Способ выделения олигонуклеотидов

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 15.03.67 (21) 1225057/28 — 13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет (43) Опубликовано 05.12.76. Бюллетень ¹ 45 (45) Дата опубликования описания25.02.77

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения В. Д. Аксельрод, А, А. Баев, М. А. Гайлум и И. Я. Лидака (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

Известен способ выделения олигонуклеотидов из рибонуклеазного гидролизата PHK путем его двухступенчатого сорбирования на колонках с анионитом, элюирования на первой ступени солевым раствором, а на второй — муравьиной кислотой и формиатом аммония с последующим концентрированием одним из известных способов, например лио филизацией.

Цель изобретения — упростить способ, повысить чистоту и выход олигонуклеотидов. Достигается это тем, что по предложенному способу первую ступень элюирования осуществляют при повышенной температуре, преимущественно 50 — 90 С. Сорбцию на первой ступени проводят на анионите Эктеол — целлюлозе, а на второй — на А — 17. Элюцию на первой ступени осуществляют ступенчато водносолевым раствором, Способ выделения олигонуклеотидов заключается в следующем.

Рибонуклеазный гидролизат РНК, содержащий смесь моно — и олигонуклеотидов, сорбируют на анионите, например Эктеол-целлюлозе, и элюируют водным солевым раствором при повышенной температуре, преимущественно, 50 — 90 С.

Полученные фракции вновь сорбируют на анионите, например А — 17 или Дауэкс-1, и элюируют олигонуклеотиды муравьиной кислотой и смесью ее с формиатом аммония.

Выделение мононуклеотидов проводят аналогично, но элюцию на второй ступени проводят одним из известных способов, например уксусной кислотой. Полученные фракции чистых мононуклеотидов концентрируют упариванием в вакууме, а олигонуклеотидов — лиофилизацией. Готов ые продукты являются гомогенными хроматографическими веществами.

Пример. 10г PHK растворяютв 500мл

0,02 м трис — ацетатного буфера (рН вЂ” 7,0 — 7,5 ) .

К полученному раствору добавляют 10 мл ри15 бонуклеозы, 1 мл хлороформа и инкубируют в течение 24часпри 37 С.

По окончании гидролиза рибонуклеазу удаляют путем обработки гидролизата КМ вЂ” целлюлозой и сорбируют на колонке с Эктеол — целлюлозой

20 (0,4 — 0,7 мгэкв/г), снабженной рубашкой для обогрева.

Сорбцию проводят из расчета 10 г исходной

PHK на 3,0 л анионита (во влажном виде) .

Элюируют при 60 С ступенчато: вначале водой, 25 а затем раствором ацетата аммония (PH 7,0 — 7 5) 243623

Составитель Т. Полянская

ТехРед 3. фанта Корректор Б.10гас

Редактор Н. Коган

Заказ 5748/272

Тираж 575 По дни сно е

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Э последовательно концентрациями 0,04; 0,08; 0,12 и

0,17 М со скоростью 60 мл см /час. Полученные фракции моно —, ди —, тринуклеотидов вновь сорбируют на колонках с анионитом А — 17 (200 — 400 меш), элюируют кипяченой дистиллированной водой в количестве, равном тройному объему колонки.

Мононуклеотиды элюируют ступенчато: 0,8 М уксусной кислотой — 3 — цитидиловую, 6М уксус1 ной кислотой — 31 — уридиловую кислоту.

Динуклеотиды элюируют в линейном градиенте муравьиной кислоты от 0 до 6 М или ступенчато в этом же интервале.

Тринуклеотиды элюируют аналогично динуклеотидам и дополнительно 0,8 М раствором формиата 15 аммония в 4 Ы муравьиной кислоте. Элюцию проводят со скоростью 18 — 20 мл см /час. г

Мононуклеотиды упаривают в вакууме при температуре 30 — 40" С, а олигонуклеотиды лиофилизируют. 20

В случае необходимости олигонуклеотиды переводят в натриевые и другие соли нейтрализацией щелочью до рН 7,0 — 7,5 и лиофилизируют.

Фракции высших олигонуклеотидов элюируют

2 М ацетатом аммония, упаривают и гидролизуют Я щелочью или фосфодиэстеразой и выделяют хроматографией уксусной кислотой на анионите А — 17.

Формула изобретения

1. Способ выделения олигонуклеотидов из рибонуклеазного гидролизата PHK путем его двухступенчатой сорбции на колонках с анионитом, элюирования на первой ступени солевым раствором, а на второй — муравьиной кислотой и формиатом аммония с последующим концентрированием одним из известных способов, например лиофилизацией, о т— лича ющийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения чистоты и выхода олигонуклеотидов, первую ступень элюирования осуществляют при повышенной температуре, преимущественно равной 50 — 90 С.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сорбцию на первой ступени осуществляют на анионите Эктеол — целлюлозе, а на второй — на А — 17.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что элюцию на первой ступени проводят ступенчато водносолевым раствором.