Способ определения устойчивости генома

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к цитологии и генетике человека. Сущность заявляемого способа заключается в том, что для оценки уровня жизнеспособности особи учитывается соотношение показателей стабильности генома и активности ЯОР хромосом в клетках. Для их оценки из локтевой вены обследуемого берется кровь для культивирования лимфоцитов, готовятся препараты метафазных хромосом с последующим изучением активности ЯОР хромосом и определяется уровень хромосомных аберраций в клетках с последующим расчетом коэффициента устойчивости генома. Использование способа позволяет повысить точность определения уровня устойчивости генома человека к внешней среде, оценивая, тем самым, его жизнеспособность.

 

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к цитологии и генетике человека, и может быть использовано для точного определения уровня устойчивости генома особи.

В качестве ближайших аналогов заявленного способа можно считать (Амелина И.В. Активность ядрышкообразующих районов хромосом в популяции жителей города Курска, автореф. дисс. канд. биол. наук, г.Саранск, 2006), (А.А.Прокофьева-Бельговская, Н.П.Бочков, К.Н.Гринбер и др. Основы цитогенетики человека. М., Медицина. 1969. - 544 с.).

Отличием заявленного изобретения от известного заключается в том, что одновременно определяют некоторые показатели генетической стабильности хромосом и соотношение показателей активности ядрышкообразующих районов хромосом (ЯОР), где кодируется наследственная информация рибосомных белков, определяющая интенсивность синтеза белка на рибосомах, в т.ч. ферментов репарации ДНК - 10AgЯOP, D ЯОР/10 AgЯOP, G ЯОР/10 AgЯOP с последующим вычислением коэффициента устойчивости генома (КУГ) по формуле.

Техническим результатом является определение уровня устойчивости генома при помощи показателей активности ядрышкообразующих районов хромосом и их стабильности.

Целью изобретения является повышение точности определения уровня устойчивости генома человека к внешней среде, оценивая, тем самым, его жизнеспособность.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для оценки уровня жизнеспособности особи учитывается соотношение показателей стабильности генома и активности ЯОР хромосом в клетках. Для их оценки из локтевой вены обследуемого берется кровь для культивирования лимфоцитов, готовятся препараты метафазных хромосом с последующим изучением активности ЯОР хромосом и определяется уровень хромосомных аберраций в клетках с последующим расчетом коэффициента устойчивости генома.

Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов, возможно определение уровня КУГ у каждого конкретного человека, что позволит судить у него о «запасе прочности организма» и способности к сопротивлению неблагоприятным факторам внешней среды.

Постановка культуры лимфоцитов и приготовление препаратов метафазных хромосом

Используется гепарин фирмы "Ricter" (Венгрия), фитогемагглютинин фирмы "Difko-P" (США), среда 199, сыворотка крупного рогатого скота, колхицин, хлорид калия, метанол, ледяная уксусная кислота, серная кислота концентрированная, дихромат калия, нитрат серебра, раствор желатина, цитрат натрия, хлорид натрия, гидроортофосфат натрия, дигидроортофосфат калия, краситель Гимза фирмы "Merck" (США). Реактивы отечественного производства должны быть марки "ХЧ" и "ОСЧ".

Культивирование крови и приготовление препаратов метафазных хромосом проводят по общепринятой методике [Методические рекомендации / ЦИУВ. - М.: Медицина, 1989. - 113 с. Бочков, Н.П. Культура лимфоцитов как тест-объект для изучения генетических последствий у лиц, контактирующих с мутагенами / Н.П.Бочков, B.C.Журков, Н.П.Кулешов // Докл. АН СССР. - 1974. - Т.218. - №2. - С.463-465.]. Кровь забирали из локтевой вены и заполняли ею стерильные пенициллиновые флаконы, в которых находился раствор гепарина (0,1 мл на 1 мл крови). Гепарин используют в разведении бидистилированной водой 1:20. Кровь культивируют в стерильных пенициллиновых флаконах с питательной средой при 37°С в течение 72 часов. Питательная среда состоит из среды 199 (6,0 мл) и сыворотки крупного рогатого скота (1,5 мл). В качестве стимулятора пролиферативной активности используется фитогемагглютинин. За 2 часа до начала фиксации в культуру лимфоцитов добавляют колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Фиксацию проводят на 72 часу культивирования. После центрифугирования и отсасывания надосадочной жидкости клетки инкубируют с предварительно подогретым до 37°С 0,75 М раствором хлорида калия в течение 20 минут при 37°С. После гипотонизации проводят центрифугирование и отбор надосадочной жидкости. Клетки фиксируют в фиксаторе Карнуа (метанол + уксусная кислота) в соотношении 3:1 в течение трех и более часов. За это время производят три смены фиксатора. После полного обесцвечивания суспензии клеток, ее раскапывают на обезжиренные предметные стекла, смоченные дистиллированной холодной водой. Препараты высушивают на воздухе и шифровали.

Посадку, культивирование лимфоцитов крови и приготовление препаратов проводят строго стандартно во всех случаях. После приготовления препараты выдерживают при комнатной температуре для окраски нитратом серебра 7-14 дней, а для рутинного окрашивания для изучения уровня хромосомных аберраций - 2-3 дня.

Окраска хромосомных препаратов раствором нитрата серебра - Ag-окрашивание

С целью выявления транскрипционно активных ЯОР хромосом используется метод, предложенный Howell W.M. [Howell W.M. Chromosome core structure revealed by silver staining // Chromosome. - 1979. - vol.73. - p.61-66]. На препараты метафазных хромосом наносят по 50 мкл бидистиллированной воды, 150 мкл 50% раствора нитрата серебра и 100 мкл 2% раствора желатина. Тщательно перемешивают и помещают в термостат на 8-10 мин при температуре 56,7 С°. После завершения окраски смывают раствор серебра под проточной водой и высушивают на воздухе. Препараты помещают в нагретый до 56,7 С° раствор 2×SSC (0,03 М раствор Na₃C₆H₅O₇·5,5 H₂O и 0,3 М раствор NaCl в соотношении 1:1) и выдерживают при 56,7 С° в течение 10 мин. Обезвоживают в 70% и 96% этиловом спитре. Препараты высушивают на воздухе и окрашивают раствором красителя Романовского-Гимзы (250 мкл красителя растворяют в 5 мл буферного раствора (хлорид натрия + цитрат натрия).

Оценка хромосомных препаратов на количество активных ЯОР проводится следующим образом.

Количество активных ЯОР хромосом определяют с помощью светового микроскопа "Биолам" (увеличение окуляра 10, увеличение объектива 90). Сумма размеров 10 АgЯОР (ЯОР 10 акроцентрических хромосом) характеризует количество транскрипционно активных ЯОР в клетке и служит основой для сравнения индивидуальных геномов по этому признаку (Ag-полиморфизм).

Число окрашенных ЯОР подсчитывают в каждой анализируемой метафазной пластинке. Если данная акроцентрическая хромосома содержала в коротком плече зерна серебра, то такой ЯОР оцениваются как транскрипционно активный, если он был неокрашен, то расценивался как неактивный.

Для исключения возможности недоокраски ЯОР серебром для анализа отбирают метафазные пластинки с полной (завершенной) окраской. На хромосомах окрашенных серебром не полностью, в ЯОР появляется гомогенное, слабо окрашенное пятно вместо хорошо контурированных спутничных нитей, в то время как проксимальная часть короткого плеча и длинные плечи хромосом остаются неизменными. В полностью окрашенных серебром ЯОР таких слабо окрашенных пятен нет.

Для оценки окрашенных серебром хромосом всех просматриваемых метафазных пластинок используются следующие показатели: 10AgЯOP, D ЯОР/10 АgЯОР, G ЯОР/10 AgЯOP, характеризующие транскрипционную активность ЯОР данного индивида.

Оценка транскрипционной активности ЯОР акроцентрических хромосом проводится у каждого индивида по приведенным выше показателям в 300 метафазных пластинках с расчетом среднего арифметического каждого показателя. Нормативные показатели получали на группе здоровых лиц численностью не менее 20 человек с расчетом по каждому показателю среднего арифметического значения.

Определение уровня хромосомных аберраций

Для проведения исследований на мутагенез, хромосомные препараты окрашивали с помощью красителя Романовского-Гимзы на воде в соотношении 1:50, без предварительной обработки. Время окрашивания в наших исследованиях 10 мин. Метафазные пластинки должны быть хорошо окрашены, без наложений друг на друга хромосом. На метафазных пластинках не должно быть «подложки» - остатков ядерной оболочки, что говорит о недостаточном времени культивирования.

Готовые препараты изучали под микроскопом, при этом у одного человека в нашем исследовании наблюдали 300 метафазных пластинок, их заносили в протокол, где указывался тип повреждения хромосомы, ее группа и координаты метафазной пластинки. По всем оцениваемым показателям ломкости хромосом - количество хромосомных аберраций (КХА), общее количество фрагментов хромосом (ОКФХ), количество обменов (КО), количество хромосомных обменов (КХО), количество хроматидных обменов (КХРО) вычисляли среднеарифметические значения.

Для определения устойчивости генома у обследованных вычисляется КУГ по формуле:

Устойчивость генома особи КУГ в норме составляет от 0,130 до 0,140. В случае если его значения составляют от 0,141 до 0,146, то устойчивость генома человека и его адаптивные возможности снижены и он входит в группу риска по возникновению различных заболеваний. Необходимо ежемесячное обследование таких пациентов на предмет уровня КУГ с нормализацией образа жизни. При значении КУГ 0,147 и ниже - у больных имеет место резкое снижение устойчивости, что угрожает развитием серьезных осложнений уже имеющихся болезней, что требует проведения антиоксидантной терапии и применения веществ, усиливающих репарацию ДНК (витамин В₅).

Внедрение данного способа оценки устойчивости генома особи у людей в практику лечебных учреждений, центров планирования семьи и медикогенетических консультаций, позволит решить ряд насущных социально-экономических проблем современности. Своевременное и адекватное назначение корректирующего подхода для нормализации КУГ в каждом конкретном случае способно оптимизировать генетические процессы и обеспечить получение более здорового потомства от женщин, собирающихся забеременеть.

Пример 1. Жительница г.Курска, 31 год, практически здорова, ведущая здоровый образ жизни, обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня соотношений 10AgЯOP=18,5, D ЯОР/10 AgЯOP=0,55, G ЯОР/10 AgЯOP=0,44.

У обследуемой были найдены следующие значения хромосомной стабильности: количество хромосомных аберраций 1,13, общее количество фрагментов хромосом 1,23, количество обменов 0,130, количество хромосомных обменов 0,074, количество хроматидных обменов 0,056 на 100 клеток.

Полученные результаты были обработаны с помощью формулы

КУГ был определен на уровне 0,134, что позволило оценивать устойчивость генома у обследуемой как нормальную.

Обследуемой было рекомендовано и далее вести здоровый образ жизни.

Пример 2. Житель Курской области, 42 года, страдающий язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в течение 10 лет, обследован во время профилактического осмотра по месту жительства. У больного была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня 10AgЯOP=17,3, D ЯОР/10АgЯОР=0,65, G ЯОР/10АgЯОР=0,35.

У обследуемого было найдено, что количество хромосомных аберраций (на 100 кл.) 1,10, общее количество фрагментов хромосом 1,25, количество обменов 0,127, количество хромосомных обменов 0,078, количество хроматидных обменов 0,048.

Полученные результаты были рассчитаны по формуле

Определен КУГ особи, который находился на уровне 0,142, что указывало на его снижение у обследуемого.

Больному было рекомендована диета, богатая витамином В₅, морепродуктами и прием антиоксиданта - токоферола ацетата 0,2 г по 1 капсуле 3 раза в день, что позволило нормализовать КУГ=0,133 к концу 3 месяцев лечения.

Пример 3. Жительница г.Курска, 72 года, прооперирована 1 год назад по поводу рака печени III ст, обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня 10AgЯOP=16,8, D ЯОР/10 AgЯOP=0,57, G ЯОР/10 АgЯОР=0,30.

У больной было найдено, что количество хромосомных аберраций (на 100 кл.) 1,14, общее количество фрагментов хромосом 1,24, количество обменов 0,126, количество хромосомных обменов 0,079, количество хроматидных обменов 0,047.

Полученные результаты были рассчитаны по формуле

Определена устойчивость генома особи с расчетом КУГ. Коэффициент устойчивости генома особи составил 0,149, что указывало на выраженное снижение адаптивных возможностей генома обследованной.

Больной было рекомендована диета, богатая молочными продуктами, витамином В5, морепродуктами и прием токоферола ацетат 0,2 г по 2 капсулы 4 раза в день и дуовит 1 красная таблетка и 1 синяя таблетка в сутки на 4 месяца. Через 5 мес у больной нормализовался показатель КУГ (0,138). Больной было предложено соблюдать в дальнейшем данные ей рекомендации.

Способ определения устойчивости генома особи путем взятия крови, постановки культуры лимфоцитов, приготовления препаратов метафазных хромосом, окраски хромосомных препаратов с нитратом серебра и проведения анализа хромосомных препаратов в метафазных пластинках на предмет уровня активности ЯОР и количества хромосомных аберраций, отличающийся тем, что анализ хромосомных препаратов проводят в 300 метафазных пластинках и определяют показатели 10AgЯOP, D ЯОР/10 AgnOP, G ЯОР/10 AgnOP, окраски хромосомных препаратов с помощью красителя Романовского-Гимзы с оценкой каждого обследуемого на предмет уровня хромосомных аберраций по показателям - количество хромосомных аберраций, общее количество фрагментов хромосом, количество обменов, количество хромосомных обменов, количество хроматидных обменов с вычислением средних арифметических значений всех оцениваемых показателей с последующим расчетом коэффициента устойчивости генома (КУГ) по формуле:

при значении КУГ от 0,130 до 0,140 уровень устойчивости генома особи можно оценить нормальным; при значении КУГ от 0,141 до 0,146 уровень устойчивости генома особи несколько снижен, указывая на то, что человек входит в группу риска по возникновению различных заболеваний; при уровне КУГ от 0,147 и выше - уровень устойчивости генома особи резко снижен, что угрожает развитием серьезных осложнений уже имеющихся болезней.