Новая эндо-(1-4)- -d-ксиланаза из penicillium canescens (варианты), фрагмент днк, кодирующий секретируемую эндо-(1-4)- -d-ксиланазу из penicillium canescens (варианты), и способ ее получения

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новые эндо-(1-4)-β-D-ксиланазы мицелиального гриба Penicillium canescens. Изобретение относится также к способу получения эндо-(1-4)-β-D-ксиланаз с использованием эукариотических клеток, трансформированных фрагментом ДНК, кодирующим указанные ксиланазы из Penicillium canescens. Изобретение позволяет расширить арсенал известных эндоксиланаз. 10 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл.

 

Область техники

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии и представляет собой новые эндо-(1-4)-β-D-ксиланазы из Penicillium canescens, фрагменты ДНК, кодирующие секретируемые эндо-(1-4)-β-D-ксиланазы, мицелиальные грибы Penicillium canescens - продуценты секретируемых эндо-(1-4)-β-D-ксиланаз, и способ получения указанных ксиланаз.

Описание предшествующего уровня техники

Эндоксиланазы являются ферментами, расщепляющими ксилан - основной компонент гемицеллюлоз. В этой связи эндоксиланазы представляют большой интерес как в промышленности, так и прикладной биотехнологии. Эндоксиланазы находят промышленное применение в бумажной индустрии в процессах отбеливания, в пищевой и кормовой промышленности и других сферах (Kulkarni N., Shendye A., Rao M., FEMS Microbiology Reviews, 1999, v.23, p.411).

В целлюлозно-бумажной промышленности ксиланазы используются при отбелке сульфатной целлюлозы в различных странах (Bajpaj, P., Biotechnol. Prog., 1999, v.15, p.147-157; Joyce Т.W., International Technical Conference Pap-For 92, St. Petersburg, 1992, p.269-277; Yee, E., Pulp and Paper Canada, 1997, v.98, No.10, p.42-49; Tolan, J.S., Pulp and Paper Canada, 1995, v.96, No.12, p.107-110; De Araujo, J.H.B. et al. Proc. 5^th Braz. Symp. Chem. Lignin Wood Compon., 1997, p.357-366). Положительный эффект от использования ксиланаз заключается в экономии химикатов и уменьшении загрязнения окружающей среды (см. например Paice, M. et al. Biotechnol. Bioeng., 1988, No.32, p.235-239; Buchert, J. et al. Bioresource Technology, 1994, v.50, p.65-72; Александрова, Г.П. и др., II Всероссийская конференция Химия и технология растительных веществ, 2002, с.148-150). Ферменты могут использоваться как в традиционных схемах отбелки с использованием молекулярного хлора, так и в современных ECF, TCF (totally chlorine free) схемах, использующих диоксид хлора, пероксид кислорода, кислород (см. например De Araujo, J.H.В. et al. Proc. 5^th Braz. Symp. Chem. Lignin Wood Compon., 1997, p.357-366, 13, 19).

Ферменты этого класса катализируют частичный гидролиз ксилана, расположенного на поверхности целлюлозных волокон. Промышленные препараты ферментов включают, главным образом, эндо-1,4-β-D-ксиланазы.

Известны различные грибные продуценты эндоксиланаз: Trichoderma reesi, Trichoderma harzianum (Torronen A., Rouvmen. J. Biotechnol, 1997, 57(1-3):137.), Thermoascus auranticus (патент США 4966850); Aspergillus tubigensis (патент США 5358864); Humicola insolens (патент США 5610048).

Для мицелиального гриба Penicillium canescens (далее Р. canescens) известна эндо-1,4-β-D-ксиланаза (XylA), а также описаны штаммы гриба Р. canescens ВКПМ F-832 (патент РФ 2197526) и ВКПМ F-912 (патент РФ 2293115) - продуценты секретируемой эндо-(1-4)-β-D-ксиланазы.

Однако до настоящего времени не было известно о других эндо-1-4-β-D-ксиланазах, хуlB, xylC, xylD, xylE, 10-го и 11-го семейств гликозил-гидролаз мицелиального гриба Р. canescens.

Описание изобретения

Целями настоящего изобретения являлись обнаружение новых эндо-1-4-β-D-ксиланаз мицелиального гриба Р. canescens, а также создание штаммов мицелиального гриба Р. canescens - продуцентов секретируемых эндо-1-4-β-D-ксиланаз, и предоставление способа получения эндо-1-4-β-D-ксиланаз мицелиального гриба Р. canescens. Поставленная задача была решена путем клонирования и секвенирования новых эндо-1-4-β-D-ксиланаз мицелиального гриба Р. canescens, конструирования рекомбинантных плазмид pPCGXB, pPCGXC, pPCGXD и pPCGXE, несущих соответственно гены xylB, xylC, xylD и xylE эндо-1-4-β-D-ксиланаз Р. canescens под контролем промотора гена β-галактозидазы, и штаммов Р. canescens, обеспечивающих синтез и продукцию в секретируемой форме эндо-1-4-β-D-ксиланаз XylB, XylC, XylD и XylE мицелиального гриба Р. canescens.

Эндо-(1-4)-β-D-ксиланазой XylB согласно настоящему изобретению является эндо-(1-4)-β-D-ксиланаза мицелиального гриба Р. canescens, последовательность которой представлена в Перечне последовательностей под номером (SEQ ID NO:1), или ее вариант.

Эндо-(1-4)-β-D-ксиланазой XylC согласно настоящему изобретению является эндо-(1-4)-β-D-ксиланаза мицелиального гриба Р. canescens, последовательность которой представлена в Перечне последовательностей под номером (SEQ ID NO:3), или ее вариант.

Эндо-(1-4)-β-D-ксиланазой XylD согласно настоящему изобретению является эндо-(1-4)-β-D-ксиланаза мицелиального гриба Р. canescens, последовательность которой представлена в Перечне последовательностей под номером (SEQ ID NO:5), или ее вариант.

Эндо-(1-4)-β-D-ксиланазой XylE согласно настоящему изобретению является эндо-(1-4)-β-D-ксиланаза мицелиального гриба Р. canescens, последовательность которой представлена в Перечне последовательностей под номером (SEQ ID NO:7), или ее вариант.

Фрагментом ДНК, кодирующим эндо-1-4-β-D-ксиланазу XylB мицелиального гриба Р. canescens согласно настоящему изобретению, является фрагмент ДНК, последовательность которого представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2.

Фрагментом ДНК, кодирующим эндо-1-4-β-D-ксиланазу XylC мицелиального гриба Р. canescens согласно настоящему изобретению, является фрагмент ДНК, последовательность которого представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:4.

Фрагментом ДНК, кодирующим эндо-1-4-β-D-ксиланазу XylD мицелиального гриба Р. canescens согласно настоящему изобретению, является фрагмент ДНК, последовательность которого представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:6.

Фрагментом ДНК, кодирующим эндо-1-4-β-D-ксиланазу XylE мицелиального гриба Р. canescens согласно настоящему изобретению, является фрагмент ДНК, последовательность которого представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:8.

Указанные выше фрагменты ДНК кодируют незрелые белки, содержащие лидерные пептиды. Лидерные пептиды незрелых белков отщепляются с образованием зрелой, активной формы эндо-1-4-β-D-ксиланазы.

Термин «вариант белка» в значении, в котором он используется в настоящем изобретении, означает белок, который имеет изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например как минимум 10% от активности нативной эндо-1-4-β-D-ксиланазы. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15 и наиболее предпочтительно от 1 до 5 изменений в последовательности белка под номером 2 (SEQ ID NO:2). Эти изменения могут иметь место в областях белка, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который имеет гомологию не менее чем 70%, предпочтительно не менее чем 80%, более предпочтительно не менее чем 90% и наиболее предпочтительно не менее чем 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности, представленной на SEQ ID NO:2, при условии, что активность белка сохраняется. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.

Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp и замену Val на Met, Ile или Leu.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), кодирующего эндо-1-4-β-D-ксиланазу, например посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный белок эндо-1-4-β-D-ксиланазы, могут быть получены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке, и установления активности экспрессируемого продукта. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный белок эндо-1-4-β-D-ксиланазы, также могут быть получены путем выделения фрагментов ДНК, которые гибридизуются с зондами, имеющими нуклеотидную последовательность, которая содержит, например, нуклеотидную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью эндо-1-4-β-D-ксиланазы. "Жесткие условия" в том значении, которое приписывается этому выражению в рамках настоящего изобретения, означает такие условия, при которых так называемые специфические гибриды образуются, а неспецифические гибриды не образуются. Например, демонстрацией жестких условий могут быть такие условия, при которых фрагменты ДНК, имеющие высокую гомологию, например фрагменты ДНК, имеющие гомологию не менее чем 50%, предпочтительно не менее чем 60%, более предпочтительно не менее чем 70%, еще более предпочтительно не менее чем 80%, еще более предпочтительно не менее чем 90% и наиболее предпочтительно не менее чем 95%, способны гибридизоваться друг с другом, а фрагменты ДНК, имеющие гомологию более низкую, чем описано выше, не способны гибридизоваться друг с другом. Кроме того, демонстрацией жестких условий могут служить такие условия, при которых фрагменты ДНК гибридизуются при концентрации соли, эквивалентной условиям однократной отмывки при гибридизации по Саузерну, которые составляют 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°C. Продолжительность отмывки зависит от типа мембраны, используемой для блотинга, и, как правило, рекомендуется производителем набора. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для мембраны Hybond™ N⁺ nylon (Amersham, США) в жестких условиях составляет приблизительно 15 минут. Желательно отмывку повторять 2-3 раза. В качестве зондов может быть также использована неполная нуклеотидная последовательность, приведенная в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1, 3, 5 или 7. Зонды могут быть приготовлены с помощью ПЦР с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1, 3, 5 или 7, и на основе фрагментов ДНК, содержащих нуклеотидную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1, 3, 5 или 7, в качестве матрицы. В тех случаях, когда фрагмент ДНК, имеющий длину около 300 п.о., используется в качестве зонда, условия отмывки в процессе гибридизации включают, например, 50°C, 2×SSC и 0.1% SDS.

Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов так, как они описаны выше, также включает мутации, которые имеют место в природе (мутант или вариант), например обусловленные видовой изменчивостью.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами эндо-1-4-β-D-ксиланазы, определяются по его способности катализировать гидролиз ксилана, расположенного на поверхности целлюлозных волокон. Так, например, активность эндо-1-4-β-D-ксиланазы в культуральной жидкости определяют по количеству восстанавливающих сахаров, выделяемых при гидролизе березового ксилана (см. Пример 6). Инкубацию субстрата и фермента проводят при 50°C в течение 10 мин. За единицу активности принимают количество фермента, высвобождающее 1 мкмоль/мин восстанавливающих сахаров при указанных выше условиях. Восстанавливающие сахара определяют, напрмер, методом Шомоди-Нельсона (Синицин А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М.: Изд-во МГУ, 1995). Считается, что вариант белка обладает свойствами эндо-1-4-β-D-ксиланазы при условии, что активность указанного варианта составляет не ниже 10% активности нативной эндо-1-4-β-D-ксиланазы.

«Трансформация клетки фрагментом ДНК» означает введение указанного фрагмента ДНК в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация клетки может быть осуществлена как линейным фрагментом ДНК, содержащим ген, кодирующий эндо-1-4-β-D-ксиланазу мицелиального гриба Р. canescens согласно настоящему изобретению или ее вариант, под контролем промотора, функционирующего в такой эукариотической клетке, так и в составе плазмиды. Трансформация приводит к усилению экспрессии гена, кодирующего эндо-1-4-β-D-ксиланазу согласно настоящему изобретению, и к увеличению активности белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Примере 4.

Согласно настоящему изобретению «эукариотическая клетка - продуцент эндо-1-4-β-D-ксиланазы» означает эукариотическую клетку, обладающую способностью к продукции и выделению эндо-1-4-β-D-ксиланазы согласно настоящему изобретению в питательную среду, когда эукариотическая клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «эукариотическая клетка - продуцент эндо-1-4-β-D-ксиланазы» также означает клетку, которая способна к продукции эндо-1-4-β-D-ксиланазы и вызывает накопление эндо-1-4-β-D-ксиланазы в питательной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом, и предпочтительно означает, что указанная клетка способна накапливать в среде эндо-1-4-β-D-ксиланазу в количестве не менее чем 0,1 условной единицы активности в 1 мл реакционной смеси (определение "условной единицы активности" дано выше).

Предпочтительно использование клеток мицелиальных грибов в качестве реципиентов для трансформации рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий эндо-1-4-β-D-ксиланазу согласно настоящему изобретению.

Примером штамма - реципиента для получения продуцента рекомбинантной лакказы согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, штамм мицелиальных грибов Р. canescens PCE-7 (niaD^-) (см. Пример 4).

Способ получения эндо-1-4-β-D-ксиланазы мицелиального гриба Р. canescens включает стадии выращивания эукариотических клеток, трансформированных плазмидой, содержащей фрагмент ДНК согласно настоящему изобретению, в питательной среде, подходящей для выращивания указанных эукариотических клеток, и выделения эндо-1-4-β-D-ксиланазы из культуральной жидкости.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, различные органические кислоты, а также другие сырьевые материалы, такие как свекловичный жом, отруби и другие подобные материалы. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как при температуре в пределах от 20 до 40°C, предпочтительно в пределах от 25 до 35°C. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 5 до 7 дней приводит к накоплению целевого продукта в культуральной среде.

Использование указанного выше способа позволяет проводить синтез и продукцию в секретируемой форме эндо-1-4-β-D-ксиланазы мицелиального гриба P. canescens с активностью не менее 0,1 условной единицы активности в 1 мл реакционной смеси.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 приведены (А) нуклеотидная последовательность адаптера и праймеров AP1 и АР2, (Б) пример клонирования неизвестной 5'-фланкирующей области определенного гена.

На фиг.2 показана нуклеотидная последовательность гена xylB P. canescens и аминокислотная последовательность незрелого белка. В кодирующей области гена подчеркнута последовательность сигнального пептида.

На фиг.3 показана нуклеотидная последовательность гена xylC P. canescens и аминокислотная последовательность незрелого белка. В кодирующей области гена подчеркнута последовательность сигнального пептида.

На фиг.4 показана нуклеотидная последовательность гена xylD P. canescens и аминокислотная последовательность незрелого белка. В кодирующей области гена подчеркнута последовательность сигнального пептида.

На фиг.5 показана нуклеотидная последовательность гена xylE P. canescens и аминокислотная последовательность незрелого белка. В кодирующей области гена подчеркнута последовательность сигнального пептида.

На фиг.6 показан SDS-ПААГ - электрофорез белков культуральной жидкости трансформантов Р. canescens PCE-7/pPCGXC (1), Р. canescens PCE-7/pPCGXD (2), P. canescens PCE-7/pPCGXB (3), P. canescens PCE-7/pPCGXE (5), P. canescens PCE-7 (6), выращенных в жидкой среде со свекловичным жомом в качестве источника углерода.

Дорожка 4 - белковые маркеры.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие примеры, никаким образом не ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1. Клонирование генов xylB, xylC, xylD и xylE, кодирующих эндо-1-4-β-D-ксиланазы мицелиального гриба Penicillium canescens

Для клонирования внутренних фрагментов генов xylB, xylC, xylD использовали олигонуклеотидные праймеры, полученные на основе сравнения консервативных нуклеотидных последовательностей грибных эндо-1-4-β-D-ксиланаз 11-го семейства гликозил-гидролаз с молекулярной массой около 20 кДа родов Penicillium и Aspergillus, имеющихся в GenBank Database.

Для клонирования внутренних фрагментов генов xylE использовали олигонуклеотидные праймеры, полученные на основе сравнения консервативных нуклеотидных последовательностей грибных эндо-1-4-β-D-ксиланаз 10-го семейства гликозил-гидролаз с молекулярной массой около 35 кДа родов Penicillium и Aspergillus, имеющихся в GenBank Database.

Клонирование указанных генов осуществляли в несколько этапов.

Для клонирования внутренних фрагментов генов xylB, xylC, xylD и xylE использовали следующие пары олигонуклеотидных праймеров: xylB-dir (SEQ ID NO:9) и xylB-rev (SEQ ID NO:10), xylC51 (SEQ ID NO:11) и xylС31 (SEQ ID NO:12), xylD52 (SEQ ID NO:13) и xylD32 (SEQ ID NO:14), xylE-dir (SEQ ID NO:15) и xylE-rev (SEQ ID NO:16) соответственно.

Далее с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) синтезировали внутренние фрагменты генов эндоксиланаз размером около 470 п.н. В качестве матрицы использовали ДНК штамма Р. canescens ВКПМ F-178.

Амплифицированные фрагменты ДНК клонировали в плазмидный вектор pUC57, предварительно расщепленный по сайту рестрикции SmaI. Нуклеотидную последовательность полученных фрагментов определяли по методу Сенгера (Sanger et al., 1997, PNAS, v.74, p.5463) с использованием стандартных праймеров M13/pUC direct (SEQ ID NO:17) и M13/pUC reverse (SEQ ID NO:18).

Для клонирования 5'- и 3'-фланкирующих областей генов использовали метод ПЦР для неклонированной геномной ДНК (Siebert et al., 1995) с незначительными изменениями. Геномную ДНК Р. canescens F178 расщепляли с помощью ферментов Есо32I, MlsI, PvuII, ScaI и SspI по отдельности. К этим фрагментам дотировали адаптер (фиг.1, А, SEQ ID NO:19 и 20), один из концов которого является тупым и лигируется с обоими концами фрагментов ДНК. На укороченном 3'-конце адаптера присутствует аминогруппа, наличие которой блокировало элонгацию укороченной цепи адаптера, предотвращая отжиг праймеров AP1 (SEQ ID NO:21) и АР2 (SEQ ID NO:22), до тех пор пока не пройдет синтез цепи с генно-специфичных праймеров (фиг.1, Б).

Синтезировали генно-специфичные праймеры для фрагмента xylB - 1D (SEQ ID NO:23), 2D (SEQ ID NO:24), 1R (SEQ ID NO:25), 2R (SEQ ID NO:26); для фрагмента xylC - 1D (SEQ ID NO:27), 2D (SEQ ID NO:28), 1R (SEQ ID NO:29), 2R (SEQ ID NO:30); для фрагмента xylD - 1D (SEQ ID NO:31), 2D (SEQ ID NO:32), 1R (SEQ ID NO:33), 2R (SEQ ID NO:34); для фрагмента xylE - 1D (SEQ ID NO:35), 2D (SEQ ID NO:36), 1R (SEQ ID NO:37), 2R (SEQ ID NO:38).

С использованием пар праймеров (AP1 и 1R; АР2 и 2R) и (AP1 и 1D; AP2 и 2D) и фрагментов геномной ДНК с пришитыми адаптерами амплифицировали соответственно 5'- и 3'-фланкирующие фрагменты генов xylB, xylC, xylD и xylE эндо-1-4-β-D-ксиланаз P. canescens длиной 1.5-2 т.п.н.

Полученные 5'- и 3'-фланкирующие фрагменты частично секвенировали с использованием соответствующих праймеров 2R и 2D для каждого гена. Таким образом, получили нуклеотидные последовательности кодирующих областей xylB, xylC, xylD и xylE эндо-1-4-β-D-ксиланаз Р. canescens (фиг.2-5, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 соответственно).

На основании сравнения нуклеотидных последовательностей клонированных генов с нуклеотидными последовательностями грибных эндо-1-4-β-D-ксиланаз родов Penicillium и Aspergillus, имеющихся в GenBank Database, был сделан вывод, что гены xylC, xylD и xylB кодируют эндо-1-4-β-D-ксиланазы 11-го семейства гликозил-гидролаз, а ген xylE - эндо-1-4-β-D-ксиланазу 10-го семейства гликозил-гидролаз.

Пример 2. Конструирование экспрессионных кассет pPCGXB, pPCGXC, pPCGXD и pPCGXE

Конструирование экспрессионного вектора pPCGNX

Для конструирования экспрессионных кассет, содержащих кодирующие области генов xylB, xylC, xylD и xylE эндо-1-4-β-D-ксиланаз мицелиального гриба Р. canescens, был получен экспрессионный вектор pPCGNX. Данный вектор сконструировали из плазмиды pPCG 2.6, содержащей ген внеклеточной β-галактозидазы Р. canescens (bgaS) под управлением собственного промотора (Патент РФ 2126049). В промоторной области гена β-галактозидазы удалили сайт рестрикции XhoI, для чего плазмиду расщепляли по данному сайту, концы достраивали с помощью Т4 ДНК полимеразы и dNTP и лигировали. Также был удален сайт NcoI в промоторной области гена bgaS. С помощью сайт-специфического мутагенеза (QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene, США) с использованием праймеров NCOD (SEQ ID NO:39) и NCOR (SEQ ID NO:40) вводили сайт рестрикции NcoI, перекрывающийся с инициирующим кодоном ATG гена bgaS. Непосредственно перед терминатором данного гена вводили сайт XhoI аналогичным методом с использованием праймеров XHOD (SEQ ID NO:41) и XHOR (SEQ ID NO:42).

Таким образом, полученный экспрессионный вектор pPCGNX содержит уникальные сайты рестрикции NcoI (перекрывающийся с кодоном ATG гена bgaS) и XhoI (введенный непосредственно перед терминатором галактозидазного гена).

Конструирование экспрессионных кассет, содержащих гены xylB, xylC, xylD и xylE под контролем промотора гена β-галактозидазы

Далее получили экспрессионные кассеты pPCGXB, pPCGXC, pPCGXD и pPCGXE, содержащие гены xylB, xylC, xylD и xylE эндо-1-4-β-D-ксиланаз Р. canescens под контролем промотора гена β-галактозидазы.

Для получения экспрессионной кассеты pPCGXB, содержащей структурную область гена xylB, использовали олигонуклетидные праймеры PCXLBDIR (SEQ ID NO:43) и PCXLBXHO (SEQ ID NO:44). Используя в качестве матрицы ДНК Р. canescens, амплифицировали фрагмент гена xylB размером 1100 п.н., содержащий сайты рестрикции PagI и XhoI. Полученный фрагмент обрабатывали ферментами рестрикции PagI и XhoI и клонировали в сконструированный плазмидный вектор pPCGNX, предварительно расщепленный по сайтам NcoI и XhoI.

С помощью сайт-направленного мутагенеза в гены xylC и xylD методом ПЦР вводили сайты рестрикции NcoI непосредственно перед инициирующим кодоном ATG и XhoI после терминаторного участка. Использовали следующие пары праймеров: PCXLCNCO (SEQ ID NO:45), PCXLCXHO (SEQ ID NO:46) для гена xylC и PCXLDNCO (SEQ ID NO:47), PCXLDXHO (SEQ ID NO:48) для гена xylD.

Используя в качестве матрицы ДНК Р. canescens, амплифицировали фрагменты генов xylC и xylD размером 850 п.н. и 800 п.н. соответственно. Полученные фрагменты обрабатывали ферментами рестрикции NcoI и XhoI и клонировали в сконструированный плазмидный вектор PCGNX, предварительно расщепленный по сайтам NcoI и XhoI. В результате получили экспрессионные кассеты pPCGXC и pPCGXD, содержащие структурные области генов xylC и xylD соответственно.

Для создания экспрессионной кассеты pPCGXE, содержащей структурную область гена xylE, использовали следующие праймеры: CR1337D (SEQ ID NO:49), BgXlR (SEQ ID NO:50), XlBgD (SEQ ID NO:51), XlBglR (SEQ ID NO:52) и xylE-1R (SEQ ID NO:53).

Используя в качестве матрицы плазмиду pPCG 2,6 и праймеры CR1337D и BgXlR, методом ПЦР получали фрагмент размером 1350 п.н. Используя в качестве матрицы ДНК Р. canescens и праймеры XlBgD и XlBglR, амплифицировали фрагмент размером 1450 п.н., содержащий сайты рестрикции Bsp1407I и BglII. На основе полученных двух фрагментов с помощью праймеров CR1337D и xylE-1R методом ПЦР получали фрагмент размером 1760 п.н., содержащий сайты рестрикции NcoI и Bsp1407I. Два последних фрагмента обрабатывали соответствующими ферментами рестрикции и клонировали в плазмидный вектор pPCG 2,6, расщепленный по сайтам NcoI и BglII. В результате получили экспрессионную кассету pPCGXE, содержащую структурную область гена xylE под контролем промотора гена β-галактозидазы.

Пример 3. Получение плазмиды pXylHPHTr

В плазмиду pPCXYLA (Серебряный В.А. и др. Прикладная биохимия и микробиология, 38(5):495-501 (2002)) с помощью сайт-специфического мутагенеза (QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene, США) с использованием праймеров HINDD1 (SEQ ID NO:54) и HINDR1 (SEQ ID NO:55) после инициирующего кодона ATG вводили сайт рестрикции HindIII.

Аналогичным образом в плазмиду pAN 7-1 (Mullaney E.J., et al. Mol. Gen. Genet. 199 (1), 37-45 (1985)) после инициирующего кодона ATG вводили сайт рестрикции HindIII с использованием праймеров HINDD2 (SEQ ID NO:56) и HINDR2 (SEQ ID NO:57).

Плазмиду pAN 7-1 обрабатывали рестриктазой BamHI, концы достраивали с помощью Т4 ДНК полимеразы. После этого плазмиду обрабатывали рестриктазой HindIII. Получили фрагмент размером 1050 п.н. Данный фрагмент клонировали в плазмиду pPCXYLA, предварительно обработанную несколькими ферментами в следующей последовательности: NcoI, T4 ДНК полимеразой и HindIII. Таким образом, получили плазмиду pXylHPHTr, содержащую кодирующую область гена гигромицина под контролем промотора гена xylA.

Пример 4. Получение штамма Р. canescens PCE-7 (niaD^-, xylA^-)

Для получения штамма Р. canescens PCE-7 (niaD^-, xylA^-), несущего делецию по гену xylA (Серебряный В.А., Вавилова Е.А., Чулкин A.M., Винецкий Ю.П. 2002. Прикладная биохимия и микробиология. 38(5):495-501), штамм Р. canescens РСА-10 (niaD^-) (Aleksenko A.Y., et al, Curr. Genet., 28, 474-478 (1995)) трансформировали плазмидой pXylHPHTr, содержащей полный ген устойчивости к гигромицину и промоторную область гена xylA.

Штамм Р. canescens РСА-10 (niaD^-) выращивали 16 часов при 30°C на полной питательной среде: пептон ферментативный - 3 г/л, дрожжевой экстракт - 2 г/л, глюкоза - 10 г/л, NH₄Cl - 10 mM, 50х раствор минеральных солей - 20 мл/л. Раствор минеральных солей (50х) имел следующий состав: KCl - 26 г/л, MgSO₄×7H₂O - 26 г/л, KH₂PO₄ - 76 г/л, раствор микроэлементов - 50 мл/л. Раствор микроэлементов включал в себя CuSO₄×5Н₂O - 400 мг/л, FeSO₄×5Н₂O - 800 мг/л, MgSO₄×2Н₂O - 800 мг/л, Na₂MoO₄×2Н₂O - 800 мг /л, ZnSO₄×7Н₂О - 800 мг/ л, B₄Na₂O₇ - 40 мг/ л. Мицелий переносили в раствор 1.2 М MgSO₄ и 10 мМ NaH₂PO₄, pH 5.8, и добавляли лизирующий фермент Т. harzianum (5 мг/мл). Протопластирование проводили в течение 2 часов при 30°C в условиях перемешивания. Суспензию переносили в центрифужную пробирку и наслаивали 1-2 см раствора: 0.6 М сорбитол, 10 mM CaCl, 10 mM Трис-HCl. После центрифугирования при 3000 об/мин и 4°C в течение 10 мин отбирали интерфазу, содержащую протопласты. Протопласты промывали 2 раза в стабилизирующем растворе SCT (1.2 М сорбитола, 10 мМ Трис, рН 7.5, 10 мМ CaCl₂) и ресуспендировали в нем же до концентрации 10⁸ протопластов/мл. Трансформацию проводили следующим образом: к 200 мкл суспензии протопластов добавляли 10 мкг трансформируемой ДНК pXylHPHTr, инкубировали в ледяной бане 20 мин, после чего проводили осмотический шок в течение 5 мин в РСТ (50% полиэтиленгликоль, 10 мМ CaCl₂, 10 мМ Трис-HCl) и высевали протопласты в верхнем слое на агаризованную селективную минимальную среду, содержащую 1.2 М сорбитола. В качестве селективного маркера использовали способность к росту на среде, содержащей гигромицин. Таким образом, отобрали трансформант Р. canescens РСЕ-7 (niaD^-), содержащий делецию по гену xylA.

Пример 5. Получение штаммов-продуцентов эндо-1-4-β-D-ксиланаз мицелиального гриба Р. canescens

Для трансформации протопластов мицелиального гриба Р. canescens PCE-7 (niaD^-, xylA^-) использовали по 10 мкг ДНК плазмид, pPCGXB, pPCGXC, pPCGXD и pPCGXE и по 1 мкг плазмиды pSTA-10 (Unkles et al., 1992), содержащей в качестве селективного маркера ген нитратредуктазы Aspergillus niger. Протопласты высевали на агаризованную минимальную среду следующего состава (в г на 1 л дист. воды): NaNO₃ - 6; глюкоза - 10; концентрат солей - 20 мл. Концентрат солей (SC) содержит (г/л): KCL - 26; MgSO₄×7H₂O - 26; KH₂PO₄ - 76; раствор микроэлементов - 50 мл. Полученные котрансформанты были обозначены как Р. canescens PCE-7/pPCGXC, Р. canescens PCE-7/pPCGXD, Р. canescens PCE-7/pPCGXE и Р. canescens PCE-7/pPCGXB. Далее для отбора штаммов с повышенной активностью 1 эндо-1-4-β-D-ксиланазы проводили глубинное культивирование и тестирование культуральных жидкостей на наличие соответствующей ферментативной активности.

Пример 6. Определение продуктивности штаммов-продуцентов эндо-1-4-β-D-ксиланаз

Для получения посевного материала трансформанты выращивали на агаризованной минимальной среде в течение 6 суток. Водной суспензией конидий (10⁷ конидий/мл) инокулировали 100 мл среды следующего состава (в г/л): жом свекловичный - 30; пептон - 50; KH₂PO₄ - 25. Культивирование проводили при 30°C в течение 6 суток на качалке при 240-250 об/мин в качалочных колбах на 750 мл. По окончании ферментации культуральную жидкость отделяли от мицелия и твердых остатков среды центрифугированием (10000 g, 10 мин). Активность эндо-1-4-β-D-ксиланазы в культуральной жидкости определяли по количеству восстанавливающих сахаров, выделяемых при гидролизе березового ксилана. Инкубацию субстрата и фермента проводили при 50°C в течение 10 мин. При определении температурного оптимума инкубацию проводили в течение того же времени, но при разных температурах. Проба содержала 0.45 мл 1% раствора ксилана в 0.1 М ацетатном буферном растворе, рН 5.0, и 0.05 мл фермента в соответствующем разведении. При определении рН-оптимума дополнительно использовали 0.1 М ацетатные буферные растворы с различными значениями рН (от 3.0 до 7.0). За единицу активности принимали количество фермента, высвобождающее 1 мкмоль/мин восстанавливающих сахаров при указанных выше условиях. Восстанавливающие сахара определяли методом Шомоди-Нельсона (Синицин А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М.: Изд-во МГУ, 1995 г.).

Температурный и рН оптимумы эндо-1-4-β-D-ксиланаз, продуцируемых штаммами Р. canescens PCE-7/pPCGXB, Р. canescens PCE-7/pPCGXC, Р. canescens PCE-7/pPCGXD и P. canescens PCE-7/pPCGXE, приведены в таблице 1.

SDS-ПААГ - электрофорез белков культуральной жидкости трансформантов Р. canescens PCE-7/pPCGXB, Р. canescens PCE-7/pPCGXC, Р. canescens PCE-7/pPCGXD, Р. canescens PCE-7/pPCGXE и штамма Р. canescens PCE-7, приведен на фиг.6.

В таблице 2 представлены результаты измерений активностей эндо-1-4-β-В-ксиланаз наиболее продуктивных штаммов Р. canescens PCE-7/pPCGXB, Р. canescens PCE-7/pPCGXC, Р. canescens PCE-7/pPCGXD, Р. canescens PCE-7/pPCGXE и штамма-реципиента Р. canescens PCE-7. Эндо-1-4-β-D-ксиланазы, продуцируемые штаммами Р. canescens PCE-7/pPCGXB, Р. canescens PCE-7/pPCGXC, Р. canescens PCE-7/pPCGXD и Р. canescens PCE-7/pPCGXE, были обозначены как XylB, XylC, XylD и XylE соответственно.

Пример 7. Опытно-промышленная проверка ферментных препаратов ксиланаз

Использовались препараты ксиланаз, выделяемые при помощи штаммов Р. canescens PCE-7/pPCGXB, Р. canescens PCE-7/pPCGXC, Р. canescens PCE-7/pPCGXD и Р. canescens PCE-7/pPCGXE. Для сравнения использовали ферментный препарат Biobrite UHB (Канада), а также образец эндо-1-4-β-D-ксиланазы, кодируемой геном xylA, полученной из штамма ВКПМ F-912 (патент РФ 2293115).

В экспериментах использовалась сульфатная лиственная целлюлоза Архангельского ЦБК после варки и промывки и сульфатная лиственная целлюлоза после стадии КЩО (кислородно-щелочной обработки) предприятия Mondi Business Paper (Сыктывкарский ЛПК).

Обработка целлюлозы ферментами

Все операции, связанные с отбелкой и промывкой целлюлозы, осуществляли в условиях, по возможности имитирующих производственный процесс, с расходами химикатов, определенных технологическими регламентами отбельных цехов.

Обработку целлюлозы ферментами проводили в термостатируемых реакционных емкостях с крышками объемом 500 или 250 мл в зависимости от концентрации целлюлозной суспензии и объема пробы. Значение рН массы регулировали добавлением раствора H₂SO₄ или NaOH.

Условия обработки ферментными препаратами: рН (начальное значение) - 6-7, температура - 55-60°C, концентрация массы - 3,5%, время обработки - 60 минут.

Для контроля проводили обработку целлюлозы в тех же условиях, при которых проходила ферментная обработка, но без добавления фермента. Эту пробу целлюлозы далее обрабатывали параллельно с опытными образцами, ее показатели указывали в таблицах как контрольный опыт.

Значение рН среды после обработки, а также оптическую плотность определяли в фильтрате, отобранном от целлюлозной суспензии после истечения времени обработки.

Отбелка целлюлозы

Обработку целлюлозы диоксидом хлора проводили в термостатируемых реакционных емкостях объемом 500 или 250 мл с полиэтиленовыми крышками. Навеску целлюлозы загружали в емкость и помещали ее на 15…30 мин для прогрева в водяную баню. После этого в емкость добавляли необходимое количество воды, смешанной с рассчитанным количеством серной кислоты, далее заливали необходимое количество раствора диоксида хлора, колбу герметично закрывали и взбалтывали содержимое в течение 2-3 мин.

Хлорирование целлюлозы проводили в колбах с плотно закрытыми пробками. В колбы к целлюлозе добавляли хлорную воду, после чего интенсивно перемешивали.

Щелочную обработку целлюлозы проводили в реакционных емкостях объемом 500 или 250 мл с полиэтиленовыми крышками. Емкости с навесками целлюлозы помещали на 15-30 мин для равномерного прогрева на водяную баню. Необходимое количество NaOH предварительно смешивали в отдельной посуде с расчетным количеством воды, нагретой до требуемой температуры. Смесь заливали в емкость с навеской целлюлозы и тщательно перемешивали. После смешения щелочи с массой из суспензии отбирали фильтрат и проверяли значение рН и начальной щелочности. Емкости плотно закрывали крышками и помещали в водяную баню. После обработки целлюлозу промывали водой.

В лабораторных условиях после ступеней отбелки моделировали процесс промывки целлюлозы на вакуум-фильтрах в производстве. Для этого массу разбавляли теплой водой (температура около 60°C) до концентрации волокна 2%, затем отжимали на лабораторном вакуум-фильтре, после чего целлюлозу снова разбавляли горячей водой с расходом 8 м³/т целлюлозы (температура 60°C), затем вновь отжимали до концентрации массы примерно 20%.

Анализ целлюлозы

Содержание остаточного лигнина в целлюлозе определяли перманганатным методом в единицах числа Каппа (ISO 302). Определение белизны целлюлозы проводили по ГОСТ 30437-96 (ISO 3688-77) «Целлюлоза. Метод определения белизны». Определение разрывной длины проводили в соответствии с ГОСТ 13525-79 «Полуфабрикаты волокнистые, бумага и картон. Метод определения прочности на разрыв и удлинение при растяжении». Размол целлюлозы проводили на центробежном размалывающем аппарате (ЦРА) при концентрации 6%, постоянном числе оборотов главного вала 150 в минуту. Степень помола 30° ШР. Масса отливок была 75 г/м².

Результаты измерений приведены в таблице 3 (для сульфатной лиственной целлюлозы Архангельского ЦБК после варки и промывки) и таблице 4 (для сульфатной лиственной целлюлозы Mondi Business Paper Сыктывкарского ЛПК после стадии КЩО).

Показано, что изученные препараты эндо-1-4-β-D-ксиланаз обладали характеристиками, сходными с другими коммерчески доступными ксиланазами.

Преимуществом препарата является отсутствие целлюлозной активности, что обеспечивает более высокие механические показатели беленой целлюлозы.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на приведенные выше Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Таблица 1
Эндо-1-4-β-D-ксиланаза	Температурный оптимум, °C	Оптимум рН
XylB	55	5.5
XylC	45	5.0
XylD	50	4.5
XylE	55	5.5

Таблица 2
Штамм	Активность эндо-1-4-β-D-ксиланазы, ед./мл	Увеличение продукции, раз
P. canescens PCE-7 (контроль)	5	-
P. canescens PCE-7/pPCGXB	38	7,6
P. canescens PCE-7/pPCGXC	200	40,0
P. canescens PCE-7/pPCGXD	190	38,0
P. canescens PCE-7/pPCGXE	122	24,4

Таблица 3
Ферментный препарат	Расход ферментного препарата, кг/т целлюлозы	Число Каппа после обработки и промывки
-	-	11,6
XylA	0,5	11,3
2,0	11,1
XylB	0,5	11,2
2,0	11,2
XylC	0,5	11,6
2,0	11,3
Biobrite UHB (Канада)	0,1	10,8

Таблица 4
Ферментный препарат	Расход ферментного препарата, кг/т целлюлозы	Число Каппа после обработки и промывки
Biobrite UHB (Канада)	0,1	8,4
XylA	2,0	8,1
XylC	2,0	8,4
XylD	2,0	8,2

1. Эндо-(1-4)-β-D-ксиланаза XylB (SEQ ID NO:1) мицелиального гриба Penicillium canescens.

2. Эндо-(1-4)-β-D-ксиланаза XylC (SEQ ID NO:3) мицелиального гриба Penicillium canescens.

3. Эндо-(1-4)-β-D-ксиланаза XylD (SEQ ID NO:5) мицелиального гриба Penicillium canescens.

4. Эндо-(1-4)-β-D-ксиланаза XylE (SEQ ID NO:7) мицелиального гриба Penicillium canescens.

5. Фрагмент ДНК, кодирующий эндо-(1-4)-β-D-ксиланазу XylB по п.1.

6. Фрагмент ДНК, кодирующий эндо-(1-4)-β-D-ксиланазу XylC по п.2.

7. Фрагмент ДНК, кодирующий эндо-(1-4)-β-D-ксиланазу XylD по п.3.

8. Фрагмент ДНК, кодирующий эндо-(1-4)-β-D-ксиланазу XylE по п.4.

9. Эукариотическая клетка, трансформированная фрагментом ДНК по любому из пп.5-8, - продуцент эндо-(1-4)-β-D-ксиланазы мицелиального гриба Penicillium canescens.

10. Эукариотическая клетка по п.9, отличающаяся тем, что в качестве указанной клетки используют клетки мицелиального гриба Penicillium canescens.

11. Способ получения эндо-(1-4)-β-D-ксиланазы мицелиального гриба Penicillium canescens, включающий стадии выращивания эукариотических клеток по п.9 в питательной среде и выделения эндо-(1-4)-β-D-ксиланазы из культуральной жидкости.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве эукариотических клеток используют клетки мицелиального гриба Penicillium canescens.