Способ оценки устойчивости эритроцитов к функциональной нагрузке

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии и физиологии, и может быть использовано для оценки дизадаптивных процессов у человека при различных патологических состояниях. Способ заключается в определении содержания метгемоглобина, мембранно-связанного гемоглобина, окисленных нуклеотидов и суммарной оптической плотности эритроцитов до и после проведения функциональной пробы, в качестве которой используют кратковременную локальную ишемию. Указанные показатели определяют дважды - до и после проведения функциональной пробы. На основании полученных данных вычисляют коэффициент устойчивости эритроцитов к ишемии - К. При значении коэффициента К меньше «0» устойчивость эритроцитов к ишемии оценивают высокой, от «0» до 0,1 - нормальной, выше 0,1 - сниженной. Изобретение позволяет оценить устойчивость эритроцитов к функциональной нагрузке - тканевой гипоксии. Способ позволяет быстро, качественно и объективно выявить различный характер клеточной адаптации на ишемию. 1 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии и физиологии, и может быть использовано для оценки дизадаптивных процессов у человека при различных патологических состояниях.

Известен способ диагностики фаз стрессовых состояний путем определения показателей крови, отражающих функциональное состояние организма: концентрации глюкокортикоидов (кортизола) и фертильных факторов: -микроглобулина, трофобластического β1-1-гликопротеида, плацентарного -микроглобулина. Устанавливаемую фазу стрессового состояния (тревоги, резистентности, истощения) и норму диагностируют по величине рассчитываемого коэффициента (Патент №2288475 РФ, МПК G01N 33/74, G01N 33/68. Способ диагностики фаз стрессовых состояний /В.Н.Морозов, А.А.Хадарцев, Ю.В.Карасева, В.И.Морозова, А.В.Хапкина. - Опубл. 27.11.2006, Бюл. №33).

К недостаткам известного способа следует отнести как длительность определения, так и использование дорогостоящих оборудования и реактивов, что препятствует его использованию в широкой медицинской практике.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения типов клеточной реактивности у детей путем оценки устойчивости эритроцитов к функциональной нагрузке (Патент №2231792 РФ, МКИ⁷ G01N 33/49, G01N 33/50, G01N 33/74. Способ определения клеточной реактивности у детей /О.И.Зайцева, В.П.Терещенко, Е.И.Прахин. - Опубл. 27.06.2004).

Сущность известного способа заключается в том, что тип клеточной реактивности определяют по уровню хлортетрациклиновой зондовой флуоресцентной спектроскопии мембран эритроцитов при использовании фармакологических препаратов: ацетилхолин, адреналин, дексаметазон. Для осуществления известного способа пробу замороженных эритроцитов, полученных из цельной венозной крови, трехкратно отмывали физиологическим раствором, после чего проводили выделение мембран эритроцитов. Добавлением физиологического раствора получали суспензию мембран эритроцитов, в пробы которой в физиологических дозах вводили один из указанных фармакологических препаратов in vitro. После замера уровня флуоресценции по формуле вычисляли скорость ответной реакции эритроцитарных мембран, по которой и устанавливали тип клеточной реактивности:

- холинергический - клеточные структуры находятся в состоянии стабильности;

- холинадренергический синергизм - устойчивость к экстремальным воздействиям;

- адренергический - лабильность регуляторных механизмов;

- гипосинергизм холинадренергического типа - сниженная реактивность.

К недостаткам данного способа следует отнести то, что он предназначен для определения типа клеточной реактивности только у детей и не может быть использован для других возрастных групп. Кроме этого известный способ длителен по времени выполнения, предусматривает использование дорогостоящего оборудования, а также требуется привлечение невролога для оценки вегетативного гомеостаза обследуемого.

Задачей заявляемого технического решения является разработка способа оценки устойчивости эритроцитов к функциональной нагрузке - тканевой гипоксии.

Техническим результатом предлагаемого способа является его упрощение и сокращение времени определения.

Технический результат достигается тем, что способ оценки устойчивости эритроцитов к функциональной нагрузке включает взятие пробы крови, выделение эритроцитов, получение супернатанта, проведение функциональной пробы и определение физико-химических показателей эритроцитов.

Отличительные приемы заявляемого способа заключаются в определении содержания метгемоглобина, мембранно-связанного гемоглобина, окисленных нуклеотидов и суммарной оптической плотности эритроцитов.

Отличие способа также заключается и в том, что указанные показатели определяют дважды - до и после проведения функциональной пробы.

Отличительным приемом также является и то, что в качестве функциональной пробы используют «манжеточную» пробу, обеспечивающую кратковременную локальную ишемию.

Авторами предлагаемого способа установлено, что устойчивость эритроцитов к ишемии определяют по коэффициенту, вычисляемому по формуле:

К=1/4·(ΔМНb+ΔmcHb+ΔNuc+ΔOp)·0,1,

где: К - коэффициент устойчивости эритроцитов к ишемии;

Δ - разница величин показателей после и до проведения функциональной пробы;

ΔМНb - разница величин показателей содержания метгемоглобина, %;

ΔmcHb - разница величин показателей содержания мембранно-связанного гемоглобина, %;

ΔNuc - разница величин показателей содержания окисленных нуклеотидов, у.е.;

ΔОр. - разница величин показателей суммарной оптической плотности, у.е.;

0,1 - постоянный коэффициент.

Авторами заявляемого способа установлено, что величина коэффициента К позволяет судить о характере устойчивости эритроцитов к ишемии. Так, при значении коэффициента К меньше «0» устойчивость эритроцитов к ишемии оценивают высокой, от «0» до 0,1 - нормальной, выше 0,1 - сниженной.

Проведенный сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного вышеперечисленными приемами и, следовательно, соответствует критерию изобретения «новизна».

Сравнение заявляемого технического решения не только с прототипом, но и другими решениями не позволило выявить в них признаки, отличающие заявляемое решение не только от способа-прототипа, но и от других аналогичных решений в данной и смежных областях медицины.

В доступной литературе не выявлено способа оценки компенсаторных возможностей клетки - эритроцита к тканевой гипоксии (ишемии) не по отдельно взятому параметру, а по функциональному состоянию эритроцитов, которое характеризуют предлагаемые к определению физико-химические показатели - метгемоглобин, мембранно-связанный гемоглобин, окисленные нуклеотиды, суммарная оптическая плотность эритроцитов.

Клинические наблюдения и проведенный анализ полученных результатов позволил авторам заявляемого способа провести оценку устойчивости эритроцитов к ишемическому воздействию, по которой можно судить о клеточных компенсаторно-приспособительных реакциях организма при ишемических и гипоксических состояниях.

Это позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, а именно в биохимии и физиологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке примерами и средствами, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Утром натощак из локтевой вены проводят забор крови в пробирку, содержащую 3.8% раствора цитрата натрия. Забор крови проводят дважды: до и после 5-минутного пережатия плечевой артерии манжетой аппарата Короткова, чтобы его показатели на 10 мм рт. столба превышали систолическое давление пациента (манжеточная проба). Повторный забор крови проводят из локтевой вены руки, которая не подвергалась ишемии.

Для определения содержания метгемоглобина и мембранно-связанного гемоглобина кровь гемолизируют дистиллированной водой и по спектральным характеристикам устанавливают величины этих показателей.

Так, содержание метгемоглобина проводят при длине волны 630 нм (Справочник по лабораторным методам исследования под ред. Л.А.Даниловой, «Питер». - 2003. - С.74), а содержание мембранно-связанного гемоглобина - при длине волны 536 нм (Токтамысова З.С., Биржанова Н.Х. Определение мембранно-связанного гемоглобина. - Ж. «Биофизика». - 1990. - Т.35, вып.6. - с.1119-1120).

Содержание метгемоглобина и мембранно-связанного гемоглобина выражают в процентах.

Суммарную оптическую плотность и содержание окисленных нуклеотидов определяют в супернатанте эритроцитов после осаждения суспензии эритроцитов трихлоруксусной кислотой и снятия УФ-спектров в интервале длин волн 220-300 нм и выражают в единицах оптической плотности - у.е. (Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г. и др. Способ определения состояния мембран эритроцитов. МПК G01N 33/48, 33/52. Патент РФ №2296992, от 10.04.2007, Бюл. №10).

Для определения разницы величины (Δ) каждого исследуемого показателя нужно от его величины после проведения функциональной пробы вычесть его величину до проведения функциональной пробы.

Полученные разницы определяемых показателей (Δ) суммируют, усредняют и умножают на постоянный коэффициент 0,1. Получаемый показатель авторы предлагаемого способа обозначили коэффициентом устойчивости эритроцитов к ишемии - К.

К=1/4·(ΔМНb+ΔmcHb+ΔNuc+ΔOp)·0,1,

где:

ΔМНb - разница величин показателей содержания метгемоглобина, %;

ΔmcHb - разница величин показателей содержания мембранно-связанного гемоглобина, %;

ΔNuc - разница величин показателей содержания окисленных нуклеотидов, у.е.;

ΔОр - разница величин показателей суммарной оптической плотности, у.е.;

0,1 - постоянный коэффициент.

При величине К меньше «0» устойчивость эритроцитов к ишемии оценивают высокой, от «0» до 0,1 - нормальной, выше 0,1 - сниженной.

Предложенный способ поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Донор М., практически здоров. Проведена манжеточная проба. В полученных образцах крови определены изучаемые показатели до и после пробы.

МНb: до - 1,0%, после 1,4%	ΔМНb=0,4%
mcHb: до - 3,6%, после 0,9%	ΔmcHb=-2,7%
Nuc: до - 0,36 у.е., после 0,34 у.е.	ΔNuc=-0,002 у.е.
Ор: до - 4,53 у.е., после - 4,79 у.е.	ΔОр=0,26 у.е.

Полученные разницы (Δ) суммируют, усредняют и умножают на 0,1.

К=((0,4-2,7-0,002+0,26)/4)·0,1=- 0,0515

Рассчитанная величина коэффициента К отражает высокую устойчивость эритроцитов к ишемии.

Пример 2. Больной В., история болезни 1223, диагноз: ишемическая болезнь сердца, II функциональный класс, стенокардия напряжения.

Больному проведена манжеточная проба. В полученных образцах крови определены изучаемые показатели до и после пробы.

МНb: до - 2,7%, после 3,4%	ΔМНb=0,7%
mcHb: до - 8,2%, после 10,9%	ΔmcHb=2,7%
Nuc: до - 0,6 у.е., после 0,057 у.е.	ΔNuc=-0,003 у.е.
Ор: до - 1,768 у.е., после - 1,549 у.е.	ΔОр=-0,219 у.е.

Полученные разницы (Δ) суммируют, усредняют и умножают на 0,1.

К=((0,7+2,7-0,003-0,219)/4)·0,1=0,079

Рассчитанная величина коэффициента К у данного больного позволила оценить устойчивость эритроцитов к ишемии как нормальную.

Пример 3. Больной М., история болезни 1264, диагноз: ишемическая болезнь сердца, III функциональный класс стенокардии напряжения.

Больному проведена манжеточная проба. В полученных образцах крови определены изучаемые показатели до и после пробы.

МНb: до - 0,1%, после 0,4%	ΔМНb=0,3%
mcHb: до - 10%, после 14,3%	ΔmcHb=4,3%
Nuc: до - 0,05 у.е., после 0,188 у.е.	ΔNuc=0,138 у.е.
Ор: до - 2,902 у.е., после - 4,33 у.е.	ΔOp=1,428 у.е.

К=((0,3+4,3+0,138+1,428)/4)·0,1=0,1542

Полученный показатель «К» указывает на сниженную устойчивость эритроцитов к ишемии у данного больного.

После проведения комплекса лечебных мероприятий больным В. и М. были получены следующие результаты:

Больной В.

МНb: до - 0,3%, после 0,1%	ΔМНb=-0,2%
mcHb: до - 8,4%, после 9,3%	ΔmcHb=0,9%
Nuc: до - 0,105 у.е., после 0,121 у.е.	ΔNuc=0,016 у.е.
Ор: до - 2,342 у.е., после - 2,579 у.е.	ΔОр=0,237 у.е.

К=((0,9+0,016+0,237-0,2)/4)·0,1=0,0238

Больной М.

МНb: до - 3,2%, после 4,0%	ΔМНb=0,8%
mсНb: до - 8,1%, после 9,8%	ΔmcHb=1,7%
Nuc: до - 0,04 у.е., после 0,049 у.е.	ΔNuc=0,009 у.е.
Ор: до - 2,389 у.е., после - 2,844 у.е.	ΔОр=0,455 у.е.

К=((0,8+1,7+0,009+0,455)/4)·0,1=0,0741

Следовательно, проведенные меры терапевтического воздействия привели к существенному улучшению устойчивости красных клеток крови к ишемической пробе у данных больных ИБС.

Было обследовано 40 пациентов с диагнозом ишемическая болезнь сердца в возрасте от 46 до 71 года (средний возраст 55±1,3 лет). Из них по 20 больных со стенокардией напряжения II-го и III-го функциональных классов по NYHA. Контрольную группу составили доноры - 15 практически здоровых людей.

Сравнительный анализ усредненных данных показал, что коэффициент устойчивости эритроцитов к ишемии у доноров существенно отличается от коэффициентов, выявленных у больных ИБС с различной тяжестью (функциональным классом) стенокардии напряжения (Таблица).

Коэффициент устойчивости эритроцитов - К	Доноры (15)	II функциональный класс (20)	III функциональный класс (20)
средняя, в том числе:	0,0002377±0,01	0,043105±0,01*	0,078855±0,018*
К<0	-0,0299±0,01	-0,069975±0,03	-0,039933±0,018
0<К<=0,1	0,036678±0,01	0,046491±0,01	0,047488±0,007
К>0,1	0	0,12612±0,009*	0,160156±0,02*
*-р<0,05 в сравнении с донорами

Таким образом, разработанный способ позволяет быстро, качественно и объективно выявить различный характер клеточной адаптации на ишемию, что обеспечивает возможность его широкого использования в практической медицине. Величина коэффициента К является оценочным критерием устойчивости эритроцитов к ишемии не только у практически здоровых людей, но и больных. Изучение индивидуальных типов устойчивости и реагирования на факторы среды на уровне клетки позволит патогенетически обоснованно подойти к ранней диагностике и лечению многих патологических процессов.

Способ оценки устойчивости эритроцитов к функциональной нагрузке, включающий взятие пробы крови, выделение эритроцитов, получение супернатанта и проведение функциональной пробы с последующим определением физико-химических показателей эритроцитов, отличающийся тем, что определяют содержание метгемоглобина, мембраносвязанного гемоглобина, окисленных нуклеотидов и суммарную оптическую плотность эритроцитов до и после проведения функциональной пробы, в качестве которой используют кратковременную локальную ишемию, затем определяют разницу величин каждого показателя после и до проведения функциональной пробы, после чего устойчивость эритроцитов к ишемии устанавливают по формуле
K=1/4·(ΔMHb+ΔmcHb+ΔNuc+ΔOp)·0,1,
где K - коэффициент устойчивости эритроцитов к ишемии;
Δ - разница величин показателей после и до проведения функциональной пробы;
ΔMHb - разница величин показателей содержания метгемоглобина, %;
ΔmcHb - разница величин показателей содержания мембраносвязанного гемоглобина, %;
ΔNuc - разница величин показателей содержание окисленных нуклеотидов, у.е.;
ΔOp - разница величин показателей суммарной оптической плотности, у.е.;
0,1 - постоянный коэффициент,
и при значении коэффициента K меньше 0 устойчивость эритроцитов к ишемии оценивают высокой, от 0 до 0,1 - нормальной, выше 0,1 - сниженной.