Способ выявления больных описторхозом и инвазированных opisthorchis felineus кошек
Владельцы патента RU 2396565:
Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии) (RU)
Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к способам диагностики описторхоза у кошек. Способ выявления больных описторхозом и инвазированных О.felineus кошек включает последовательное нанесение на активированный описторхозным антигеном микротитровальный планшет пробы разведенных исследуемых сыворотки крови кошек и сывороток отрицательного и положительного контроля, конъюгата антител к IgM человека с пероксидазой и субстрата, инкубацию проб и контрольных образцов, добавление антигенспецифичного IgM человека и определение положительной пробы путем фотометрирования, при этом расчет титра определяемой пробы осуществляют методом Logit/log, и при титре больше 1:112 пробу считают положительной. Способ позволяет проводить массовые исследования кошек и выявлять инвазированных животных в период отсутствия яйцепродукции паразита. 1 табл.
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной паразитологии, и может быть использовано для выявления описторхоза у кошек.
Известен способ иммуноферментного тестированиия специфических антител при описторхозе, вызываемом печеночной трематодой opisthorhis felineus (Сравнительное биохимическое и иммунологическое изучение соматического и метаболического антигенов Opisthorchis felineus. - Медицинская паразитология и паразитарные болезни, №2, 1996, с.18-23, RU 2143488, 27.12.1999, RU 2143838, 10.01.2000, RU 2136216, 10.09.1999, US 5863775, 26.01.1999).
Способ включает использование специфического реагента, который представляет собой комплекс из сорбированных на пластиковой поверхности планшеты МКА (моноклональных антител) и афинно-захваченной иммуноспецифической фракции АГ О.felineus.
Однако данный способ не предназначен для количественной детекции антител к антигенам Opisthorchis felineus у кошек и других видов животных.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому и взятым за прототип является способ иммуноферментного тестирования специфических антител при описторхозе, вызываемом печеночной трематодой Opisthorchis felineus (Котелкин А.Т. и др. Реагент для иммуноферментного анализа и способ иммуноферментного тестирования специфических антител при описторхозе, вызываемом печеночной трематодой Opisthorchis felineus, патент №2197736,27.01.2003).
Способ включает использование специфического реагента, состоящего из комплекса сорбированных на пластиковой поверхности планшеты МКА (моноклональных антител) и афинно-захваченной иммуноспецифической фракции АГ (антигена) O.felineus и дальнейшего иммуноферментного тестирования специфических антител. Техническим результатом данного способа является повышение специфичности и чувствительности теста и уменьшение времени анализа сыворотки.
Недостатком данного способа является невозможность выявления специфических к антигену Opisthorchis felineus антител у кошек.
Технической задачей заявляемого решения является расширение арсенала способов диагностики описторхоза кошек.
Поставленная задача решается тем, что в способе выявления больных описторхозом и инвазированных О. felineus кошек, согласно изобретению включающем последовательное нанесение на активированный описторхозным антигеном микротитровальный планшет пробы разведенных исследуемых сывороток крови кошек и сывороток отрицательного и положительного контроля, конъюгата антител к IgM человека с пероксидазой и субстрата, инкубацию проб и контрольных образцов, добавление антигенспецифичного IgM человека и определение положительной пробы путем фотометрирования, при этом расчет титра определяемой пробы осуществляют методом Logit/log, и при титре больше 1:112 пробу считают положительной.
Способ осуществляется следующим образом: в лунки микропланшета с сорбированным на дне лунок антигеном Opisthorchis felineus вносят пробы исследуемых сывороток, а также заведомо отрицательные и заведомо положительные контроли. При наличии антител специфично связывающихся с антигенами Opisthorchis felineus происходит блокирование части антигенов. После отмывки от несвязавшихся антител в лунки планшета вносят заведомо специфичный к антигенам IgM человека в титре, достаточном для полного связывания со всеми антигенами, сорбированными на дне лунки планшета. В случае отсутствия в исследуемых пробах антител специфичных к антигенам Opisthorchis felineus, антигенспецифичный иммуноглобулин связывается со всеми антигенами, в случае наличия в пробе антител, специфичных к антигенам Opisthorchis felineus, происходит ингибирование связывания IgM человека с антигенами пропорционально концентрации специфических антител исследуемой пробы.
Уровень конкурентного ингибирования, антителами пробы связывания заведомо специфичного к антигенам IgM человека определяют путем внесения конъюгата антивидовых антител (к IgM человека) с ферментом пероксидазой.
После отмывки от несвязавшегося конъюгата выявляют активность оставшейся ферментной метки (пероксидазы) путем добавления хромогенного агента (ортофенилендиамина), инкубации и измерения оптической плотности.
Таким образом, концентрация специфичных к Opisthorchis felineus антител будет обратно пропорциональна оптической плотности в лунке планшета.
Способ осуществляют следующим образом.
Материал: пробы сыворотки кошек.
Реагенты: микропланшеты с сорбированным антигеном Opisthorchis felineus (производства ЗАО «Вектор-Бэст») антигенспецифичные поликлональные антитела человека, относящиеся к IgM, заведомо положительные и заведомо отрицательные контрольные сыворотки (кошки), конъюгат пероксидазы с видоспецифичными антителами к IgM человека, реакционный буфер (0,1М фосфатносолевой буфер с pH 7,2), буфер для отмывки (0,1М фосфатно-солевой буфер с 0,02% Tween, pH 7,2-7,4), раствор о-фенилендиамина, стоп-раствор (5% раствор додецилсульфата натрия).
Техника постановки реакции.
В лунки микропланшета вносят по 100 мкл проб сыворотки, разведенных в соотношении 1/50 реакционным буфером, и контрольные сыворотки, разведенные аналогичным образом, в качестве положительного контроля используют сыворотку с титрами 1:10, 1:100, 1:1000.
После инкубации, при комнатной температуре, в течение 1 часа, лунки двухкратно промывают промывочным буфером, после чего в каждую лунку вносят антигенспецифичный IgM человека, разведенный реакционным буфером в соотношении 1:100 в количестве 100 мкл.
После инкубации, при комнатной температуре, в течение 30 минут, несвязавшиеся антитела удаляют отмыванием промывочным буфером (3-кратно) и вносят по 100 мкл конъюгата, разведенного реакционным буфером (в соответствии с рекомендациями производителя конъюгата).
После инкубации, при комнатной температуре, в течение 30 минут, несвязавшийся конъюгат удаляют отмыванием промывочным буфером (3-кратно) и вносят по 100 мкл раствора ортофенилендиамина и инкубируют 20 минут при комнатной температуре.
Реакцию останавливают внесением 100 мкл стоп-раствора.
Пробы фотометрируют в вертикальном спектрофотометре с использованием светофильтра 405 нм.
Положительными пробами считают пробы, оптическая плотность которых меньше, чем оптическая плотность в лунках с отрицательными контрольными образцами. Для расчета титра определяемой пробы использовали метод Logit/log. Отрицательными считали пробы, титр которых меньше 1:109, положительными считали пробы, титр которых больше 1:112.
Для иллюстрации способа приведены следующие примеры:
Пример 1.
Для оценки специфичности реакции были отобраны пробы крови от кошек, больных описторхозом, и заведомо здоровых по результатам клинического обследования, копроовоскопии и неполного паразитологического вскрытия.
Сыворотки крови тестировали заявляемым способом.
Результаты ИФА у животных, инвазированных и неинвазированных Opisthorchis felineus приведены в таблице 1.
| Табл.1 | ||
| показатель | неинвазированные О.felineus | инвазированные О.felineus |
| Средний титр, М+m | 129,4+2,38 | 84,95+1,82* |
| Выборка, n | 15 | 15 |
*Примечание: р<0.95
Здоровые и инвазированные Opisthorchis felineus животные группируются по результатам ИФА в группы с высокой и низкой оптической плотностью соответственно.
Пример 2. Для оценки линейности и диапазона определяемых концентраций провели исследования с серийными десятикратными разведениями заведомо положительной сыворотки.
ИФА позволяет определять титры антител, различающиеся в 100 раз.
Пример 3. В данном примере показана воспроизводимость реакции.
Для этого 30 проб протестировали 4 раза, в результате вариабельность результатов не превышала 5%.
Таким образом: предложенный способ позволяет определить наличие антител к антигену Opisthorchis felineus в сыворотке крови кошек.
Способ выявления больных описторхозом и инвазированных Opisthorchis felineus кошек, характеризующийся тем, что он включает последовательное нанесение на активированный описторхозным антигеном микротитровальный планшет пробы разведенных исследуемых сывороток крови кошек и сывороток отрицательного и положительного контроля, конъюгата антител к IgM человека с пероксидазой и субстрата, инкубацию проб и контрольных образцов, добавление антигенспецифичного IgM человека и определение положительной пробы путем фотометрирования, при этом расчет титра определяемой пробы осуществляют методом Logit/log, и при титре больше 1:112 пробу считают положительной.
