Вакцины и способы лечения собачьего гриппа

Настоящее изобретение относится к обеспечению новых вакцин и способов лечения заболеваний, связанных с вирусом собачьего гриппа. Способ иммунизации собаки против вируса гриппа включает введение указанной собаке терапевтически эффективного количества вакцины, содержащей по меньшей мере один аттенюированный или инактивированный вирус гриппа H3N8, где указанный вирус выделен из собаки, причем количество указанного вируса составляет от 10 до 10000 единиц ГА, и вакцина дополнительно содержит адъювант, где адъювант может быть выбран из а) метаболизируемого адъюванта, b) неметаболизируемого адъюванта, с) 2% квасцов, d) 5% квасцов, е) Quil А и f) холестерина или любой их комбинации. Способ получения вакцины против вируса гриппа собак включает приготовление композиции, содержащей терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одного аттенуированного или инактивированного вируса гриппа H3N8, где указанный вирус выделен из собаки. Применение вакцины, полученной способом для иммунизации собак против вируса гриппа. Изобретение обеспечивает повышение эффективности иммунизации. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 табл., 2 ил.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к обеспечению новых вакцин и способов лечения заболеваний, связанных с вирусом собачьего гриппа. В нем раскрыты вирусные антигены гриппа и способы представления этих антигенов у псовых, в особенности у собак. Изобретение касается аттенуированных и инактивированных вакцин. Настоящее изобретение относится к экспериментально созданным вакцинам и вирусам собачьего и конского гриппа. Настоящее изобретение также включает вирусы гриппа A, H3, N8, H3N8 и H7N7, которые содержат по меньшей мере один геномный сегмент из вируса собачьего или конского гриппа. Настоящее изобретение также относится к применению этих вирусов в терапевтических композициях для защиты псовых, в частности собак, от заболеваний, вызванных вирусами гриппа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Примерно с 1956 года вирус конского гриппа признан основным респираторным патогеном у лошадей. Заболевания, вызванные вирусом конского гриппа, могут иметь тяжелую симптоматику и часто сопровождаются вторичными бактериальными инфекциями. Выделены два подтипа вируса конского гриппа, а именно подтип 1, представляющий собой прототип вируса A/Equine/Prague/1/56 (H7N7), и подтип 2, представляющий собой прототип вируса A/Equine/Miami/1/63 (H3N8). В настоящее время преобладающим подтипом вируса является подтип 2, штамм H3N8. Предполагается, что этим штаммом могут быть инфицированы псовые, и он может быть достаточно вирулентным, достигающим по некоторым данным уровня смертности псовых 36%. Возможно, что межвидовая передача собаке полного или части вируса конского гриппа привела к появлению нового собачьего специфического вируса гриппа, связанного с острым респираторным заболеванием. Смотри «Transmission of Equine Influenza to Dogs» (P.C. Crawford et al., Science 310, 482-485 (2005). Существует явная и убедительная потребность в эффективной вакцине для лечения и профилактики этого нового собачьего гриппа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 показывает среднее геометрическое значение реакции в месте инъекции у собак, привитых вакцинами конского антигена. Фигура 2 показывает средний процент легочной консолидации у животных, привитых вакцинами вируса конского гриппа и зараженных вирусом собачьего гриппа.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает антигены, конского и собачьего гриппа, вакцины и способы применения этих вакцин для лечения псовых, в особенности собак, от инфекций, заболеваний и симптомов, вызванных собачьим гриппом. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает терапевтические композиции для защиты животного от заболевания, вызванного вирусом гриппа. В настоящем изобретении описаны способы получения вакцин и способы лечения животных. Антигены настоящего изобретения могут представлять собой любой идентифицированный штамм вируса гриппа, от любой птицы или млекопитающего, включающий грипп, имеющий антигенный подтип H3N8, или более часто называемый штаммом H3N8, но не ограничены ими. Грипп может иметь происхождение от любого из млекопитающих, включая без ограничения свиное, птичье, конское или собачье происхождение. Предпочтительными являются вирусы конского и собачьего гриппа и родственные антигены. Раскрыты штаммы, имеющие белки, обозначаемые H3 или N8. Штаммы, имеющие оба белка H3N8, являются предпочтительными. Также раскрыты штаммы, имеющие белки, обозначаемые H7N7.

Приведено описание концентрации антигена и получение вакцины. Описаны культуральные клеточные среды и рост вирусов. Приведено полное описание получения вакцины аттенуированного, инактивированного вируса, а также вакцинных адъювантов, рецептур, форм и носителей, дозировок, путей введения и анализов.

ПОБРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

Ниже даны определения, относящиеся к настоящему раскрытию, термины, которые не указаны, имеют значения, обычно используемые специалистами в данной области техники.

"Примерно", используемое в связи с измеряемыми числовыми переменными, относится к указанному значению переменной и ко всем значениям переменной, находящимся в пределах экспериментальной ошибки указанного значения (например, в пределах доверительного интервала 95% для среднего значения) или в пределах 10 процентов указанного значения, независимо от того, что больше.

"Активный иммунитет" включает как гуморальный иммунитет, так и клеточный иммунитет собаки.

"Антитело" относится к молекуле иммуноглобулина, которая может связываться со специфическим антигеном в результате иммунного ответа на этот антиген. Иммуноглобулины представляют собой сывороточные белки, состоящие из "легких" и "тяжелых" полипептидных цепей, имеющих "постоянные" и "вариабельные" участки, и разделенные на классы на основе состава постоянных участков (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). Антитело, которое является "специфическим" для данного антигена, указывает, что вариабельные участки антитела распознают и связываются исключительно со специфическим антигеном. Антитела могут представлять собой поликлональную смесь или быть моноклональными. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, полученными из природных источников или из рекомбинантных источников, или могут быть иммунореактивными участками интактных иммуноглобулинов. Антитела могут существовать в ряде форм, включающих, например, как Fv, Fab', F(ab')₂, так и в виде одноцепочечных форм.

Термины "антиген" или "иммуноген" относятся к молекуле, содержащей одну или больше антигенных детерминант (линейных, конформационных или и тех и других), которая после воздействия на субъект вызовет иммунный ответ, являющийся специфическим для этого антигена. Антигенная детерминанта представляет собой определенный участок антигена, который связывается с рецептором T-клетки или со специфическим антителом, и обычно содержит от примерно 3 аминокислотных остатков до примерно 20 аминокислотных остатков. Термин антиген относится к субъединичным антигенам, то есть к антигенам, выделенным и отделенным от целого организма, с которым антиген связан в природе, а также к убитым, аттенуированным или инактивированным бактериям, вирусам, грибам, паразитам или другим микроорганизмам. Термин антиген также относится к антителам, таким как анти-идиотипическим антителам или к их фрагментам, и к синтетическим пептидным мимотопам, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту (эпитоп). Термин антиген также относится к олигонуклеотиду или полинуклеотиду, который in vivo экспрессирует антиген или антигенную детерминанту, как в случаях применения ДНК-иммунизации.

"Антигенность" относится к способности белка или полипептида иммуноспецифически связываться с антителом, вырабатываемым против белка или полипептида.

"Псовые" включают животных, общепринято называемых собаками, но также включают других представителей семейства Canidae.

"Клеточный иммунный ответ" - см. иммунный ответ.

Выражение "животное-компаньон", используемое в настоящем описании, относится к любому животному, не являющемуся человеком в неволе, которое считается домашним животным. Такие животные могут включать без ограничения собак, кошек, лошадей, овец, кроликов, обезьян и грызунов, включающих мышей, крыс, хомяков, песчанок и хорьков.

"Лошадь" включает животных, общепринято называемых лошадьми, но также включает других представителей семейства Equidae.

"Наполнитель" относится к любому компоненту вакцины, который не является антигеном.

"Первая вакцина", "вторая вакцина", "третья вакцина" и тому подобное относится к отдельно вводимым вакцинам, которые могут быть одинаковыми или разными и которые обычно можно вводить в любом порядке. Таким образом, третью вакцину можно вводить субъекту перед второй вакциной или после нее.

Термин "гетерологичный", используемый в настоящем описании, означает полученный из другого вируса, вида или штамма.

Используемые в настоящем описании термины "гомологичность", "гомологичный" и тому подобные означают степень идентичности между общими полипептидными или полинуклеотидными последовательностями.

Термин "гомологичный", используемый в настоящем описании по отношению к вирусу и виду, означает те же самые виды или штамм вируса.

Используемый в настоящем описании термин "клетка-хозяин" означает бактериальную или эукариотическую клетку, включающую клетки млекопитающих, птиц или насекомых, которая несет плазмиду, вирус или другой вектор.

"Гуморальный иммунный ответ" - см. иммунный ответ.

"Гибридома" - см. моноклональное антитело.

"Иммунный ответ" у субъекта относится к развитию гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа или гуморального и клеточного иммунного ответа на антиген. "Гуморальный иммунный ответ" относится к реакции, опосредуемой антителами. "Клеточный иммунный ответ" является реакцией, опосредуемой T-лимфоцитами или другими лейкоцитами или и теми и другими, и включает выработку цитокинов, хемокинов и подобных молекул, вырабатываемых активированными T-клетками, лейкоцитами или и теми и другими. Иммунные ответы можно определять с использованием стандартных иммуноанализов и проб на нейтрализацию, известных в данной области техники.

"Иммуногенность" относится к способности белка или полипептида выявить иммунный ответ, направленный специфично против бактерии или вируса, которые вызывают идентифицированную болезнь.

"Иммунологически защитное количество" или "количество, эффективное для выработки иммунного ответа" антигена является количеством, эффективным для индукции иммунного ответа у реципиента, который достаточен для предотвращения или улучшения признаков или симптомов заболевания, включающих неблагоприятные воздействие на здоровье или его осложнения. Как гуморальный иммунитет, так и клеточный иммунитет или и тот и другой могут быть индуцированными. Можно оценивать иммунногенный ответ животного на композицию вакцины, например, косвенно, посредством измерения титров антител, тестами пролиферации лимфоцитов, или непосредственным контролем признаков и симптомов после заражения штаммом дикого типа. Защитный иммунитет, обеспечиваемый вакциной, можно оценивать путем измерения, например, по уменьшению клинических признаков, таких как смертность, заболеваемость, температурные показатели, общее физическое состояние и общее состояние здоровья и поведения субъекта. Иммунный ответ может включать без ограничения индукцию клеточного и/или гуморального иммунитета. Количество вакцины, являющееся терапевтически эффективным, может варьировать в зависимости от конкретного используемого вируса или состояния прививаемого животного и может быть определено ветеринарным врачом.

"Интраназальное" введение относится к введению вещества, такого как вакцина, в организм субъекта через нос или посредством носа и охватывает транспорт вещества прежде всего через слизистую оболочку носа.

Термин "выделенный", используемый в настоящем описании, означает удаление из природного окружения, как единственного, так и в гетерологичной клетке-хозяине, или хромосоме, или векторе (например, в плазмиде, фаге и т.д.). "Выделенные бактерии", "выделенные анаэробные бактерии", "выделенный бактериальный штамм", "выделенный вирус", "выделенный вирусный штамм" и тому подобное относятся к композиции, в которой бактерии или вирус по существу не содержат других микроорганизмов, например, в культуре, такой как выделенной из окружающей его среды природного происхождения. Если термин "выделенный" используют для описания какого-либо конкретно указанного вещества, такого как полинуклеотид или полипептид, он относится к веществу, которое отделено от исходного клеточного окружения, в котором обычно находится вещество, такое как полипептид или нуклеиновая кислота. Таким образом, согласно использованию в настоящем изобретении, только в качестве примера, рекомбинантная клеточная линия, сконструированная с полинуклеотидом настоящего изобретения, использует "выделенную" нуклеиновую кислоту. Альтернативно, если конкретный белок или специфический иммуногенный фрагмент является заявленным или используемым в качестве вакцины, он будет считаться выделенным, поскольку он был идентифицирован, отделен и до некоторой степени очищен по сравнению с тем, как он мог бы существовать в природе. Если белок или его специфический иммуногенный фрагмент получают в рекомбинантном бактериальном или эукариотическом векторе экспрессии, который продуцирует антиген, считается, что он существует в виде выделенного белка или нуклеиновой кислоты. Например, рекомбинантная клеточная линия, сконструированная с полинуклеотидом, использует "выделенную" нуклеиновую кислоту.

"Метаболизируемые адъюванты" представляют собой адъюванты, состоящие из компонентов, способных к преобразованию у видов-мишеней в ходе обмена веществ, такие как адъюванты на основе растительного масла. Метаболизируемый адъювант может представлять собой метаболизируемое масло. Метаболизируемые масла представляют собой жиры и масла, которые обычно встречаются в растениях и в животных организмах и обычно состоят в основном из смесей триацилглицеринов, также известных, как триглицериды или нейтральные жиры. Эти неполярные, нерастворимые в воде вещества являются триэфирами глицерина и жирных кислот. Триацилглицерины отличаются в зависимости от идентичности и месторасположения в них трех остатков жирных кислот. См. сравнение с "неметаболизируемым адъювантом".

"Неметаболизируемые адъюванты" представляют собой адъюванты, состоящие из компонентов, которые не могут метаболизироваться в организме животного субъекта, которому вводят эмульсию. Неметаболизируемые масла, подходящие для использования в эмульсиях настоящего изобретения, включают алканы, алкены, алкины и их соответствующие кислоты и их спирты, эфиры и сложные эфиры, и их смеси. Предпочтительно, отдельные соединения масел представляют собой легкие углеводородные соединения, то есть такие компоненты имеют от 6 до 30 атомов углерода. Масло может быть получено синтетически или очищено из нефтепродуктов. Предпочтительные неметаболизируемые масла для использования в эмульсиях настоящего изобретения включают, например, минеральное масло, вазелиновое масло и циклопарафины. Термин "минеральное масло" относится к неметаболизируемому адъювантному маслу, которое представляет собой смесь жидких углеводородов, полученных из петролатума посредством технологии дистилляции. Термин является синонимом "сжиженного парафина", "жидкого вазелина" и "белого минерального масла". Также предполагается, что этот термин включает "легкое минеральное масло", то есть масло, которое получено подобным образом путем дистилляции петролатума, но которое обладает немного более низкой удельной массой, чем белое минеральное масло. Смотри, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, at pages 788 and 1323). Минеральное масло можно получать из различных коммерческих источников, например, J.T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). Предпочтительным минеральным маслом является легкое минеральное масло, коммерчески доступное под торговым наименованием DRAKEOL®.

"Моноклональное антитело" относится к антителам, продуцируемым единственной линией клеток гибридомы, все из которых нацелены на одну антигенную детерминанту в конкретном антигене. Можно обеспечивать антиген, используемый для создания моноклонального антитела, в виде выделенного белка патогена или целого патогена. "Гибридома" представляет собой клональную клеточную линию, которая состоит из гибридных клеток, образованных слиянием миеломной клетки и специфической антителопродуцирующей клетки. Обычно моноклональные антитела имеют мышиное происхождение; вместе с тем, моноклональное антитело также относится к клональной популяции антитела, созданного против конкретной антигенной детерминанты антигена, полученного технологией фагового дисплея, или способом, эквивалентным фаговому дисплею или гибридным клеткам немышиного происхождения.

Выражение «N дней» или «М дней» после события относятся соответственно к любому времени в день N или в день М после события. Например, вакцинация субъекта второй вакциной через 14 дней после введения первой вакцины подразумевает, что вторую вакцину вводят в любое время на 14-й день после введения первой вакцины.

"ORF" означает "открытую рамку считывания", то есть кодирующую область гена.

"Пероральное" введение относится к введению вещества, такого как вакцина, в организм субъекта через рот или посредством рта и охватывает глотание или транспорт через слизистую оболочку рта (например, применение под язык или буккальное всасывание) или и то и другое. Интратрахеальный путь также относится к пероральному введению.

"Ороназальное" введение относится к введению вещества, такого как вакцина, в организм субъекта через нос и рот или посредством носа и рта, как будет происходить, например, при попадании одной или более капель в нос. Ороназальное введение охватывает процессы транспорта, связанные с пероральным и интраназальным введением.

"Парентеральное введение" относится к введению вещества, такого как вакцина, в организм субъекта через или посредством пути, в который не входит пищеварительный тракт. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутримышечное введение, чрескожное введение, внутрикожное введение, интраперитонеальное введение, внутриглазное введение и внутривенное введение. Для задач настоящего раскрытия парентеральное введение исключает пути введения, которые в первую очередь охватывают транспорт вещества через ткань слизистых оболочек во рту, в носу, трахее и легких.

Выражение "фармацевтически приемлемое" относится к веществам, входящим в объем действующих медицинских представлений, подходящим для использования в контакте с тканями субъектов без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и тому подобного, в сопоставлении с разумным соотношением "пользы и риска" и эффективным для использования по назначению.

"Фармацевтически приемлемый носитель" относится к среде носителя, которая не нарушает эффективности биологического действия активного компонента и не является токсичной для субъекта, которому ее вводят.

"Поликлональное антитело" относится к смешанной популяции антител, созданных против конкретного патогена или антигена. Обычно популяция содержит множество групп антител, и каждая группа направлена против конкретной антигенной детерминанты патогена или антигена. Для создания поликлональных антител целый патоген или выделенный антиген инокуляцией или инфицированием вводят в организм хозяина, что индуцирует выработку антител против патогена или антигена в организме хозяина.

"Профилактика инфекции" означает предотвращение или ингибирование репликации бактерий или вируса, которые вызывают идентифицированное заболевание, ингибирование передачи бактерий или вируса, или предотвращение внедрения бактерии или вируса в хозяина, или облегчение симптомов заболевания, вызванного инфекцией. Лечение считается терапевтическим, если наблюдается снижение бактериальной или вирусной нагрузки.

Термины "защита", "защитная" и т.п., используемые в настоящем описании относительно вакцины, означают, что вакцина предотвращает или уменьшает симптомы заболевания, вызванного организмом, из которого получен антиген (антигены), используемый в вакцине. Термины "защита" и "защитная" и т.п. также подразумевают, что вакцину можно использовать для "лечения" заболевания или одного из нескольких симптомов заболевания, которое у субъекта уже существует.

"Респираторное" введение относится к введению вещества, такого как вакцина, в организм субъекта через или посредством ингаляции распыленного (тонко измельченного) вещества. При ингаляционном введении первичный транспортный механизм включает абсорбцию распыленного вещества через слизистую оболочку трахеи, бронхов и легких и таким образом отличается от интраназального или перорального введения.

Термин "специфический для", используемый для описания антител настоящего изобретения, указывает, что вариабельные области антител настоящего изобретения распознают и связываются исключительно со специфическим штаммом H3N8 (то есть способны отличать специфический белок H3N8 от других известных белков на основании измеримых различий связывающей афинности, несмотря на существование ограниченной идентичности последовательностей, гомологии или подобия между белками H3N8 и такими полипептидами). Подразумевается, что специфические антитела также могут взаимодействовать с другими белками (или другими антителами с применением технологии твердофазного иммуноферментного анализа ELISA) посредством взаимодействий с последовательностями вне вариабельной области антител и, в частности, в постоянной области молекулы. Для определения специфичности связывания антитела настоящего изобретения известно скрининговое исследование, обычно применяемое в данной области. Для всестороннего рассмотрения таких исследований смотри 6 главу руководства Harlow et al. (Eds.), Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6. Антитела настоящего изобретения можно получать, используя любой способ, известный и обычно используемый в данной области.

"Субъединичная вакцина" относится к типу вакцины, которая включает один или несколько антигенов, но не все антигены, которые получены из патогена или гомологичны антигенам рассматриваемого патогена, такого как вирус, бактерия, паразит или гриб. Такая композиция по существу не содержит интактных патогенных клеток или патогенных частиц или лизат таких клеток или частиц. Таким образом, субъединичную вакцину можно получить из, по меньшей мере, частично очищенных или по существу очищенных иммуногенных полипептидов из патогена или его аналогов. Способы получения антигена или антигенов в субъединичной вакцине включают стандартные технологии очистки, рекомбинантного получения или химического синтеза. Таким образом, «субъединичная вакцина» относится к вакцине, состоящей из определенного антигенного компонента или компонентов полного вирусного, бактериального или другого иммуногена.

"Специфический иммуногенный фрагмент" означает часть последовательности, распознаваемой антителом, которое является специфическим для этой последовательности.

Термин "субъект" относится к любому животному, имеющему иммунную систему, которая включает млекопитающих, таких как собаки.

"TCID₅₀" обозначает "инфекционную дозу в тканевой культуре", и ее определяют как разведение вируса, которое необходимо для инфицирования 50% данной партии инокулированных клеточных культур. Для расчета TCID₅₀ можно использовать разные способы, включая способ Спермана-Карбера (Spearman-Karber), применяемый в настоящем описании. Для описания способа Спермана-Карбера смотри руководство B. W. Mahy & H. O. Kangro, Virology Methods Manual 25-46 (1996).

Термин "терапевтический агент" относится к любой молекуле, соединению, вирусу или способу лечения, предпочтительно к вирусу, аттенуированному или убитому, или к субъединице или соединению, которые способствуют лечению вирусной инфекции или заболевания, или состояния, вызванного таким образом.

"Терапевтически эффективное количество" в контексте настоящего раскрытия относится к количеству антигена или вакцины, которое будет вызывать иммунный ответ у субъекта (например, у собаки), получающего антиген или вакцину, которое является подходящим для предотвращения или улучшения признаков или симптомов заболевания, включающего побочные эффекты для здоровья или его осложнения, вызванного инфицированием патогеном, таким как вирус (например, H3N8), бактерия, паразит или гриб. Может быть индуцирован гуморальный иммунитет или клеточный иммунитет или как гуморальный, так и клеточный иммунитет. Можно оценивать иммунный ответ животного на вакцину, например, косвенно, посредством измерения титров антитела, тестами пролиферации лимфоцитов, или непосредственным контролем признаков и симптомов после заражения штаммом дикого типа. Защитный иммунитет, обеспечиваемый вакциной, можно оценивать путем измерения, например, по уменьшению клинических признаков, таких как смертность, заболеваемость, температурные показатели, общее физическое состояние и общее состояние здоровья и поведение субъекта. Количество вакцины, являющееся терапевтически эффективным, может варьировать в зависимости от конкретного используемого вируса или состояния прививаемого животного и может быть определено специалистом в данной области техники.

Термин "передаваемые" означает вирус, который способен к переносу от первого животного (собака) ко второму животному (собака), при этом вторая собака проявляет серологическую конверсию к переданному вирусу.

"Лечить" означает изменять, облегчать, тормозить развитие или предотвращать нарушения, состояния или заболевания, к которым относится указанный термин, или предотвращать один или больше симптомов такого нарушения, состояния или заболевания.

"Лечение" относится к осуществлению действия "лечить", определение, которое приведено непосредственно выше.

Термин "вакцина" относится к иммуногенной композиции, выбираемой из вируса, или модифицированной живой, аттенуированной или инактивированной вакцины, или субъединичной вакцины, или к любой комбинации из вышеупомянутого. Введение вакцины субъекту приводит к возникновению иммунного ответа. Вакцину можно вводить субъекту непосредственно любым известным путем введения, включающим парентеральный, пероральный и тому подобный путь.

ЧАСТЬ 1. АНТИГЕНЫ И ВИРУСНЫЕ ШТАММЫ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ, ПРОИЗВОДСТВО, СОСТАВЛЕНИЕ РЕЦЕПТУРЫ И ВВЕДЕНИЕ ВАКЦИН.

Один аспект настоящего изобретения обеспечивает вакцины, которые используют для вызова иммунного ответа следующие антигены.

Полезный антиген (антигены) настоящего изобретения. Антигены настоящего изобретения могут быть любым идентифицированным штаммом вируса гриппа, от любой птицы или млекопитающего, включающим без ограничения вирус гриппа, имеющий подтип H3 гемагглютинина, и подтип N8 нейраминидазы, или подтип H3N8, более общепринято называемый вирусом H3N8. Грипп может иметь любое происхождение от млекопитающих или птиц, включающее без ограничения свиное, конское или собачье происхождение. Конские и собачьи антигены гриппа являются предпочтительными. Используют штаммы, определяющие гликопротеины подтипа H3 или N8, и более предпочтительными являются штаммы, имеющие как H3, так и N8.

Штаммы и варианты и их мутанты и варианты также являются предпочтительными, как описано в руководстве Transmission of Equine Influenza to Dogs (P.C. Crawford et al, Science 310, 482- 485 (2005). Вирусный НА представляет собой критическую детерминанту специфичности вируса гриппа от видов хозяев.

Антигены гриппа настоящего изобретения могут быть выделены из собак, лошадей, свиней, и кур, как домашних, так и диких. У животных, выбранных для сбора образцов, должны проявляться острые и/или подострые клинические синдромы, которые могут включать респираторные симптомы от умеренных до тяжелых и лихорадку. Животные могут также проявлять симптомы анорексии и летаргии. Способы выделения вирусов известны специалистам в данной области техники: инокуляция клеточных культур млекопитающих или птиц, оплодотворенных яиц образцами слизи из носа или глотки от представителей с клиническими проявлениями, сбор мазков из носового прохода или зева или сбор тканей, таких как селезенка, легкие, миндалины и печень, и смывы из легких. Цитопатическое действие вируса можно наблюдать в клеточной культуре, и можно тестировать аллантоисную жидкость или клеточные лизаты на их способность агглютинировать эритроциты человека, петуха, индейки или морской свинки, что является предполагаемым свидетельством присутствия вируса гриппа.

Номенклатура вирусных штаммов и возможных антигенов. Тип штамма вируса гриппа подразделяют на подтипы на основе антигенных характеристик их гликопротеинов на поверхности вириона. Эти вирусные гликопротеины представляют собой гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NА). Обычно НА-подтип называют первым и NА-подтип называют вторым, таким образом, H3N8 относится к вирусу с подтипом 3 гемагглютинина и подтипом 8 нейраминидазы. Подтип определяют на основе серологического анализа НА и NА. Используя методики, раскрытые в настоящем изобретении, можно создать вакцину для любого из этих подтипов. В настоящее время имеется 16 идентифицированных подтипов НА и 9 идентифицированных подтипов NА. Их может быть больше среди диких подтипов, которые еще не были описаны. Конкретно, идентифицированные подтипы включают H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 и H16 и N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 и N9. Все из этих комбинаций подтипов и любые комбинации указанных и какого-либо подтипа и комбинации будущих подтипов, которые будут идентифицированы в будущем, используя описанные выше методики или по существу подобные методики, описаны в настоящем изобретении и заявлены в формуле изобретения в качестве полезных антигенов настоящего изобретения. Раскрыты все другие комбинации НА- и NА-подтипов. Они включают без ограничения предпочтительные подтипы H3N8 и H7N7.

Гемагглютинин (НА) вируса гриппа является гликопротеином на поверхности вириона, который присоединяет вирус к его рецепторам на клетках-хозяевах и растворяет вирусную оболочку с мембранами эндоцитозных пузырьков, чтобы инициировать инфекционный процесс. Он также является наиболее важным вирионным компонентом в индукции и образовании защитных антител. Аминокислотная последовательность НА и, следовательно, расположение ее сайтов N-гликозилирования определяется вирусным геномом.

Сегментированный, геном РНК-отрицательной цепи вируса гриппа реплицируется РНК-зависимой РНК-полимеразой, которая не имеет эффективной функции считывания, что приводит к высокой частоте ошибок транскрипции, которые могут привести к заменам аминокислот в поверхностных гликопротеинах НА и NA. Одним из последствий этой высокой частоты мутации является содержание в вирусных популяциях мутантов, которые отличаются от большинства по количеству и положению N-связанных гликанов на НА. Структуры этих олигосахаридов можно определить их положением на НА и размещением ферментов биосинтеза и расщепления, представленных в клетке-хозяине, в которой растет вирус. Таким образом, пластичность вирусного генома и хозяин-специфические механизмы гликозилирования вместе могут создать вирусные популяции, которые являются более гетерогенными по структуре и функции, чем разработанные только каком-либо одним способом. Считается, что это многообразие отвечает за выживание этих вирусов в ряде биологических ниш и за их способность преодолевать ингибирующее действие нейтрализующих антител и противовирусных средств. Были идентифицированы мутации вирусного генома различных штаммов, и эти мутированные штаммы также заявлены в формуле настоящего изобретения. Например, некоторые из этих мутантов описаны в руководстве Transmission of Equine Influenza to Dogs (P.C. Crawford et al., Science 310, 482-485 (2005), включенном в настоящее изобретение посредством ссылки.

В настоящем изобретении также раскрыта вакцина, созданная из специфичного штамма, собранного и идентифицированного как штамм конского гриппа A/Equine/2/Miami/l/63. Это штамм депонирован в Американской коллекции типовых культур, American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 под номером АТСС VR 317. Это штамм был первоначально выделен из мазков из носовой полости больной лошади в Майами в 1963 году. Вирус перевивали 5 раз на куриных эмбрионах. Вирус дополнительно классифицирован как H3N8.

Другим примером североамериканского вируса гриппа H3N8, полученного из лошади, является A/Equine/Kentucky/1998. Дополнительными примерами H3N8, полученного из лошади, является A/Equine/Kentucky/15/2002, A/Equine/Ohio/1/2003, A/Equine/Kentucky/1/1994, A/Equine/Massachusetts/213/2003, A/Equine/Wisconsin/2003 и A/Equine/New York/1999. Другими примерами является европейский вирус гриппа H3N8, полученный из A/Equine/Newmarket/A2/1993.

Настоящее изобретение также раскрывает вакцину, полученную из определенного штамма, собранного и идентифицированного как штамм собачьего гриппа A/canine/Iowa/13628/2005 и штамм A/canine/Iowa/9Al/B5/08/Dl2. Последний штамм, штамм A/canine/Iowa/9Al/B5/08/D12 был депонирован как UC 25509 29 июня 2006 года в Американской коллекции типовых культур 10801 PC33104A University Boulevard, Manassas, VA 20U0-2209, под инвентарным ATCC номером PTA 7694. Вирус дополнительно классифицирован как H3N8.

В дополнение к вышеупомянутым штаммам авторы раскрывают штамм, полученный следующим образом. Идентифицировали собаку или группу собак, проявляющих клинические признаки респираторного заболевания, получали образцы слизи изо рта или носа или образцы, полученные из ткани респираторных органов или тканей внутренних органов собак, проводили анализы образцов и идентифицировали присутствие вируса гриппа H3N8. Используя методики, описанные в настоящем изобретении, выделяли, очищали, культивировали, выращивали, получали, концентрировали этот вирусный антиген и идентифицировали его как вирус собачьего гриппа Pfizer. Его адаптировали и перевивали или в оплодотворенные яйца, или в клетки собак, или как в то, так и в другое, идентифицировали как исходный вакцинный вирус (Master Seed), вирус собачьего гриппа H3N8. Предпочтительным являлся вирус гриппа H3N8 собачьего происхождения. Также можно использовать вирус H3N8 конского или свиного происхождения, а также вирус гриппа подтипа H3 или N8. Авторы настоящего изобретения раскрывают штамм, полученный следующим образом. Собаку или группу собак инфицировали вирусом конского гриппа H3N8. От собак, проявляющих клинические признаки респираторного заболевания, получали образцы слизи изо рта или носа или образцы, полученные из тканей респираторных органов, смывы из легких или тканей внутренних органов собак, проводили анализы образцов и идентифицировали присутствие вируса гриппа H3N8. Используя методики, описанные в настоящем изобретении, выделяли, очищали, культивировали, выращивали, получали, концентрировали этот вирусный антиген и идентифицировали его как вирус собачьего гриппа. Его адаптировали и перевивали или в оплодотворенные яйца, или в клетки собак, или как в то, так и в другое, идентифицировали как исходный вакцинный вирус, вирус собачьего гриппа H3N8. Предпочтительным являлся вирус гриппа H3N8 собачьего происхождения. Также можно использовать вирус H3N8 конского или свиного происхождения, а также вирус гриппа подтипа H3 или N8. Вирус H3N8 свиного происхождения лечат тем же образом, как и вирус конского или собачьего происхождения, описание которых полностью приведено в настоящем изобретении.

ЧАСТЬ 2. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПОЛУЧЕНИЯ, ПРОИЗВОДСТВА, СОСТАВЛЕНИЯ РЕЦЕПТУР И ВВЕДЕНИЯ ВАКЦИН, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ АНТИГЕНОВ ЧАСТИ 1.

Часть 2a) Обсуждение . Вирусные антигены из части 1 можно превращать в рассматриваемые полезные композиции, содержащие вирусный антиген, модифицированный для уменьшения его вирулентности и созданный в виде полезной рецептуры или рецептуры вакцины. Далее приведено описание, обеспечивающее подробности для получения, производства, составления рецептуры и введения вакцин, полезных для профилактики или лечения клинических симптомов, связанных с инфекцией вирусом гриппа у собак, или для профилактики заболевания у собак, вызываемого вирусом собачьего или конского гриппа. Инфекция собачьего гриппа, которую нужно лечить, может быть вызвана вирусом конского гриппа, или она может представлять собой новый модифицированный вирус собачьего гриппа, происходящий из вируса конского гриппа. Действие способов лечения, описанных в настоящем изобретении, способно предотвратить смертность заболевших собак от вируса собачьего или конского гриппа.

В настоящем изобретении описаны способы и материалы для лечения и иммунизации вакциной животных и, конкретно, собак, против вирусов конского и собачьего гриппа. Способ включает введение собаке терапевтически эффективного количества первой, второй и или третьей вакцины, которая способна индуцировать иммунный ответ, и конкретно, введение собаке вакцины против вирусов гриппа H3N8. Вакцина настоящего изобретения обычно предназначена для профилактического лечения, при котором собак иммунизируют против заболевания, вызываемого вирулентными штаммами вируса конского или собачьего гриппа.

В настоящем изобретении авторы раскрывают вакцины, которые обеспечивают активный и/или пассивный иммунитет. Предполагается, что вакцина в целом, а также специфические иммуногенные фрагменты ее белков будут эффективны при применении в качестве терапевтического лечения против вирусов конского или собачьего гриппа. Таким образом, иммунитет, который обеспечивается согласно настоящему изобретению, может быть как активным, так и пассивным иммунитетом, и предполагаемое применение вакцины может быть как профилактическим, так и терапевтическим. В предпочтительном варианте осуществления вакцина дополнительно включает вакцину для иммунизации собаки против любой формы вируса собачьего или конского гриппа.

Часть 2b) Получение вакцины и концентрация антигена. Описанную в этой части вакцину можно получать путем выращивания выбранного вируса в клетках. Получение вируса предпочтительно осуществляют в культуре клеток млекопитающих, лошадей или собак. Рост или получение вируса (антигена) в яйцах также является предпочтительным. Предпочтительными являются клеточные линии почки собаки. Размножение вируса также можно достичь на любых пригодных средах и позволяющих это размножение на клеточных линиях, которые можно получать из клеточных линий птиц или млекопитающих, полученных из кошачьих, конских, бычьих или свиных клеточных линий. Перед инактивацией обычный уровень содержания вируса в вакцине находится в диапазоне от 10³ до 10⁹ TCID₅₀. Альтернативно, содержание антигена в вирусном препарате можно оценивать тестом гемагглютинирующего ингибирования (НI), простой радиальной диффузией или тестом гемагглютинации, и, применяя этот анализ, можно предпочесть вакцину с титром в диапазоне от 10 до 10000 единиц НА/мл, более общепринято в диапазоне от 100 до 2000 единиц НА/мл и часто в диапазоне от 100 до 1000 единиц НА/мл как количество на одну вводимую дозу.

Рост вирусов: клеточные линии и оплодотворенные яйца. Предпочтительной клеточной линией для размножения вируса гриппа являются клетки почки собак (DK). Можно применять другие клеточные линии, которые включают первичные и бессмертные линии клеток конской почки (EK), конской кожи (ED), свиных тестикул (ST), свиной почки (PK), бычьей почки (BK), кошачьей почки (FK), Vero, и первичные и иммортамуованные фибробласты куриных эмбрионов (CEF). Предпочтительная система клеточной культуры для выращивания вируса гриппа является традиционной адгезивной монослойной культурой. Альтернативно, также можно использовать суспензию и системы микроносителей клеточной культуры. Предпочтительным микроносителем является Cytodex 3 в виде шариков микроносителя (Amersham Biosciences Ltd.). Другие примеры микроносителей включают шарики, образованные стеклом, силиконом и декстраном, диэтиламиноэтилом DEAE, коллагеном, декстраном или желатином.

Предпочтительным сосудом для культивирования клеточных линий и размножения вируса гриппа является роллерный флакон, предпочтительная область поверхности роллерного флакона составляет 1760 см², но может варьировать от 490 до 4250 см². Альтернативно, другие полезные формы для клеточных культур включают флаконы (от 150 см до 420 см), пакетированные модули (от 21,000 см² до 340,000 см²) и резервуары с перемешиванием (от 1,0 л до 900 л). Предпочтительная множественность заражения (MOI) составляет от 0,001 до 0,1, но может варьировать от 0,0001 до 2,0. Предпочтительным периодом для сбора вируса из клеточной культуры являются дни от 2 до 5 после инфицирования, но он может варьировать от 1 дня до 7 дня после инфицирования.

Размножения вируса также можно достичь инокуляцией оплодотворенных яиц. Обычно для размножения вируса используют оплодотворенные яйца в возрасте от 0 до 12 дней. Предпочтительно для роста вирусов используют оплодотворенные яйца в возрасте 7-8 дней. Вирус инокулируют в амниотическую полость яйца. Вирус реплицируется в клетках амниотических мембран и в большом количестве высвобождается обратно в амниотическую жидкость. Вирус в амниотической жидкости можно собирать через 2-3 дня после инокуляции.

Культуральные клеточные среды: Предпочтительные рецептуры культуральных клеточных сред для размножения вируса гриппа включают без ограничения следующие среды: среда Игла, модифицированная по Дульбекко (DMEM), основные модифицированные среды Игла, среды Optimem и Лейбовиц-15 (L-15). Обычно к культуральной клеточной среде добавляют от 0,1 до 10 единиц трипсина. Альтернативно, для эффективного размножения вируса в клеточной культуре также можно использовать эквиваленты трипсина растительного происхождения (например, аккутазу Accutase) в пределах от 2 до 100 единиц. Культуральные клеточные среды можно использовать в отсутствие или присутствии компонентов животного происхождения. Примером дополнения компонентов животного происхождения является гамма-облученная сыворотка в конечной концентрации в пределах от 0,5 до 10%.

Часть 2c) Препарат вакцины: инактивированной, субъединичной и аттенуированной, живой-модифицированной.

Инактивированная. В одном варианте осуществления настоящего изобретения вакцина содержит инактивированную вирусную вакцину гриппа H3N8, содержащую штамм конского или собачьего гриппа H3N8, выбираемый из любого инфекционного штамма конского или собачьего гриппа. Смотри руководство Transmission of Equine Influenza to Dogs (P.C. Crawford et al., Science 310, 482-485 (2005). Вакцина может также состоять из гриппа H3N8, полученного из вируса свиного или любого гриппа подтипа H3 или N8. Инактивированную вакцину создают способами, известными в данной области. Например, после размножения вируса до высоких титров специалисту в данной области техники будет очевидно, что вирусную антигенную массу можно получать способами, известными в данной. Например, можно получать вирусную антигенную массу разведением, концентрацией или экстракцией. Все эти способы используют для получения подходящей вирусной антигенной массы для производства вакцины. Вирус можно инактивировать обработкой формалином (например, от 0,1 до 10%), бетапроприолактоном (BPL) (например, от 0,01 до 10%) или бинарным этиленимином (BEI) (например, от 1 до 10 мМ), который является предпочтительным в настоящем изобретении, или использованием других способов, известных специалистам в данной области. Предложены общепринято используемые условия и вещества, но для специалиста в данной области должны быть очевидными другие вещества и концентрации.

В дополнение к подробно описанному выше получению убитых вирусов, различные способы аттенуирования также являются возможными и известными, описаны в данной области и применимы в настоящем изобретении. Также возможно аттенуирование, приводящее к получению модифицированных живых вакцин. Некоторые из этих способов описаны в этом разделе и ниже. Наиболее предпочтительные виды аттенуирования представляют собой непрерывное пассирование в клеточной культуре, непрерывное пассирование у животных, разные способы создания генетических модификаций и ультрафиолетовый или химический мутагенез.

Субъединичные вакцины. Кроме того, субъединичные вакцины против конского или собачьего гриппа можно получать технологиями рекомбинантной экспрессии, которые включают без ограничения, гетерологичную прокариотическую экспрессию (например, E.coli, Pseudomonas, Salmonella и т.д.) и гетерологичную эукариотическую экспрессию (например, дрожжи [Pichia, Yarrowia], клетки насекомого [Baculovirus] и т.д.) и вирусные векторы (например, аденовирус собак, аденовирус человека, поксвирус, вирус собачьего герпеса).

Аттенуированная и живая модифицированная вакцина. Аттенуированную вакцину против вируса собачьего гриппа получают из вируса гриппа, выращенного в клеточной линии или культивированного в яйце, предпочтительно из происходящего из H3N8 вируса гриппа, который был аттенуирован последовательным пассированием, включающим последовательное пассирование при субоптимальных значениях температуры до состояния, когда он больше не способен вызывать заболевание, но все еще способен вызвать защитный иммунный ответ.

Аттенуирование вируса гриппа можно достичь последовательным пассированием штамма вируса гриппа дикого типа в клеточной культуре. Вирусный штамм можно пассировать в ряде клеточных систем, до тех пор, пока не потеряна его способность вызывать заболевание, при полном сохранении его иммуногенного свойства. После инокуляции в хозяина вирус до некоторой степени может быть способен к размножению. Подходящие аттенуированные вирусные штаммы также можно получать последовательным пассированием, чтобы получить сверхаттенуированный штамм. "Сверхаттенуирование" означает, что число пассирований для аттенуирования было существенно больше, чем обычно необходимо для устранения патогенности. Аттенуированный вирус сохраняет свою антигенность после этих многочисленных пассирований, например, сохраняя и свои антигены гемагглютинина и нейраминидазы, так, что не нарушается его способность к иммуногенности. Такие штаммы при введении фактически не вызывают возникновения симптомов или побочных эффектов и, таким образом, являются безопасными и эффективными вакцинами.

Аттенуирование вируса гриппа может быть достигнуто посредством адаптации к холоду штамма вируса гриппа. Адаптированные к холоду штаммы вирусов гриппа можно получать способами, которые включают пассирование вируса гриппа дикого типа с последующим отбором вируса, который растет при пониженной температуре. Адаптированные к холоду вирусы гриппа можно получать, например, последовательным пассированием вируса гриппа дикого типа в оплодотворенных куриных яйцах при постепенно снижающейся температуре, таким образом выбирая определенные экземпляры в смеси вирусов, которые устойчиво реплицируются при пониженной температуре. Адаптированный к холоду штамм вируса гриппа может показывать фенотип, чувствительный к температуре. Термочувствительный, адаптированный к холоду вирус гриппа реплицируется при пониженных температурах, но прекращает реплицироваться или образует пятна гемолиза в клетках тканевой культуры при определенных более высоких температурах выращивания, при которых вирус дикого типа будет реплицироваться и образовывать пятна гемолиза. Температура, при которой будет расти термочувствительный вирус, упоминается в настоящем изобретении как "пермиссивная" температура для этого термочувствительного вируса, и более высокая температура, при которой не будет расти термочувствительный вирус, но при которой будет расти соответствующий вирус дикого типа, упоминается в настоящем изобретении как "непермиссивная" температура для этого термочувствительного вируса. Например, некоторые термочувствительные адаптированные к холоду вирусы гриппа реплицируются в оплодотворенных куриных яйцах при температуре примерно 30°C или ниже и образуют пятна гемолиза в клетках тканевой культуры при разрешающей температуре примерно 34°C, но не будут образовывать пятна гемолиза в клетках тканевой культуры при неразрешающей температуре примерно 37°C. Некоторые адаптированные к холоду вирусы гриппа могут иметь доминантный интерферентный фенотип. Таким образом, в случае совместного инфицирования клеток другим вирусом гриппа они будут доминантными при инфицировании, таким образом нарушая рост упомянутого другого вируса. Адаптированный к холоду вирус гриппа также можно получать посредством рекомбинантных способов. При этом подходе идентифицируют одну или несколько специфических мутаций, связанных с идентифицированной адаптацией к холоду, аттенуированием, термочувствительностью или с доминантными интерферентными фенотипами, и внедряют ее обратно в штамм вируса гриппа дикого типа, используя обратный генетический подход. Обратная генетика подразумевает использование комплексов РНК-полимеразы, выделенных из клеток, зараженных вирусом гриппа, для транскрипции искусственных сегментов генома вируса гриппа, содержащих мутацию (мутации), включение синтезируемого сегмента (сегментов) РНК в вирусные частицы, используя вирус-хелпер, и затем отбор вирусов, содержащих желательные изменения.

Часть 2d) Вакцинные адъюванты, рецептуры, формы и носители. Компоненты вакцин, представленных в настоящем изобретении, предпочтительно будут включать один или несколько адъювантов. Адъюванты включают, среди прочего, адъювантную систему RIBI (Ribi Inc.), соли алюминия, включающие квасцы (от 0,5 до 20%, более предпочтительно меньше 10%, более предпочтительно 2 и 5%), фосфат алюминия (от 0,5 до 20%, более предпочтительно меньше 10%, более предпочтительно 2 и 5%), гидроокись алюминия (алгидрогель или регидрогель в диапазоне от 0,5 до 20%, более предпочтительное количество составляет менее 10%, более предпочтительно 2 и 5%), холестерин, эмульсии масло в воде, эмульсии вода в масле, такие, например, как полные и неполные адъюванты Фреинда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta GA), SAF-М (Chiron, Emeryville CA), адъювант АМФИГЕН®, сапонин и сапонины, такие как Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc, Cambridge МА), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc, Birmingem, AL) с предпочтительными концентрациями сапонина от 10 до 100 мкг при предпочтительном количестве примерно 50 мкг, или другие фракции сапонина, монофосфорил липид A, адъювант авридин липид амин, термолабильный энтеротоксин из E. coli (рекомбинантный или другой), холерный токсин или мурамилдипептид, но не ограничены вышеперечисленным. Иммуногенные композиции могут дополнительно включать одно или несколько других иммуномодулирующих веществ, например, таких как интерлeйкины, интерфероны или другие цитокины. Иммуногенные композиции могут также включать гентамицин и мертиолат.

Компоненты вакцин могут включать фармацевтически приемлемые наполнители, включающие носители, растворители и разбавители, изотонические вещества, буферные вещества, стабилизаторы, консерванты, иммуномодулирующие вещества (например, интерлeйкины, интерфероны и другие цитокины), сосудосуживающие вещества, антибактериальные вещества, противогрибковые вещества и тому подобное. Общепринятые носители, растворители и разбавители включают воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Примеры изотонических веществ включают хлористый натрий, декстрозу, маннит, сорбитол, лактозу и тому подобное. Полезные стабилизаторы включают желатин, альбумин и тому подобное.

Вакцины против вируса гриппа H3N8 обеспечиваются в разных формах, в зависимости от пути введения, требований к условиям хранения и тому подобного. Например, можно получать вакцины в виде водных растворов или дисперсий, подходящих для применения в шприцах, пипетках, распылителях и т.д., или их можно получать в виде лиофилизированных порошков, которые восстанавливают перед применением в физиологическом растворе, буфере HEPES, или в водной, иммуногенной фракции второй собачьей вакцины и тому подобном.

Рецептуру вакцины для любого из вариантов осуществления настоящего изобретения создают в фармацевтически приемлемом носителе в соответствии со способом введения при использовании. Специалист в данной области может легко создать рецептуру вакцины, которая содержит живой или убитый вирус конского или собачьего гриппа или его иммуногенный фрагмент, рекомбинантный вирус или бактериальный вектор, кодирующий вирус конского или собачьего гриппа, его специфический иммуногенный фрагмент, или молекулу ДНК, кодирующую вирус конского или собачьего гриппа или ее специфический иммуногенный фрагмент.

Если предпочтительной является внутримышечная инъекция, предпочтение отдается изотонической рецептуре. Обычно добавки для изотоничности могут включать хлористый натрий, декстрозу, маннит, сорбитол и лактозу. В конкретных случаях предпочтительными являются изотонические растворы, такие как буферный фосфатный солевой раствор. Рецептуры могут дополнительно обеспечивать стабилизаторы, такие как желатин и альбумин. В некоторых вариантах осуществления к рецептуре добавляют сосудосуживающее вещество. Фармацевтические препараты согласно настоящему изобретению обеспечиваются в стерильном и апирогенном виде. Вместе с тем, специалистам в данной области техники общеизвестно, что предпочтительные рецептуры фармацевтически приемлемого носителя, который содержится в вакцинах настоящего изобретения, представляют собой фармацевтические носители, которые одобрены нормативами, изданными Министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов Америки, или эквивалентным правительственным учреждением в зарубежных странах, таких как Канада или Мексика или любое из европейских государств, относительно любой собачьей вакцины, полипептида (антигена), субъединичной вакцины, рекомбинантных вирусных векторных вакцин и ДНК-вакцин. В этой связи фармацевтически приемлемый носитель для коммерческого производства вакцины настоящего изобретения представляет собой носитель, который уже одобрен или будет одобрен соответствующим правительственным учреждением в Соединенных Штатах Америки или в зарубежной стране. Вакцину можно дополнительно смешивать с адъювантом, являющимся фармацевтически приемлемым. В некоторых рецептурах вакцины настоящего изобретения объединяют упомянутую вакцину с другими собачьими вакцинами, чтобы получить продукт поливалентной вакцины, которая может защищать собаку против широкого ряда заболеваний, вызванных другими собачьими патогенами.

Композиции вакцины необязательно могут включать совместимые с вакциной фармацевтически приемлемые (то есть стерильные и нетоксичные) жидкие, полутвердые или твердые разбавители, которые служат фармацевтическими носителями, наполнителями или средами. Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические вещества могут включать среди прочего хлористый натрий, декстрозу, маннит, сорбитол и лактозу. Стабилизаторы включают среди прочего альбумин. Любой адъювант, известный в данной области техники, можно использовать в композиции вакцины, включая метаболизируемые и неметаболизируемые адъюванты, адъюванты на основе масел, такие как полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда, адъюванты на основе миколата (например, димиколат трегалозы), бактериальный липополисахарид (ЛПС), пептидогликаны (а именно муреины, мукопептиды или гликопротеины, такие как N-Opaca, мурамил-дипептид [МДП], или аналоги МДП), протеогликаны (например, экстрагированный из Klebsiella pneumoniae), стрептококковые препараты (например, OK432), Биостим™ (например, 01K2), "Iscoms" из патентов EP 109942, EP 180564 и EP 231039, гидроокись алюминия, сапонин, DEAE-декстран, нейтральные масла (такие как миглиол), растительные масла (такие как арахисовое масло), липосомы и полиолы Плуроник®.

Иммуногенные композиции настоящего изобретения можно получать в различных формах в зависимости от пути введения. Например, иммуногенные композиции можно получать в виде стерильных водных растворов или дисперсий, подходящих для инъекционного применения, или получать в лиофилизированном виде с использованием технологий сублимационной сушки. Лиофилизированные иммуногенные композиции обычно сохраняются при температуре примерно 4°C и могут восстанавливаться в стабилизирующем растворе, например, в физиологическом растворе или/и HEPES, с адъювантом или без него.

Дополнительно, иммуногенные и вакцинные композиции настоящего изобретения могут включать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Используемое в настоящем изобретении выражение "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизирующие вещества, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые вещества, изотонические вещества, вещества, замедляющие адсорбцию, и тому подобное. Носитель (носители) должен быть "приемлемым" в том смысле, что он является совместимым с компонентами настоящего изобретения и нетоксичным для субъекта, который будет иммунизирован. Обычно носители должны быть стерильными и апирогенными.

Часть 2e) Дозы вакцин и анализы. Размеры дозы вакцин против вируса гриппа H3N8 обычно варьируют по объему в диапазоне от примерно 2,0 до 0,1 мл в зависимости от пути введения. Инактивированные вакцины обычно имеют содержание вируса на уровне в диапазоне от 10³ до 10⁹ TCID₅₀, перед инактивацией. С другой стороны, содержание антигена в вирусном препарате будет предпочтительным с вакциной, имеющей титр в диапазоне от 10 до 10000 единиц НА/мл, оно может находиться в диапазоне от 100 до 2000 единиц НА/мл и более предпочтительно находится в диапазоне от 100 до 1000 единиц НА/мл как количество, вводимое в одной дозе. Для вакцин, содержащих модифицированные живые вирусы или аттенуированные вирусы, терапевтически эффективная доза обычно варьирует в диапазоне от примерно 10⁵ TCID₅₀ до примерно 10⁸ TCID₅₀ включительно. Для вакцин, содержащих субъединичные антигены, такие как белки гриппа H3 или N8, терапевтически эффективная доза обычно находится в диапазоне от примерно 10 мкг до примерно 100 мкг включительно. Количество и концентрации адъювантов и добавок, полезных в контексте настоящего изобретения, легко могут определить специалисты в данной области техники, но вместе с тем настоящее изобретение рассматривает композиции, содержащие от примерно 50 мкг до примерно 2000 мкг адъюванта и предпочтительно примерно 500 мкг/2 мл дозы композиции вакцины.

Анализы. Вирус гриппа можно выявлять выделением вируса или вирусным антигеном, вирусной РНК или применяя способы обнаружения специфическими антителами. Применяемые способы обнаружения вируса или вирусных компонентов включают иммунофлюоресценцию легочной ткани, эпителиальных клеток полости носа или содержимого бронхоальвеолярных смывов, иммуногистохимию образцов тканей, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), полимеразную цепную реакцию (ПЦР), клеточную культуру и иммунопероксидазную методику, флуоресцентное окрашивание антител для определения типа и подтипа вируса и быстрый иммуноферментный мембранный тест. Ткани, обычно исследуемые на вирус гриппа, включают легкие, смывы из легких, миндалины, трахею, селезенку, а также сыворотку. Также доступны моноклональные антитела, которые специфично направлены против ряда вирусных антигенных детерминант, а именно антигенные детерминанты гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NА). Наиболее общепринятым серологическим анализом для диагностики гриппа является тест ингибирования гемагглютинации (HI). Одним из его преимуществ является возможность различать разные подтипы и антигенные варианты в пределах подтипа. Тест HI можно проводить, используя сыворотки, полученные от лошади, собаки, свиньи или птицы. Более точным способом измерения антител является реакция простого радиального гемолиза (SRH). SRH представляет собой более чувствительный тест, чем HI, и имеет большую степень точности. Увеличение зональной области на 50% отображает повышение антител и свидетельствует о недавней инфекции.

Часть 2f) Выбор времени и пути введения. Вакцинацию собаки предпочтительно осуществляют собаке в возрасте 6 недель и более предпочтительно в возрасте 8 недель или старше. Собаки должны получить предпочтительно 2 дозы, каждую из которых обычно вводят с промежутком от 3 до 4 недель, предпочтительно 3 недели, путем подкожной инъекции (П/К) в зависимости от состояния собаки и окружающей ее обстановки. Это осуществляют для получения полного полиспецифического иммунного ответа. В другом варианте осуществления настоящего изобретения для получения полного полиспецифического иммунного ответа собаке проводят серию из 3 вакцинаций. Рекомендована ежегодная ревакцинация единичной дозой. Необязательно, собакам можно проводить бустер-иммунизацию в 3 и/или в 6 месяцев при необходимости. Предпочтительным путем является подкожная инъекция, при которой применяют примерно 1 мл, но также предпочтительными являются внутримышечный (В/М) с применением примерно 1 мл или внутрикожный (В/К) с применением от 0,1 до 0,3 мл, пероральный, ороназальный или назальный пути с применением от 0,2 до 0,5 мл. Другое время введения, место инъекции, применяемое количество и тип введения будут очевидны для рядового специалиста в данной области.

Путь введения при любом из вариантов осуществления вакцины настоящего изобретения включает без ограничения внутрикожный, внутримышечный, внутриглазной, внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный, ороназальный и подкожный пути, а также введение в виде ингаляции, суппозиториев или трансдермальный путь. Предпочтительные пути введения включают внутрикожную, внутримышечную, внутрибрюшинную, ороназальную и подкожную инъекции. Вакцину можно вводить любым способом, который включает без ограничения шприцы, распылители, мелкокапельное орошение, устройства для безыгольных инъекций или генную пушку, стреляющую микрочастицами (генная пушка Biolistic).

ЧАСТЬ 3. КОНКРЕТНЫЕ ОПИСАНИЯ ПОЛУЧЕНИЯ, ПРОИЗВОДСТВА, СОСТАВЛЕНИЯ РЕЦЕПТУРЫ И ВВЕДЕНИЯ ВЫБРАННЫХ ВАКЦИН.

В этой части авторы обеспечивают более подробные конкретные описания инактивированной одновалентной вакцины для лечения собачьего гриппа.

Часть 3a) Инактивированная одновалентная вакцина против вируса собачьего гриппа

Ее получают, используя любой из антигенов, описанных в части 1 выше, включающий предпочтительный антиген, происходящий от гриппа H3N8, полученный из вируса собачьего или конского гриппа, который включает инактивированную и адъювантную культуры вируса гриппа H3N8.

Инактивированная противовирусная двухвалентная собачья вакцина

Ее получают, используя любой из антигенов, описанных в части 1 выше, включающий предпочтительный антиген, происходящий от гриппа H3N8, полученный из вируса собачьего или конского гриппа, инактивированную и адъювантную культуры вируса гриппа H3N8. В ней собачий антиген получен из одного вируса собачьего гриппа, и конский антиген получен из одного вируса конского гриппа. Собачий антиген может также состоять из двух вирусов собачьего гриппа или двух вирусов конского гриппа.

Инактивированная противовирусная трехвалентная собачья вакцина

Ее получают, используя любой из антигенов, описанных в части 1 выше, но более предпочтительно антиген, происходящий от гриппа H3N8, полученный из вируса собачьего или конского гриппа, инактивированную и адъювантную культуры вируса гриппа H3N8. Описаны следующие трехвалентные вакцины: a) собачий антиген получен из одного вируса собачьего гриппа, и конский антиген получен из двух вирусов конского гриппа, b) собачий антиген получен из двух вирусов собачьего гриппа, и конский антиген получен из одного вируса конского гриппа, c) собачий антиген получен из трех вирусов собачьего гриппа и/или конский антиген получен из трех вирусов конского гриппа. Описана любая комбинация из вышеупомянутых антигенов для получения трехвалентной вакцины.

Часть 3b) Получение инактивированной вакцины и концентрация антигена.

Вакцину, описанную в этой части, можно получать выращиванием выбранного вируса в клетках.

Получение вируса предпочтительно осуществляют в клеточной культуре млекопитающих - лошадей или собак, также предпочтительным является выращивание или продукция вируса (антигена) в яйцах. Наиболее предпочтительными являются клеточные линии почки собаки. Размножения вируса также можно достичь на любых полезных средах, включающих позволяющие такое размножение клеточные линии, которые могут иметь происхождение из кошачьих, конских, бычьих, птичьих или свиных клеточных линий. Перед инактивацией уровень содержания вируса в вакцине должен находиться в диапазоне от 10⁵ до 10⁸ TCID₅₀. Альтернативно, вирусный препарат можно оценивать тестом ингибирования гемагглютинации (HI) или тестом гемагглютинации. Используя этот тест, предпочтение будет отдано вакцине с титром в диапазоне от 10 до 10000 НА единиц/мл, более общепринято в диапазоне от 100 до 2000 НА единиц/мл и часто в диапазоне от 100 до 1000 НА единиц/мл как вводимое количество.

Рост инактивированных вирусов: клеточные линии и оплодотворенные яйца. Предпочтительная система клеточной культуры для выращивания вируса гриппа представляет собой традиционную адгезивную монослойную культуру. Альтернативно, также можно использовать суспензию и системы микроносителя клеточной культуры. Предпочтительным микроносителем является Cytodex 3 в виде шариков микроносителя (Amersham Biosciences Ltd.). Предпочтительным сосудом для культивирования клеточных линий и размножения вируса гриппа является форма роллерного флакона, предпочтительная область поверхности роллерного флакона составляет 1760 см, но может варьировать от 850 до 4250 см². Предпочтительная множественность заражения (MOI) составляет от 0,001 до 0,1, но может варьировать от 0,0001 до 2,0. Предпочтительным периодом для сбора вируса из клеточной культуры являются дни от 2 до 5 после инфицирования, но он может варьировать от 1 дня до 7 дня после инфицирования.

Культуральные клеточные среды: Предпочтительные рецептуры культуральной клеточной среды для размножения вируса гриппа включают без ограничения следующие среды: среда Игла, модифицированная по Дульбекко (DMEM), основные модифицированные среды Игла, среды Optimem и Лейбовиц-15 (L-15). Обычно к культуральным клеточным средам добавляют от 0,1 до 10 единиц трипсина.

Часть 3c) Инактивированная инактивация. После производства вирус может быть убит или инактивирован любым способом, обычно используемым в данной области. В более предпочтительном способе вирусные жидкости будут инактивированы бинарным этиленимином BEI, описанным ниже. Также полезной будет инактивация жидкости, содержащей вирус, формалином или бетапроприлактоном (BPL).

Часть 3d) Адъюванты, рецептуры, формы и носители инактивированных вакцин. Можно создавать рецептуру антигенов, описанных в части 1, в частности, инактивированных или убитых вирусов, несколькими способами получения полезной вакцины. В предпочтительной рецептуре необходимо объединить инактивированную вакцину с адъювантом. С вакцинами настоящего изобретения можно использовать многочисленные адъюванты, отмечая при этом некоторые предпочтительные адъюванты. В 1 мл дозы содержание адъювантов обычно составляет от примерно 25 мкг до примерно 1000 мкг включительно. Особенно полезными адъювантами для вакцины против собачьего гриппа являются следующие адъюванты, которые также можно использовать в комбинациях, отмечая предпочтительные комбинации: соли алюминия, включающие квасцы (от 0,5 до 20%, более предпочтительно меньше 10%, более предпочтительно 2 и 5%), фосфат алюминия (от 0,5 до 20%, более предпочтительно меньше 10%, более предпочтительно 2 и 5%), гидроокись алюминия (алгидрогель или регидрогель в диапазоне от 0,5 до 20%, более предпочтительное количество составляет менее 10%, более предпочтительно 2 и 5%), адъювант АМФИГЕН®, сапонины (предпочтительными являются Quil A или QS-21 или QA-21 в диапазоне от 1 до 100 мкг (Cambridge Biotech Inc, Cambridge МА)), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc, Birmingem, AL) с предпочтительными концентрациями сапонина от 10 до 100 мкг при предпочтительном количестве примерно 50 мкг, холестерин или другие синтетические полимеры, декстран DEAE, сквален и т.д.

Предпочтительными адъювантами и комбинациями являются: 2, 3, 4 или 5% квасцы, любая комбинация квасцов с QuilA, холестерином, использование любого известного коммерческого адъюванта и рецептуры вакцины. В особенности предпочтительным являются 2-5% квасцы единственные, Quil А единственный и Quil A вместе с холестерином, известные как "QAC". QAC можно применять единственным или в комбинации с дополнительным Quil A и холестерином. Также можно использовать другие известные адъюванты. Можно подбирать другие компоненты вакцин для модификации физических и химических свойств вакцин. Например, в 1 мл дозы содержание адъювантов обычно составляет от примерно 25 мкг до примерно 1000 мкг включительно. Аналогично вакцину, описанную в настоящем изобретении, можно объединять с антибиотиками, содержание которых в 1 мл дозы может составлять от примерно 1 мкг до примерно 60 мкг включительно. Возможно включение других компонентов.

Часть 3e) Дозы и анализы инактивированных вакцин. Размеры дозы вакцин против вируса гриппа H3N8 обычно располагаются от примерно 2,0 до 0,1 мл в зависимости от пути введения. Для вакцин, содержащих модифицированные живые вирусы или аттенуированные вирусы, терапевтически эффективная доза обычно будет варьировать от примерно 10⁵ TCID₅₀ до примерно 10⁸ TCID₅₀ включительно. Для вакцин, содержащих субъединичные антигены, такие как белки вируса гриппа H3 или N8, терапевтически эффективная доза обычно находится в диапазоне от примерно 10 мкг до примерно 100 мкг включительно. Для вакцин, содержащих инактивированный вирус гриппа, перед инактивацией вакцины уровень содержания вируса должен составлять от 10³ до 10⁹ TCID₅₀. Предпочтительно вводимое в одной дозе количество вакцины будет составлять от 100 до 1000 единиц НА/мл. Наиболее предпочтительным является количество примерно 640 НА на одну дозу.

Часть 3f) Время и путь введения инактивированной вакцины. Для выбора времени вакцинации смотри часть 2f. Предпочтительным путем является подкожная инъекция (П/К), при которой применяют примерно 1 мл, но также предпочтительными являются внутримышечный (В/М) с применением примерно 1 мл или внутрикожный (В/К) с применением от 0,1 до 0,3 мл, пероральный, ороназальный или назальный пути с применением от 0,2 до 0,5 мл.

ЧАСТЬ 4. КОМБИНАЦИЯ ВАКЦИН

Антигены и вакцины настоящего изобретения можно объединять с другими продуктами или вакцинами. Например, их можно объединять как в жидкой, так и в высушенной фракции с линией для собак Canine Vanguard® компании Pfizer, которая включает много продуктов, и/или с линией для собак Canine Vanguard Plus® компании Pfizer, которая также включает в себя много продуктов, включающих Vanguard Plus CCV/L4® и другие комбинации, предлагающих полную защиту против основных болезней щенков. Антиген вируса конского или собачьего гриппа можно объединять в любых разных комбинациях со следующими собачьими антигенами: с антигеном парагриппа собак (CPIV), вируса собачьей чумы (CDV), парвовируса собак (CPV), аденовируса-1 собак (CAV-1), аденовируса-2 собак (CAV-2), Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira bratislava, респираторного коронавируса собак (CRCV), кишечного коронавируса собак (CCV), бычьего коронавируса (BCV) и с антигеном Bordetella bronchiseptica.

Дополнительно, антигены вируса конского или собачьего гриппа и вакцины настоящего изобретения можно объединять с вакцинами против Bordetella bronchiseptica (p68 или Bronchicine® или Canvac CCi®), и/или парагриппа собак (CPIV), и/или респираторного коронавируса собак (CRCV), и/или бычьего коронавируса (BCV), чтобы обеспечить предварительную вакцину для защиты против распространенных возбудителей питомникового кашля. Начальная доза комбинированной вакцины будет составлять 2 дозы по 1 мл через 3 недели, единственную бустер-иммунизацию в дозе 1 мл можно давать перед последующими вакцинациями.

ЧАСТЬ 5. КОНКРЕТНЫЕ ПРИМЕРЫ ВАКЦИН

Следующие вакцины обеспечиваются в конкретном плане.

Примеры 1-3. Выращивание в клетках млекопитающих.

Вирус H3N8 Pfizer клеточного происхождения (A/Equine/2/Miami/l/1963) в a) 2 или 5% квасцах или b) в QAC.

Примеры 4-6. Выращивание в клетках млекопитающих.

Клинически выделенный вирус собак H3N8 Pfizer клеточного происхождения A/Canine/Iowa/9A1/B5/D8/D12 в a) 2 или 5% квасцах или b) в QAC.

Примеры 7-9. Выращивание в птичьих яйцах.

Конский вирус H3N8 Pfizer, получаемый в яйце в a) 2 или 5% квасцах или b) в QAC.

Примеры 10-11. Выращивание в птичьих яйцах.

Клинически выделенный собачий вирус H3N8 Pfizer, получаемый в яйце в a) 2 или 5% квасцах или b) в QAC.

ЧАСТЬ 6. КОНКРЕТНЫЕ ПРИМЕРЫ МЕТОДИК ТЕСТИРОВАНИЯ ВАКЦИН

Вакцины настоящего изобретения можно оценивать и давать подтверждения, используя следующее:

Собакам пород, являющихся целью исследования, в возрасте 6 недель или старше вводили вакцины, описанные в настоящем изобретении. Собак разделяли на группы вакцинации, используя от 5 до 20 собак на группу. Вакцину вводили в две дозы по 1 мл или в две дозы по 0,5 мл с промежутком 3 недели путем подкожной или внутримышечной инъекции. Контрольным собакам давали вакцину плацебо. Образцы сыворотки собирали от каждой собаки в дни первой и второй вакцинации, затем дважды в неделю после второй вакцинации, а также после заражения. Сыворотку от привитых собак тестировали на сероконверсию к антигену вакцины посредством HI (ингибирование гемагглютинации) или SRH (простой реакцией радиального гемолиза). Собак заражали вирусом H3N8 в виде аэрозоля или капель интраназальным или пероральным путем (который может включать интратрахеальный) на 14 день или 28 день после второй вакцинации. Собак наблюдали после заражения по клиническим признакам заболевания, осуществляя контроль клинических признаков, таких как респираторные симптомы, лихорадка, анорексия, летаргия. Пробу назального секрета собирали тампоном из носа вакцинированных собак и невакцинированных контрольных собак постоянно, на каждый второй день после заражения, в течение 10-14 дней, чтобы измерить выделение заражающего вируса. Присутствие выделяемого вируса подтверждали культивированием клеток тканей (предпочтительно почка собаки). У подгруппы собак после заражения забирали пробы тканей, включающие трахею, миндалину, легкие. Присутствие вируса в образцах тканей собак подтверждали, как описано выше или иммуногистохимическим анализом. При сравнении выделения заражающего вируса и вируса в образцах тканей у собак, привитых эффективной вакциной, будет наблюдаться более низкая вирусная нагрузка или уменьшенное количество вируса по сравнению с невакцинированными контрольными собаками. Результатом эффективной вакцины будет более низкая вирусная нагрузка или уменьшенное количество вируса у вакцинированных животных, и по сравнению с невакцинированными контрольными животными вакцинированные животные будут показывать сокращение клинических признаков, связанных с гриппозной инфекцией.

Конкретные примеры

Заражение и оценка исследования эффективности вакцин против собачьего гриппа у собак. Оценка вакцины против конского гриппа, с убитым вирусом для обеспечения перекрестной защиты у собак против вируса гриппа.

Для оценки серологической защиты против вирусов конского гриппа использовали вакцины, содержащие A/Equine/2/Miami/1/63 и A/Equine/Ohio/1/2003, собак в возрасте от 7 до 10 недель выделяли в одну из девяти групп лечения (Таблица 1). Собак вакцинировали в дозе 1,0 мл путем подкожной инъекции в 0 и 21 дни исследования. Кровь для сыворотки собирали у всех собак, включенных в исследование в 0 день исследования (первая вакцинация), 21 день (вторая вакцинация) и 35 день (14 дней после второй вакцинации). Все образцы сыворотки оценивали на ингибирование гемагглютинации HAI к вирусам Miami63, Оhiо03 и CIV. Данные серологического ответа представлены в таблице 2. Статистически существенные различия в серологических титрах по сравнению с невакцинированными животными были показаны на 35 день исследования в следующих группах IVP (инфицированных вирусом гриппа): ТO2, ТО3, ТO4, ТО6, Т07, Т08 и Т09 (Таблица 2). Дополнительно статистически существенные различия наблюдали на 21 день исследования для следующих групп IVP: ТО6, ТO7, ТO8 и ТО9 (Таблица 2).

Предварительный анализ безопасности

В настоящем исследовании в дополнение к измерению серологического ответа осуществляли оценку предварительной безопасности вакцины. В целом не наблюдали каких-либо клинически важных реакций, связанных с вакциной, в любой из оцениваемых групп IVP. В ходе исследования не выявлено каких-либо связанных с вакциной системных реакций. Дополнительно, ни в одной из групп лечения не наблюдали какой-либо припухлости места инъекции после первой вакцинации. На 21 день (перед второй вакцинацией) была выявлена небольшая припухлость при пальпации места инъекции у 34 животных из пяти групп лечения. В четырех из этих групп (Т02, Т03, Т06 и Т07) адъювантом были 2% квасцы, тогда как в пятой группе лечения (Т09) был другой адъювант, Quil-A/Cholesterol/Plus. Значение среднего геометрического объема припухлости на этот 21 день варьировало от 0,07 до 0,24 см³ в ходе лечения.

После второй вакцинации на 22-24 дни исследования припухлость места инъекции выявлена у 58 из 87 животных. Эти припухлости достигали максимального объема через 24 часа после вакцинации (на 22 день) и уменьшались в размере до рассасывания к 24 дню исследования. Ни одна из припухлостей места инъекции не была болезненной или горячей при касании, тогда как у пяти мест инъекции была выявлена плотность до отвердения.

Оценка вакцины против конского гриппа, с убитым вирусом, для обеспечения перекрестной защиты собак против заражения вирусом гриппа

Шесть из девяти групп лечения заражали CTV: T01, T02, T03, T06, T07 и T09. Проводили исследование в день 0, в день заражения животных, через 6 недель после второй вакцинации с ГА в соотношении примерно 1:8 на 50 мл, что составляло примерно 6,9 log на 1 мл CIV. Собак заражали интратрахеально по методике, сходной с моделью заражения свиньи гриппозным вирусом респираторного заболевания. Ежедневно у всех животных наблюдали клинические признаки, связанные с респираторным заболеванием: носовые выделения, выделения из глаз, чихание, рвота, анорексия, депрессия или кашель. Дополнительно ежедневно фиксировали значения тимпанической температуры и собирали мазки из носовой полости/зева на выделение вируса.

Данные клинических наблюдений фиксировали и отслеживали ежедневно до тех пор, пока клинические симптомы респираторного заболевания проявлялись примерно у 50% зараженных животных. Через пять дней после заражения у 31 из 59 зараженных животных проявлялись один или больше следующих клинических признаков: носовые выделения, выделения из глаз и/или кашель. Поэтому на 5 день исследования все животные были подвергнуты эвтаназии и проведено вскрытие трупов. Было зарегистрировано множество очагов консолидации в легких и собраны образцы на выделение вируса.

Процент консолидации в легких показал, что при этом заражении было достигнуто успешное проявление респираторного заболевания. Среди всего количества животных процент консолидации варьировал от 60% у 9 животных до 10% консолидации у восьми животных, у 26 животных выявлено 10% консолидации, и 16 животных не проявляли признаков консолидации (фигура 2). Число животных с консолидацией в легких по группам лечения представлены в Таблице 4. Числовые различия наблюдались между группами лечения и отрицательным контролем, но вместе с тем не были обнаружены статистически существенные различия по консолидации легких, выделению вируса из тканей легких и миндалин (Таблица 5). По результатам из проб смывов из легких статистически существенные различия (Р<=0,05) были обнаружены в выделении вируса между группами отрицательного контроля и Т02, Т07 и ТO9 (Таблица 6).

Таблица 1
Исследование сероконверсии у собак по группам лечения
Группа	IVP
Т01	Физиологический раствор - отрицательный контроль
Т02	Miami 63 - доза 320 ИГА - 2% квасцов
Т03	Miami 63 - доза 640 ИГА - 2% квасцов
Т04	Miami 63 - доза 320 ИГА - Quil-A/холестерин
Т05	Miami 63 - доза 640 ИГА - Quil-A/холестерин
Т06	Ohio 03 - доза 320 ИГА - 2% квасцов
Т07	Ohio 03 - доза 640 ИГА - 2% квасцов
Т08	Ohio 03 - доза 640 ИГА - Quil-A/холестерин
Т09	Ohio 03 - доза 640 ИГА - Quil-A/холестерин/плюс другие адъюванты

Таблица 4
Число животных с положительными показателями очагов консолидации в легких на группу лечения
IVP	ТО01	ТО02	ТO03	ТО06	ТО07	ТО09
Количество положительных случаев	8	5	9	7	5	9
Количество отрицательных случаев	2	4	1	3	5	1

Таблица 5
Выделение вируса из образцов легких и миндалины по группам лечения
IVP	Выделение вируса: да/нет
	Легкие	Миндалины
	нет	да	нет	да
№	%	№	%	№	%	№	%
Т01	7	70,0	3	30,0	9	90,0	1	10,0
Т02	8	88,9	1	11,1	9	100,0	0	0
Т03	10	100,0	0	0	10	100	0	0
Т06	9	90,0	1	10,0	9	90,0	1	10,0
Т07	10	100,0	0	0	10	100,0	0	0
Т09	10	100,0	0	0	10	100,0	0	0

Таблица 6
Выделение вируса из образцов смывов из легких по группам лечения
	Выделение вируса: да/нет
нет	да
IVP	количество	процент	количество	процент
Т01	2	20,0	8	80,0
Т02	7	77,8	2	22,2*
Т03	5	50,0	5	50,0
Т06	7	70,0	3	30,0*
Т07	10	100,0	0	0*
Т09	10	100,0	0	0*
* Указывает на статистически существенное различие (р≤0,05) между группой лечения и Т01

ВЫВОДЫ ИЗ КОНКРЕТНЫХ ОПИСАНИЙ

Необходимо отметить, что согласно использованию в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного и множественного числа могут относиться к одному субъекту или к нескольким субъектам, если по контексту явно не указано иначе. Таким образом, например, ссылка на композицию, содержащую "соединение", может включать единственное соединение или два или больше соединений.

Подразумевается, что вышеупомянутое описание предназначено только для иллюстрации и не ограничивает объем настоящего изобретения. Многие варианты осуществления будут очевидны специалисту в данной области после изучения вышеупомянутого описания. Поэтому объем изобретения необходимо определять согласно прилагаемой формуле изобретения, наряду с полным объемом эквивалентных изобретений, на которые имеют право такие формулы изобретения. Раскрытия всех статей и ссылок, включая патенты, патентные заявки и публикации, включены в настоящее изобретение со ссылкой во всей их полноте и для всех задач.

Все композиции и/или способы, раскрытые и заявленные в формуле настоящего изобретения, можно создавать и осуществлять без чрезмерного экспериментирования в свете настоящего раскрытия. Поскольку композиции и способы настоящего изобретения были описаны в плане предпочтительных вариантов осуществления, для специалистов в данной области будет очевидно, что могут быть применены изменения в композициях и/или способах и в этапах или в последовательности этапов способа, описанного в настоящем изобретении, не отступая от понятия, идеи и области настоящего изобретения. В частности, будет очевидно, что определенные вещества, являющиеся и химически и физиологически родственными, можно заменять на вещества, описанные в настоящем изобретении, при достижении в этом случае тех же самых или подобных результатов. Считается, что все такие подобные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области, находятся в пределах идеи, области и концепции настоящего изобретения, что определено согласно прилагаемой формуле изобретения.

1. Способ иммунизации собаки против вируса гриппа, включающий введение указанной собаке терапевтически эффективного количества вакцины, содержащей по меньшей мере один аттенюированный или инактивированный вирус гриппа H3N8, где указанный вирус выделен из собаки.

2. Способ по п.1, в котором количество указанного вируса составляет от 10 до 10000 единиц ГА.

3. Способ по п.1, в котором количество указанного вируса составляет от 100 до 1000 единиц ГА.

4. Способ по пп.1-3, в котором указанный вирус является инактивированным.

5. Способ по пп.1-3, в котором указанная вакцина дополнительно содержит адъювант, где адъювант может быть выбран из а) метаболизируемого адъюванта, b) неметаболизируемого адъюванта, с) 2% квасцов, d) 5% квасцов, е) Quil А, и f) холестерина или любой их комбинации.

6. Способ по любому из пп.1-3, где указанный вирус гриппа является аттенюированным.

7. Способ по любому из пп.1-3, в котором вакцину получают способом, включающим стадии
(а) размножения вируса гриппа H3N8;
(b) аттенюирования или инактивирования указанного вируса гриппа;
(c) комбинирования указанного аттенюированного или инактивированного
вируса гриппа с фармацевтически приемлемым наполнителем.

8. Способ по п.7, дополнительно включающий стадию добавления адьюванта к лекарственному средству, где адьювант выбран из
а) метаболизируемого адьюванта, b) неметаболизируемого адьюванта, с) 2% квасцов, d) 5% квасцов, е) Quil А, и f) холестерина или любой их комбинации.

9. Способ получения вакцины против вируса гриппа собак путем приготовления композиции, содержащей терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одного аттенуированного или инактивированного вируса гриппа H3N8, где указанный вирус выделен из собаки.

10. Способ по п.9, в котором количество указанного вируса составляет от
10 до 10000 единиц ГА.

11. Способ по п.9, в котором количество указанного вируса составляет от 10 до 1000 единиц ГА.

12. Применение вакцины, полученной способом по пп.9-11, для иммунизации собак против вируса гриппа.