Питательная среда для выращивания deinococcus radiodurans

Авторы патента:

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

Владельцы патента RU 2407786:

Сазыкина Марина Александровна (RU)
Чистяков Владимир Анатольевич (RU)

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред для выращивания Deinococcus radiodurans. Питательная среда содержит соевую муку, глюкозу или сахарозу, MgSO₄×7Н₂О, МnСl₂ и дистиллированную воду в заданных количествах. Изобретение позволяет повысить выход биомассы Deinococcus radiodurans и упростить процесс получения питательной среды. 2 табл.

Предлагаемое изобретение относится к микробиологии, а, именно к получению питательных сред для выращивания Deinococcus radiodurans.

Непатогенная бактерия Deinococcus radiodurans известна устойчивостью к дозам радиации, в десятки раз превышающим летальные для изученных к настоящему времени микроорганизмов.

Одной из характерных особенностей этой бактерии является выработка деиноксантина - каротиноида, придающего колониям характерную розово-оранжевую окраску. Это вещество обладает уникально высокой антиоксидантной активностью. Деиноксантин способен значительно эффективнее, чем β-каротин и α-токоферол, перехватывать синглетный кислород и гидроксильный радикал (наиболее опасные виды активных форм кислорода).

Это вещество безвредно и, следовательно, может иметь целый ряд применений:

- в пищевой технологии как недорогой натуральный краситель для разнообразных продуктов или как натуральный антиоксидант, препятствующий прогорканию жирных продуктов (майонеза, шоколадной пасты и др.);

- в фармакологии как эффективный антиоксидант; в том числе как основа адаптогенов, геропротекторов, анестетиков нового поколения, протекторов ближнего ультрафиолета.

В связи с вышеизложенным разработка дешевых питательных сред для выращивания бактерии Deinococcus radiodurans в настоящее время является актуальной задачей.

Используемая культуральная среда должна соответствовать требованиям конкретного организма, в данном случае бактерии Deinococcus radiodurans.

Пригодные для инкубации микроорганизмов питательные среды содержат источник углерода, например углеводы; источник азота в виде различных азотсодержащих соединений; а также различные комплексные добавки, к примеру соли металлов, которые необходимы для роста.

Известна питательная среда (1), используемая для выращивания штамма микроорганизмов Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, содержащая питательную основу, где в качестве источника азота используются органические азотсодержащие соединения - пептон, дрожжевой экстракт, в качестве соли - хлористый натрий, а также агар, при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:

дрожжевой экстракт	5,0
пептон	15,0
NaCl	5,0
агар	15,0
дистиллированная вода	до 1 л

Недостатком известной питательной среды является дороговизна составляющих компонентов, т.к. в ее состав входят продукты животного происхождения - пептон, дрожжевой экстракт, агар. При этом производительность культивирования бактерий Deinococcus radiodurans с использованием данной среды невысока.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда (2) для выращивания штамма микроорганизма Deinococcus radiodurans, содержащая питательную основу, где в качестве источника углеводов использована глюкоза, в качестве органических азотсодержащих соединений - дрожжевой экстракт, и важный для роста источник аминокислот - триптон, при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:

триптон	5,0
глюкоза	1,0
дрожжевой экстракт	3,0
дистиллированная вода	до 1 л

Недостатком данной среды является использование дорогостоящих ингредиентов (триптон - трипсиновый гидролизат белкового субстрата животного происхождения, дрожжевой экстракт - автолизат пекарских дрожжей) при невысоком выходе биомассы выращиваемых бактерий.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка новой пригодной для выращивания бактерий Deinococcus radiodurans питательной среды, которая была бы более экономичной и обеспечивала более высокий выход биомассы бактерий Deinococcus radiodurans по сравнению с известными в настоящее время питательными средами.

Указанная задача достигается тем, что питательная среда для выращивания Deinococcus radiodurans, содержащая питательную основу, источник углерода, ростовый компонент и дистиллированную воду, согласно изобретению в качестве питательной основы содержит соевую муку, в качестве источника углерода - глюкозу или сахарозу, а в качестве ростовых компонентов - MgSO₄×7H₂O и MnCl₂, при следующем соотношении компонентов, г/л:

соевая мука	40,0-60,0
глюкоза или сахароза	8,0-20,0
MgSO₄×7H₂O	0,02-0,07
MnCl₂	0,0004-0,001
дистиллированная вода	до 1 л

В предлагаемой среде в качестве питательной основы использована соевая мука, которая обеспечивает оптимальные условия для развития микроорганизмов Deinococcus radiodurans, а также значительно удешевляет стоимость данной питательной среды. В качестве источника углерода использованы глюкоза или сахароза, которые, кроме того, способствуют лучшему пигментообразованию.

Кроме того, в качестве ростовых компонентов, а также для наибольшей степени образования пигмента в питательную среду добавлены MgSO₄×7Н₂О и MnCl₂.

Сочетание предложенных компонентов для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans обеспечило увеличение роста их биомассы по сравнению с прототипом в 5,8 раз.

Неизвестно сочетание предложенных компонентов для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans, что является отличительным признаком предлагаемой питательной среды.

В результате проведенного анализа уровня техники не обнаружен аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения, а определение прототипа из выявленных аналогов позволило выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "новизна".

При дополнительном поиске других решений, относящихся к питательным средам, указанных отличительных признаков не обнаружено. Таким образом, заявленное изобретение соответствует условию "изобретательский уровень".

Разработка питательной среды поясняется следующими примерами.

Питательную среду готовят следующим образом.

Берут 50 г соевой муки, 10 г глюкозы или сахарозы, 0,05 г MgSO₄×7Н₂О, 0,0006 г MnCl₂, добавляют до 1 л дистиллированной воды, стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

Согласно методическим рекомендациям (3) были проведены качественный и количественный контроли биологических свойств предложенной среды с использованием Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 в качестве тестового штамма.

Качественный контроль выполняли путем посева односуточного тестового штамма в предлагаемую питательную среду с помощью общепринятой методики.

По истечении срока инкубации тестовый штамм дал хорошо различимый рост с типичными отличительными признаками: помутнение жидкой среды с равномерным окрашиванием в розово-оранжевый цвет (штамм образует пигмент розово-оранжевого цвета) и образованием осадка розово-оранжевого цвета. Проведение качественного контроля показало способность тестового штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 расти на предложенной среде с получением при этом характерных дифференцирующих признаков.

Также проводили количественный контроль предложенной среды по биологическим показателям. Для этого готовили суспензию тестового штамма с использованием стандарта мутности в 10 единиц (концентрация микробных клеток в 1 млрд) и десятикратные серийные разведения (по 8 разведение включительно).

Для контроля разбавления из 6 и 7 разведения высевали по 0,1 мл суспензии прямым посевом на чашки с питательным агаром. Из каждого разведения делали по три таких посева. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 30°С в течение 24-48 часов. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний, выросших на трех чашках.

Среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 из шестого разведения, составило 91, а из седьмого - 9. Согласно методическим рекомендациям (3) среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма из шестого разведения, должно составлять около 100 КОЕ (колониеобразующих единиц), а соотношение средних значений при посеве из шестого в седьмое разведение должно быть близко 10: 1. Таким образом, полученные значения свидетельствуют о пригодности и эффективности предложенной среды для выращивания Deinococcus radiodurans.

Экспериментально был проведен подбор оптимального количества компонентов (ингредиентов) в питательной среде.

Пример 1. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

соевая мука	40,0
глюкоза	20,0
MgSO₄×7H₂O	0,07
MnCl₂	0,0004
дистиллированная вода	до 1 л

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в широкогорлых колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.