность | Показатели фактические или расчетные | Совокупность отличительных признаков, улучшающих показатели заявляемого объекта | |
| прототипа | заявляемого объекта | ||
| Возможность генерирования аэрозолей, содержащих частицы с активным биологическим маркером размером менее 0,5 мкм, (да/нет) | нет | да | Белковые комплексы, инициирующие льдообразование, имеют размеры менее 0,1 мкм, что обеспечивает получение субмикронных частиц, загруженных активным биологическим маркером. Жизнеспособные клетки Serratia marcescens не могут присутствовать в частицах размером менее 0,5 мкм |
| Средняя продолжительность определения коэффициента проскока фильтра в 10 пробах, час | 55 | 2 | Использование методики капельного замораживания проб, содержащих микробные белки БИЛ, имитирующих ботулинический токсин и определяемых инструментальным методом, обеспечивает экспрессное определение коэффициента проскока. В ближайшем аналоге необходимо определение общей концентрации клеток в пробе стандартным бактериологическим методом путем высева 10-кратных серийных разведений на чашки с ППС и подсчета выросших после инкубирования в течение 48 часов колоний |
| Виды технического результата и их размерность | Показатели фактические или расчетные | Совокупность отличительных признаков, улучшающих показатели заявляемого объекта | |
| прототипа | заявляемого объекта | ||
| Ошибка определения концентрации биологического маркера в пробе, процент | Использование стандартного бактериологического метода высева 10-кратных серийных разведений на чашки с ППС и подсчета выросших колоний после инкубирования не обеспечивает точность определения концентрации менее 25 % (допустимая биологическая погрешность). Инструментальный метод определения концентрации ЦН в предлагаемом способе характеризуется 10% ошибкой | ||
| >25 | <10 | ||
| Среднее количество анализов по определению содержания биологического маркера в пробах двумя лаборантами за рабочую смену, проб | 10 | 30 | Производительность анализов снижена у прототипа за счет продолжительного (48 часов) роста колоний для регистрации результатов, что исключает предлагаемый способ. |
| Устойчивость биологического маркера в аэрозоле, час | 0,3-0,5 | 3,0 | Белки, инициирующие льдообразование, более стабильны в аэрозоле, чем клетки Serratia marcescens, что обеспечивает получение адекватных данных о коэффициенте проскока фильтрующих систем при значительной протяженности воздушных коммуникаций |
| Виды технического результата и их размерность | Показатели фактические или расчетные | Совокупность отличительных признаков, улучшающих показатели заявляемого объекта | |
| прототипа | заявляемого объекта | ||
| Устойчивость биологического маркера в пробах сорбирующей жидкости, отобранных из аэрозоля, час | до 3 | до 24 | Белки, инициирующие льдообразование, более стабильны в пробах сорбирующей жидкости, чем клетки Serratia marcescens, что обеспечивает возможность определения коэффициента проскока через длительный (24 часа) промежуток времени после отбора проб |
Возможность осуществления предлагаемого способа показана на следующих примерах.
Пример 1. Генерирование аэрозоля тест-препарата БИЛ с преимущественным размером частиц менее 1 мкм.
Жидкие тест-препараты диспергированы в аэрозольную камеру объемом 1 м3 при помощи прямоструйного пневматического распылителя, оснащенного отсекателем частиц грубой фракции. Анализ дисперсного состава полученных аэрозолей проведен с использованием оптического аэрозольного счетчика ОАС-0,3. Результаты анализа дисперсного состава аэрозолей БИЛ представлены в табл. 2.
| Таблица 2 | ||||||
| Дисперсный состав аэрозолей жидких тест-препаратов БИЛ (численное распределение) | ||||||
| Давление сжатого воздуха при распыле, атм | Содержание частиц во фракции ... мкм, процент | |||||
| 0,3-0,5 | 0,5-1,0 | 1,0-2,0 | 2,0-5,0 | 5,0-10,0 | более 10,0 | |
| 1,5 | 17,2 | 33,6 | 29,4 | 18,2 | 1,8 | 0 |
| 2,0 | 18,6 | 31,0 | 27,4 | 19,6 | 3,9 | 0 |
| 2,7 | 61,5 | 17,2 | 17,1 | 3,9 | 0,2 | 0,01 |
Полученные данные свидетельствуют о возможности получения из жидких препаратов БИЛ тест-аэрозолей, содержащих преимущественно частицы размером менее 1 мкм, необходимые для оценки проницаемости аэрозолей белковых комплексов.
Пример 2. Оценка проникающей способности аэрозолей, генерированных из жидких препаратов БИЛ при помощи прямоструйных распылителей с отсекателями грубодисперсной фракции. Проверено проникание аэрозолей через фильтры (см. табл. 3). Анализ проскока БИЛ через фильтры выполнен на фильтровентиляционной системе с производительностью 1500 м3·ч-1 в соответствии с требованиями (ОСТ Д-504-91ССБТ: Фильтры тонкой очистки воздуха. Методы определения проницаемости: Отраслевой стандарт) с использованием жидкого тест-препарата БИЛ вместо тест-препарата S. marcescens. Пробы аэрозоля отбирали с использованием микроциклонов, содержавших 10 см3 сорбирующей жидкости (физиологического раствора), с производительностью 10 дм3·мин-1.
| Таблица 3 | |||
| Проникающая способность аэрозолей БИЛ через фильтры | |||
| Концентрация БИЛ в препарате, ЦН·см-3 | Концентрация БИЛ в аэрозоле, ... ЦН·дм-3 | Коэффициент проницаемости, процент | |
| до фильтра | после фильтра | ||
| 3,2·109 | 4,3·103 | 0,56 | 1,3·10-2 |
| 2,9·109 | 7,0·103 | 0,81 | 1,2·10-2 |
| 6,9·109 | 1,0·104 | 1,00 | 9,0·10-3 |
| Средние значения | |||
| (4,3±2,2)·109 | (7,1±2,9)·103 | 0,79±0,22 | (1,1±0,2)·10-2 |
Данные табл. 3 свидетельствуют о том, что коэффициент проскока БИЛ через фильтры составил (1,1±0,2)·10-2% и оказался в среднем на три порядка выше, чем коэффициент проскока тест-аэрозоля S. marcescens, составивший в контрольных опытах на данной ФВС (1,6-25,0)·10-6%.
Пример 3. Оценка проникающей способности аэрозолей, генерированных из жидких препаратов БИЛ при помощи прямоструйных распылителей с отсекателями грубодисперсной фракции. Проверено проникание аэрозолей через фильтр противогазовых коробок (см. табл. 4). При проверке противогазовых коробок аэрозоль БИЛ создавали в статической аэрозольной камере. Аэрозоль отбирали через коробки в течение 10 мин с производительностью 10 дм3·мин-1. Пробы аэрозоля отбирали микроциклонами с сорбирующей жидкостью (см. пример 2).
| Таблица 4 | |||
| Проникающая способность аэрозолей БИЛ через фильтр противогазовых коробок | |||
| Концентрация БИЛ в препарате, ЦН·см-3 | Концентрация БИЛ в аэрозоле, ... ЦН·дм-3 | Коэффициент проницаемости, процент | |
| до фильтра | после фильтра | ||
| 6,9·109 | 3,9·104 | 1,10 | 3,7·10-3 |
| 5,1·104 | 1,20 | 2,6·10-3 | |
| 2,0·104 | 0,70 | 4,7·10-3 | |
| Среднее значение | (3,7±1,6)·104 | 2,3±1,5 | (3,7±1,1)·10-3 |
Способ определения проницаемости аэрозольных фильтров в отношении микроорганизмов, включающий приготовление жидкого тест-препарата, диспергирование его в аэрозоль до фильтра, отбор проб аэрозоля до и после фильтра, определение в пробах аэрозоля содержания биологического маркера, отличающийся тем, что в качестве маркера используют тест-препарат белков, инициирующих льдообразование, регистрацию льдообразующей активности которых проводят по наличию в пробе центров нуклеации; белки, инициирующие льдообразование, выделяют путем разрушения клеток штамма-продуцента механической или ультразвуковой обработкой с последующим солевым осаждением и центрифугированием; из полученной белковой пасты готовят тест-препарат, имеющий удельную активность не менее 5,0·108 центров нуклеации в см3; полученный тест-препарат диспергируют в аэрозоль с концентрацией 1·107 центров нуклеации в см3; концентрацию центров нуклеации рассчитывают согласно микрокапельной криоскопической методике, основанной на использовании закона Пуассона для описания вероятности обнаружения центров нуклеации в микрокаплях и расчета концентрации, соответствующей 50% эффекту кристаллизации в группах микрокапель при температуре от минус 7 до минус 11°С, с использованием метода наименьших квадратов; коэффициент проницаемости рассчитывают путем деления концентрации центров нуклеации в пробах после фильтра на концентрацию центров нуклеации в пробах перед фильтром.
