Ингибиторы протеинкиназы с, предназначенные для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантата

Изобретение относится к области медицины и фармакологии и касается применения 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-{(1-пиридин-2-илметил)пиперидин-4-ил}-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-диона или 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-(пиперидин-4-ил)-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-диона, изготовления фармацевтической композиции для лечения и предупреждения отторжения трансплантата органа или ткани с высокой эффективностью. 4 н.п. ф-лы.

 

Настоящее изобретение относится к новым применениям ингибиторов протеинкиназы С.

В частности, изобретение относится к новым применениям ингибиторов протеинкиназы С формулы I, II, III и IV и их фармацевтически приемлемых солей, гидратов или сольватов.

Ниже представлены ингибиторы протеинкиназы С формулы I:

в которой

R₁ и R'₁ каждый независимо друг от друга обозначает водород, алкил, галоалкил, алкенил, арилалкил, алкоксиалкил, гидроксиалкил, аминоалкил, моноалкиламиноалкил, диалкиламиноалкил, ациламиноалкил, ацилоксиалкил, цианалкил, амидиноалкил, карбоксиалкил, алкоксикарбонилалкил, аминокарбонилалкил или группу формулы (а), (b) или (с):

в которой Het обозначает гетероциклильную группу; W обозначает NH, S или связь; Т обозначает NH или S; V обозначает О, S, NH или NCN; А обозначает алкилтиогруппу, аминогруппу, моноалкиламиногруппу или диалкиламиногруппу; Аr обозначает арил;

R₂ и R'₂ каждый независимо друг от друга обозначает водород, алкил, алкоксиалкил, гидроксиалкил, C₁-С₃алкилтиогруппу, S(O)С₁-С₃алкил, СF₃;

или R₁ и R₂ образуют вместе -(СН₂)_r-Х-СН₂-, где r обозначает 1, 2 или 3 и Х обозначает CHR₈ или NR₈, где R₈ обозначает (CH₂)_sR₉, где R₉ обозначает водород, гидроксигруппу, алкоксигруппу, аминогруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, триалкиламиногруппу, азидогруппу, ациламиногруппу, алкоксикарбонил, цианогруппу, амидиногруппу или аминокарбонил и s обозначает 0, 1,2 или 3;

R₃ обозначает водород или СН₃СО;

R₄, R'₄, R₅, R'₅, R₆, R'₆, R₇ и R'₇ каждый независимо друг от друга обозначает водород, галоген, алкил, гидроксигруппу, алкоксигруппу, -COO(C₁-С₃алкил), СF₃, нитрогруппу, аминогруппу, ацетиламиногруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, алкилтиогруппу, C₁-С₃алкилтиогруппу или S(O)С₁-С₃алкил; и

n обозначает 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Ниже представлены ингибиторы протеинкиназы С формулы II:

в которой

R₁ обозначает группу формулы (d), (е) или (f):

в которой р и q каждый независимо друг от друга обозначает 1, 2, 3 или 4;

s обозначает 0, 1, 2 или 3;

t обозначает 1 или 2;

u обозначает 0 или 1; и

R₁₂ обозначает водород, алкил, галоалкил, циклоалкил, ацетил, арил, -СН(арил)₂, аминогруппу, мономоноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, гуанидиногруппу, -С(=N(алкоксикарбонил))NН(алкоксикарбонил), амидиногруппу, гидроксигруппу, карбоксигруппу, алкоксикарбонил или гетероциклил;

R'₁ обозначает водород, С₁-С₄алкил, аминоалкил, моноалкиламиноалкил или диалкиламиноалкил,

R₂ и R'₂ каждый независимо друг от друга обозначает водород, алкил, алкоксиалкил, гидроксиалкил, C₁-С₃алкилтиогруппу, S(O)С₁-С₃алкил, СF₃;

R₃ обозначает водород или СН₃СО-; и

R₄, R'₄, R₅, R'₅, R₆, R'₆, R₇ и R'₇ каждый независимо друг от друга обозначает водород, галоген, алкил, гидроксигруппу, алкоксигруппу, -COO(C₁-С₃алкил), СF₃, нитрогруппу, аминогруппу, ацетиламиногруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, алкилтиогруппу, C₁-С₃алкилтиогруппу или S(O)C₁-С₃алкил.

Ниже представлены ингибиторы протеинкиназы С формулы III:

в которой

R'₁ обозначает водород, С₁-С₄алкил, аминоалкил, моноалкиламиноалкил или диалкиламиноалкил;

R'₂ обозначает водород, алкил, алкоксиалкил, гидроксиалкил, C₁-С₃алкилтиогруппу, S(O)C₁-С₃алкил, СF₃;

R₃ обозначает водород или СН₃СО-;

R₄, R'₄, R₅, R'₅, R₆, R'₆, R₇ и R'₇ каждый независимо друг от друга обозначает водород, галоген, алкил, гидроксигруппу, алкоксигруппу, -COO(C₁-С₃алкил), СF₃, нитрогруппу, аминогруппу, ацетиламиногруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, алкилтиогруппу, C₁-С₃алкилтиогруппу или S(O)C₁-С₃алкил;

Х обозначает CR₈R₉, где R₈ обозначает (CH₂)_sR₁₀, где R₉ обозначает (CH₂)_sR₁₁, R₁₀ и R₁₁ каждый независимо друг от друга обозначает гидроксигруппу, алкоксигруппу, карбоксигруппу, ацилоксигруппу, аминогруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, триалкиламиногруппу, азидогруппу, ациламиногруппу, алкоксикарбонил, цианогруппу, амидиногруппу или аминокарбонил, и s обозначает 0, 1, 2 или 3; и

r обозначает 1, 2 или 3.

Ниже представлены ингибиторы протеинкиназы С формулы IV:

в которой

R₁ обозначает алкилгликозный остаток или группу формулы (g) или (h):

в которой n обозначает 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

R'₁ обозначает водород, C₁-С₄алкил, циклопропилметил, аминоалкил, моноалкиламиноалкил или диалкиламиноалкил;

R₂ и R'₂ каждый независимо друг от друга обозначает водород, алкил, алкоксиалкил, гидроксиалкил, C₁-С₃алкилтиогруппу, S(O)C₁-С₃алкил, СF₃;

R₃ обозначает водород или СН₃СО-; и

R₄, R'₄, R₅, R'₅, R₆, R'₆, R₇ и R'₇ каждый независимо друг от друга обозначает водород, галоген, алкил, гидроксигруппу, алкоксигруппу, -COO(C₁-С₃алкил), СF₃, нитрогруппу, аминогруппу, ацетиламиногруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, алкилтиогруппу, C₁-С₃алкилтиогруппу или S(O)C₁-С₃алкил.

Алкил, индивидуально или в комбинациях, может представлять собой алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, содержащую от 1 до 7, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода, такую как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, трет-бутил и пентил. «C₁-С₃алкил» обозначает алкил, который несет от одного до трех атомов углерода. Алкенил может представлять собой несущий от 2 до 7 атомов углерода углеводород с прямой или разветвленной цепью, который содержит одну или несколько двойных связей, предпочтительно одну или две двойные связи. Примерами алкенила являются этинилен, пропенилен, 1,3-бутадиенил и 1,3,5-гексатриенил.

Циклоалкил, индивидуально или в комбинациях, может представлять собой несущий от 3 до 7 атомов углерода циклоалкил, например циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.

Алкоксигруппа, индивидуально или в комбинациях, может представлять собой алкил, ковалентно связанный с помощью связи -О-. Примерами алкоксигрупп являются метоксигруппа, этоксигруппа, пропоксигруппа, изопропоксигруппа, бутоксигруппа и трет-бутоксигруппа. Алкоксиалкил может представлять собой, например, СН₃(СН₂)-О-(СН₂)_m, такой, например, как трет-бутоксикарбонил или ВОС.

Галоалкил может представлять собой алкил, несущий один или несколько, предпочтительно 1-3 атома галогена, например СН₂Сl, СF₃, СН₂СF₃, СН₂(СF₂)₂СF₃ и т.п.

Ацильный радикал ациламиногруппы или ациламиноалкилгруппы получают из алкановой кислоты, содержащей максимум 7, предпочтительно максимум 4 атома углерода, например ацетил, пропионил или бутирил, или из ароматической карбоновой кислоты, например бензоил. Ацилоксигруппа представляет собой группу, такую как ацил, связанный с помощью связи -О-, например ацетилоксигруппу, СН₃С(=O)O-. Ациламиногруппа представляет собой, например, СН₃(С=O)NН-(ацетиламиногруппу). Аналогично ациламиноалкил обозначает СН₃(С=O)NН(СН₂)_m-.

Арил, индивидуально или в комбинациях, может представлять собой незамещенную фенильную группу или фенильную группу, несущую один или несколько, предпочтительно от 1 до 3 заместителей, независимо друг от друга выбранных из группы, включающей галоген, алкил, гидроксигруппу, бензилоксигруппу, алкоксигруппу, галоалкил, нитрогруппу, аминогруппу, ациламиногруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, алкилтиогруппу, алкилсульфинил, алкилсульфонил и цианогруппу. Арилалкил предпочтительно обозначает бензил.

Галоген может представлять собой фтор, хлор, бром или йод.

Гетероциклическая группа, обозначенная как «Het» или «гетероциклил», может представлять собой стабильную, насыщенную, частично ненасыщенную или ароматическую 5- или 6-членную гетероциклическую группу. Гетероциклическое кольцо состоит из атомов углерода и 1-3 гетероатомов, независимо друг от друга выбранных из группы, включающей азот, кислород и серу. Гетероциклическая группа может быть замещена 1-3 заместителями, независимо друг от друга выбранными из группы, включающей галоген, алкил, гидроксигруппу, алкоксигруппу, галоалкил, нитрогруппу, аминогруппу, ациламиногруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, алкилтиогруппу, алкилсульфинил и алкилсульфонил, или, когда гетероциклильная группа представляет собой ароматическую азотсодержащую гетероциклическую группу, атом азота может нести оксидную группу. Примерами таких гетероциклильных групп являются имидазолил, имидазолинил, тиазолинил, пиридил, индолил, фурил и пиримидинил.

«Алкилгликозный остаток» может представлять собой гликозный радикал, связанный в положении С-1 с индолилом через С₂-С₄алкил. Гликозы, входящие в алкилгликозный остаток, могут представлять собой встречающиеся или не встречающиеся в естественных условиях несущие 5 или 6 атомов углерода сахара, предпочтительно выбранные из группы, включающей аллозил, алтрозил, глюкозил, маннозил, гулозил, идозил, галактозил, талозил, арабинозил, ксилозил, ликсозил, рамнозил, рибозил, дезоксифуранозил, дезоксипиранозил и дезоксирибозил. Гликоза может быть замещена азидогруппой, O-ацетилирована, O-метилирована, замещена аминогруппой, моно- и диалкиламиногруппой или замещена ациламиногруппой. Например, алкилгликозный остаток включает

Соединения формул I-IV могут находиться в свободной форме или в форме соли, например кислотно-аддитивной соли, например соли органической или неорганической кислоты, например могут представлять собой гидрохлорид, фосфат, ацетат, мезилат, цитрат или тартрат. Согласно изобретению соединения формул I-IV в свободной форме или в форме соли можно применять в форме гидрата или сольвата, в аморфной или кристаллической форме.

Особенно предпочтительными ингибиторами протеинкиназы С являются соединения формул Ia, Ib, IIа и IIIа или их соли.

Ниже представлены соединения формулы Iа:

в которой

R₁ обозначает водород, аминоалкил, моноалкиламиноалкил или диалкиламиноалкил;

R'₁ обозначает водород, C₁-С₄алкил, аминоалкил, моноалкиламиноалкил или диалкиламиноалкил; и

R₂ обозначает водород или метил.

Ниже представлены соединения формулы Ib:

в которой

R'₁ обозначает водород или C₁-С₄алкил;

Х обозначает CR₈R₉ или NR₈, где R₈ обозначает (CH₂)_sR₁₀, где R₉ обозначает (CH₂)_sR₁₁, R₁₀ и R₁₁ каждый независимо друг от друга обозначает водород, гидроксигруппу, аминогруппу, моноалкиламиногруппу или диалкиламиногруппу, и s обозначает 1; и

r обозначает 1 или 2.

Ниже представлены соединения формулы IIа:

в которой

R₁ обозначает

где либо s' обозначает 0 и R'₁₂ обозначает водород или C₁-С₄алкил; либо s' обозначает 1 и R'₁₂ обозначает пиридил, предпочтительно 2-пиридил, и

R'₁ обозначает водород, C₁-С₄алкил.

Ниже представлены соединения формулы IIIа:

в которой

R'₁ обозначает водород, алкил, аминоалкил, моноалкиламиноалкил или диалкиламиноалкил;

Х обозначает CR₈R₉ или NR₈, где R₈ обозначает (CH₂)_sR₁₀, где R₉ обозначает (CH₂)_sR₁₁, R₁₀ и R₁₁ каждый независимо друг от друга обозначает гидроксигруппу, карбоксигруппу, алкоксикарбонил, аминогруппу, моноалкиламиногруппу или диалкиламиногруппу, и s обозначает 0 или 1; и r обозначает 1 или 2.

Еще более предпочтительными соединениями являются 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-{(1-пиридин-2-илметил)пиперидин-4-ил}-1H-индол-3-ил]пиррол-2,5-дион, обозначенный также LY 317615 (обозначено далее как соединение А) и 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-(пиперидин-4-ил)-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-дион (обозначено далее как соединение Б), в свободной форме или в форме соли, например гидрохлорида.

Соединения формулы I, II, III и IV можно синтезировать с помощью известных в данной области методов, например, описанных в US 5545636.

Было установлено, что ингибиторы протеинкиназы С формулы I, II, III или IV и их фармацевтически приемлемые соли, гидраты или сольваты благодаря их обнаруженной активности, например способности ингибировать изоферменты протеинкиназы С, такие как протеинкиназа С β-1 и β-2, которые описаны, например, в US 5545636, можно применять для лечения состояний, связанных с сахарным диабетом и его осложнениями, а также других болезней, связанных с повышением уровней изоферментов β-1 и β-2, например ишемии, воспаления, заболеваний центральной нервной системы, сердечно-сосудистого заболевания, дерматологической болезни, болезни Альцгеймера и рака.

При создании изобретения было установлено, что ингибиторы протеинкиназы С формулы I, II, III или IV, например формулы Ia, Ib, IIа и IIIа, и их фармацевтически приемлемые соли, гидраты или сольваты можно применять для лечения и предупреждения отторжения трансплантата органа, ткани или клетки, например для лечения реципиентов плотных органов или тканей, например трансплантатов сердца, легкого, комбинированного трансплантата сердца-легкого, печени, почки, поджелудочной железы, кожи или роговицы, или клеток, например стволовых клеток или инсулинпродуцирующих клеток, например панкреатических островковых клеток. Они могут также быть показаны для предупреждения реакции «трансплантат против хозяина», например, после трансплантации костного мозга.

Конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения являются:

1.1. Способ лечения отторжения трансплантата органа, ткани или клетки, например отторжения трансплантата сердца, легкого, комбинированного трансплантата сердца-легкого, печени, почки, поджелудочной железы, кожи или роговицы, и для предупреждения реакции «трансплантат против хозяина» у индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве ингибитор протеинкиназы С формулы I, II, III или IV, например формулы Ia, Ib, IIа и IIIа, предпочтительно соединение А или Б или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват.

Кроме того, при создании изобретения было установлено, что ингибиторы протеинкиназы формулы I, II, III или IV, например формулы Iа, Ib, IIа и IIIa, и их фармацевтически приемлемые соли или сольваты можно применять для лечения и предупреждения аутоиммунных заболеваний, таких, например, как саркоидоз, фиброз легкого, идиопатическая интерстициальная пневмония, обструктивное заболевание дыхательных путей, включая такие состояния, как астма, наследственная астма, приобретенная астма, обусловленная пылью астма, прежде всего хроническая или трудноизлечимая астма (например, астма замедленного типа и гиперчувствительность дыхательных путей), бронхит, включая бронхиальную астму, юношескую астму, аллергический ревматоидный артрит, системная красная волчанка, синдром нефротической волчанки, тиреоидит Хасимото, рассеянный склероз, тяжелая псевдопаралитическая хромота, увеит, нефротический синдром, зависящий от стероидов, и устойчивый к стероидам нефроз, пустулезный акродерматит, аллергический энцефаломиелит, гломерулонефрит, псориаз, псориатический артрит, атопическая экзема (атопический дерматит), контактный дерматит и другие экзематозные дерматиты, себорейная экзема, красный плоский лишай, пузырчатка, буллезный пемфигоид, врожденный буллезный эпидермолиз, крапивница, ангионевротический отек, васкулиты, эритемы, кожные эозинофилии, угри, гнездная алопеция, эозинофильный фасцит, атеросклероз, конъюнктивит, кератоконъюнктивит, кератит, весенний конъюнктивит, увеит, связанный с болезнью Бехчета, герпетический кератит, коническая роговица, дистрофия роговицы эпителиальная, помутнение роговицы белого цвета, окулярная пузырчатка, разъедающая язва роговицы, склерит, серьезное внутриокулярное воспаление, воспаление слизистой оболочки или кровеносных сосудов, такие как опосредуемые лейкотриеном В4 заболевания, язвы желудка, сосудистое повреждение, вызванное ишемическими болезнями и тромбозом, ишемическое заболевание кишечника, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), некротизирующий энтероколит, болезни почек, включая интерстициальный нефрит, синдром Гудпасчера, гемолитический уремический синдром и диабетическая нефропатия, нервные заболевания, выбранные из группы, включающей дерматомиозит, болезнь Гийена-Барре, болезнь Меньера и радикулопатию, болезни, связанные с нарушением коллагена, включая склеродермию, гранулематоз Вегенера и синдром Шегрена, хронические аутоиммунные болезни печени, включая аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз и склерозирующий холангит, частичная резекция печени, острый некроз печени (например, некроз, вызванный токсинами, вирусным гепатитом, шоком или гипоксией), вирусный гепатит типа В, гепатит «не-А, не-В» и цирроз, быстро развивающийся гепатит, пустулезный псориаз, болезнь Бехчета, активный хронический гепатит, синдром Эванса, поллиноз, идиопатический гипопаратиреоз, болезнь Аддисона, аутоиммунный атрофический гастрит, волчаночный гепатит, тубулоинтерстициальный нефрит, мембранозный нефрит, боковой амиотрофический склероз или ревматическая атака, прежде всего воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), такие как болезнь Крона и неспецифический язвенный колит; боковой амиотрофический склероз (АМК); рассеянный склероз; ревматоидный артрит или гепатит С.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен:

1.2. Способ лечения или предупреждения аутоиммунных заболеваний, например, указанных выше, у индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что вводят указанному индивидууму ингибитор протеинкиназы С формулы I, II, III или IV, например формулы Ia, Ib, IIа и IIIa, или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват в терапевтически эффективном количестве.

В контексте настоящего описания понятия «обработка» или «лечение» оба относятся к профилактическому или превентивному лечению, а также к терапевтическому или изменяющему состояние болезни лечению, включая лечение пациентов, которые имеют риск нахождения в контакте с болезнью или для которых ожидается, что они могут иметь контакт с заболеванием, а также пациентов, которые уже больны или у которых поставлен диагноз, что они страдают заболеванием или медицинским состоянием.

Конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения являются также:

2. Ингибитор протеинкиназы С формулы I, II, III или IV, предпочтительно соединение А или Б, или его фармацевтически приемлемая соль, гидрат или сольват, предназначенный для применения в качестве иммунодепрессанта или иммуномодулятора, например, в указанных выше способах.

3. Ингибитор протеинкиназы С формулы I, II, III или IV, предпочтительно соединение А или Б, или его фармацевтически приемлемая соль, гидрат или сольват, предназначенный для приготовления фармацевтической композиции, которую применяют в качестве иммунодепрессанта или иммуномодулятора, например, в указанных выше способах.

4. Фармацевтическая композиция, предназначенная для применения в качестве иммунодепрессанта или иммуномодулятора, например, в указанных выше способах, которая содержит ингибитор протеинкиназы С формулы I, II, III или IV, предпочтительно соединение А или Б, или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми разбавителями или носителями.

Возможность применения соединений, предлагаемых в изобретении, для лечения и/или предупреждения указанных выше заболеваний и состояний можно продемонстрировать с помощью стандартных опытов на животных или клинических испытаний, которые описаны ниже.

In vitro: MLR (реакция лимфоцитов в смешанной культуре)

Для демонстрации иммуносупрессорного действия соединений, которые предназначены для применения в способе, предлагаемом в изобретении, использовали мышиную модель MLR, например, описанную у Т.Мео в «Immunological Methods», под ред. L. Lefkovits и В. Peris, Academic Press, NY, 1979, с.227-239. Селезеночные клетки (0,5×10⁶) из мышей линии Balb/c (самки, возрастом 8-10 недель) совместно инкубируют в течение 5 дней с 0,5×10⁶ облученных (2000 рад) или обработанных митомицином С селезеночных клеток мышей линии СВА (самки, возрастом 8-10 недель). Облученные аллогенные клетки индуцируют пролиферативный ответ в селезеночных клетках линии Balb/c, который можно оценивать по включению в ДНК меченого предшественника. Поскольку клетки-стимуляторы облучены (или обработаны митомицином С), они не отвечают на клетки линии Balb/c пролиферативным ответом, но сохраняют свою антигенность. Антипролиферативное действие соединений на клетки линии Balb/c оценивают с использованием различных разведений и рассчитывают концентрацию, приводящую к 50%-ному ингибированию клеточной пролиферации (IC₅₀). Установлено, что значение IC₅₀ для соединения Б составляет 195нМ.

In vitro: Анализ протеинкиназы С (ПКС)

Активность соединений, предлагаемых в изобретении, в отношении ПКС оценивают с помощью следующего метода. Анализ осуществляют в белых 384-луночных титрационных микропланшетах с прозрачным дном, которые не имеют связывающей поверхности. Реакционная смесь (25 мкл) содержит 1,5 мкМ тридекапептидный субстрат-акцептор, который имитирует последовательность псевдосубстрата ПКСα с заменой Аlа → Ser, 10 мкМ ³³Р-АТФ, 10 мМ Mg(NO₃)₂, 0,2 мМ CaCl₂, белок ПКС, концентрация которого варьируется от 25 до 400 нг/мл (в зависимости от применяемого изотипа), липидные пузырьки (содержащие 30 мол.% фосфатидилсерина, 5 мол.% DAG и 65 мол.% фосфатидилхолина) в конечной концентрации липида 0,5 мМ, в 20 мМ трис-НСl-буфере, рН 7,4+0,1% БСА. Инкубацию осуществляют в течение 60 мин при комнатной температуре. Реакцию прекращают, добавляя 50 мкл стоп-смеси (100 мМ ЭДТК, 200 мкМ АТФ, 0,1% Triton Х-100, 0,375 мг/лунку покрытых стрептавидином SPA-гранул в забуференном фосфатом физиологическом растворе, в присутствии Са, Mg или без них (w/o)). После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре суспензию перемешивают в течение 10 мин при 300×g. Включенную радиоактивность оценивают с помощью счетчика типа Trilux в течение 1 мин. Значения IC₅₀ определяют с помощью общепринятого метода путем инкубации ингибитора, полученная серийным разведением концентрация которого составляет от 1 до 1000 мкМ. Значения IC₅₀ рассчитывают из графика, полученного путем аппроксимации кривой с помощью программы XL fit^®.

В этом анализе установлено, что ингибирующее действие в отношении ПКС соединений, предлагаемых в изобретении, например соединения формулы IIа, характеризуется значением IC₅₀≤1 мкМ, предпочтительно ≤10 нМ. Например, ингибирующее действие соединения Б в отношении ПКСα характеризуется значением IC₅₀ 3,0 нМ, ПКСβ - значением IC₅₀ 2,0 нМ, ПКСδ - значением IC₅₀ 2,0 нМ и ПКСε - значением IC₅₀ 2,0 нМ.

In vivo: Трансплантация сердца кроликам

Комбинация применяемых линий: самцы линии Lewis (RT¹ - гаплотип) и линии DA (RT¹ - гаплотип). Животных анестезируют ингаляцией изофлуораном. После гепаринизации крысы-донора через брюшную нижнюю полую вену с одновременным обескровливанием через аорту открывают грудную клетку и сердце быстро охлаждают. На аорту накладывают лигатуру и рассекают дистально от первого ответвления, а плечеголовной ствол рассекают на уровне первой бифуркации. На левую легочную артерию накладывают лигатуру и рассекают, а правую сторону рассекают, но левую оставляют открытой. Все остальные сосуды не рассекают, накладывают на них лигатуру и отделяют и донорское сердце переносят в охлажденный на льду физиологический раствор.

Реципиента подготавливают путем рассечения и пережатия брюшной аорты в области под почкой и полой вены. Трансплантат имплантируют с помощью анастомоза «конец в бок», используя однонитчатый шовный материал 10/0, между плечеголовным стволом донора и аортой реципиента и правой легочной артерией донора и полой веной реципиента. Зажимы удаляют, трансплантат располагают ретроабдоминально, содержимое брюшной полости промывают теплым физиологическим раствором и животное зашивают и дают восстановиться под согревающей лампой. Срок жизнеспособности трансплантата оценивают путем ежедневного прошупывания пульсирующего сердца донора через брюшную стенку. Считается, что отторжение является полным, когда сердце перестает биться. У животных, которым вводили орально соединение формулы I, II, III или IV или его фармацевтически приемлемую соль или сольват в суточной дозе от 10 до 30 мг/кг дважды в день (bid), обнаружено удлинение срока жизнеспособности трансплантата. На этой модели удлинение срока жизнеспособности трансплантата на 14, 25, 26 дней обнаружено при использовании соединения А при его введении в дозе 30 мг/кг bid.

In vivo: Модель реакции «трансплантат против хозяина»

Селезеночные клетки (2×10⁷) из крыс линии Wistar/F инъецируют подкожно в подушечку правой задней лапы гибридных крыс линии (Wistar/F × Fischer 344) поколения F₁. Подушечку левой лапы не обрабатывают. Животных обрабатывают тестируемыми соединениями в течение 4 последовательных дней (0-3). Подколенные лимфатические узлы удаляют в день 7 и определяют разницу в массе двух соответствующих лимфатических узлов. Результаты выражают в виде ингибирования увеличения лимфатического узла (в процентах), сравнивая изменение массы лимфатического узла в экспериментальных группах и изменение массы соответствующих лимфатических узлов в группах животных, которые не обрабатывали тестируемым соединением. В этом анализе установлено, что соединение А при его введении в дозе 30 мг/кг bid ингибирует увеличение узла на 60-80%, предпочтительно 70-80%.

In vivo: Лечение рассеянного склероза: модель, полученная с использованием мышей линии SJL/J, хронического прогрессирующего экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ)

Иммунизация: в день 0 самок мышей линии SJL/J иммунизируют (подкожная инъекция в бок) с помощью 200 мкл инокулята, содержащего 500 мкг бычьего базального белка миелина (МВР), эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (CFA). В день 9 мышей подвергают второй бустер-инъекции МВР и дополнительно внутривенно вводят адъювант, содержащий 200 нг токсина В. ertussis. Конечную инъекцию токсином коклюша осуществляют в день 11.

У большинства иммунизированных МВР мышей серьезный приступ ЕАЕ проявляется к дню 21. За ним следует фаза восстановления, которая начинается примерно в день 25, во время которой у мышей отсутствуют симптомы в течение примерно 20 дней. Затем через 45-47 дней примерно у 50% животных начинается прогрессирующая фаза заболевания. Поэтому терапевтическое лечение тестируемыми соединениями начинают в день 21, когда наличие болезни полностью доказано, и продолжают до дня 70, если не указано иное. Рекомбинантный мышиный интерферон бета (INFβ, фирма Calbiochem/Biosciences) растворяют в физиологическом растворе и вводят путем внутрибрюшинной инъекции 3× в неделю. Соединения, предлагаемые в изобретении, например соединение А, вводят р.о. 5× в неделю путем кормления через желудочный зонд. Мышей в контрольной обработанной наполнителем группе иммунизируют МВР и обрабатывают водой.

Каждая экспериментальная группа состоит из мышей, у которых ежедневно оценивают клинические симптомы ЕАЕ. Фиксируют также коэффициент заболеваемости и день возникновения ЕАЕ. Клиническое проявление ЕАЕ оценивают с помощью балльной шкалы от 0 до 3. Все случаи связанной с болезнью гибели, произошедшей после начала лекарственной терапии, фиксируют, придавая им максимальный балл 3.

Суточные дозы, необходимые для воплощения на практике способа, предлагаемого в настоящем изобретении, должны зависеть, например, от применяемого соединения, хозяина, пути введения и серьезности состояния, подлежащего лечению. Предпочтительная суточная доза составляет от примерно 1 до примерно 1000 мг действующего вещества в виде однократной дозы или разделенных доз.

Соединения формулы I, II, III или IV, например формулы Ia, Ib, IIа или IIIa, можно вводить в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, например указанной выше соли. Такие соли можно получать общепринятым методом, и они обладают таким же уровнем активности, что соединения в свободной форме.

Соединения формулы I, II, III или IV, например формулы Iа, Ib, IIа или IIIa, предпочтительно соединение А или соединение Б, или их фармацевтически приемлемые соли или сольваты можно вводить в виде единственного действующего вещества или в сочетании с другими лекарственными средствами с целью иммуномодуляции, например для лечения или предупреждения острого или хронического отторжения алло- или ксенотрансплантата или аутоиммунного заболевания. Например, их можно применять в сочетании с ингибитором кальцинеурина, например с циклоспорином A, ISA Tx247, FK506, АВТ-281, ASM 981; ингибитором mTOR, например рапамицином, 40-O-(2-гидроксиэтил)рапамицином, CCI779, АВТ578 или рапалогом, например АР23573, АР23464, АР23675, АР23841, ТАРА-93, биолимусом 7 или биолимусом 9 и т.д.; кортикостероидами; циклофосфамидом; азатиопреном; метотрексатом; агонистом рецептора S1P, например FTY 720 или его аналогом; лефлуномидом или его аналогами; мизорибином; микофенольной кислотой или ее солью; например натриевой солью, микофенолятом мофетила; 15-дезоксиспергулином или его аналогами; иммуносупрессорными моноклональными антителами, например моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов, например ГКГ CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD27, В7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM), OХ40, 4-1BB, или их лигандами, например CD 154; или другими иммуномодуляторами, например рекомбинантными связывающими молекулами, которые несут по меньшей мере часть внеклеточного домена CTLA4 или его мутанта, например по меньшей мере внеклеточный фрагмент CTLA4 или его мутанта, связанный с не относящейся к CTLA4 белковой последовательностью, например CTLA4Ig (например, депонированный под номером АТСС 68629) или его мутант, например LEA29Y, или с другими ингибиторами молекул адгезии, например с МАт или низкомолекулярными ингибиторами, включая антагонисты LFA-1, антагонисты селектина и антагонисты VLA-4.

Согласно вышеизложенному следующими объектами настоящего изобретения являются:

5. Указанный выше способ, заключающийся в том, что совместно вводят, например одновременно или последовательно, в терапевтически эффективном количестве ингибитор протеинкиназы С формулы I, II, III или IV, например формулы Ia, Ib, IIа или IIIа, например соединение А или соединение Б, или их фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват и вторую лекарственную субстанцию, которая представляет собой иммунодепрессант или иммуномодулятор, например указанную выше субстанцию.

6. Терапевтическая комбинация, например набор, содержащий а) ингибитор протеинкиназы С формулы I, II, III или IV, например формулы Iа, Ib, IIа или IIIа, например соединение А или соединение Б, или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват и б) по меньшей мере один второй агент, выбранный из лекарственного средства, обладающего иммуносуппрессорным или иммуномодулирующим действием. Компонент а) и компонент б) можно применять одновременно или последовательно. Набор может включать инструкцию по его применению.

Когда ингибитор протеинкиназы С формулы I, II, III или IV, например формулы Iа, Ib, IIа или IIIа, или его фармацевтически приемлемую соль или сольват вводят в сочетании с другим лекарственным средством, обладающим иммуносуппрессорным или иммуномодулирующим действием, например, для предупреждения или лечения острого или хронического отторжения трансплантата или указанного выше аутоиммунного заболевания, дозы применяемого совместно иммуносуппрессанта или иммуномодулятора, естественно, должны зависеть от типа применяемого для совместного введения лекарственно средства, например от того, представляет оно собой стероид или циклоспорин, специфичности применяемого лекарственного средства, состояния, подлежащего лечению, или т.д.

Соединение А и соединение Б являются предпочтительными, прежде всего для применения с целью лечения или предупреждения отторжения трансплантата и предупреждения реакции «трансплантат против хозяина».

1. Применение соединения, выбранного из 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-{(1-пиридин-2-илметил)пиперидин-4-ил}-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-диона или 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-(пиперидин-4-ил)-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-диона или их фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения и предупреждения отторжения трансплантата органа или ткани и для предупреждения реакции «трансплантат против хозяина».

2. Применение соединения, выбранного из 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-{(1-пиридин-2-илметил)пиперидин-4-ил}-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-диона или 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-(пиперидин-4-ил)-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-диона или их фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата для лечения и предупреждения отторжения трансплантата органа или ткани и для предупреждения реакции «трансплантат против хозяина».

3. Фармацевтическая композиция, которая содержит (а) соединение, выбранное из 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-{(1-пиридин-2-илметил)пиперидин-4-ил}-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-диона или 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-(пиперидин-4-ил)-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-диона или их фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата и (б) по меньшей мере один второй агент, представляющий собой лекарственное средство, обладающее иммуносупрессорным или иммуномодулирующим действием.

4. Способ лечения, или предупреждения отторжения трансплантата органа или ткани или аутоиммунного заболевания, или для предупреждения реакции «трансплантат против хозяина» у индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве соединение, выбранное из 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-{(1-пиридин-2-илметил)пиперидин-4-ил}-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-диона или 3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-[1-(пиперидин-4-ил)-1Н-индол-3-ил]пиррол-2,5-диона, или их фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата.