Способ выделения нефтеокисляющих микроорганизмов из окружающей среды

Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает приготовление агаризованной минеральной питательной среды, в которую в процессе приготовления добавляют источник углеводорода в количестве 1,0-10,0 мас.% от количества среды, а также дополнительно вносят поверхностно-активные вещества в количестве 0,01-3,0 мас.% от количества среды, все компоненты перемешивают, а после застывания полученной однородной эмульсии поверхность последней засевают посевным материалом, отобранным с места загрязнения, для их длительного культивирования. Изобретение направлено на создание богатой углеводородами твердой питательной среды и позволяет достичь упрощения процесса выделения на ней чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов из проб окружающей среды, а также сохранения культуральных и биохимических свойств этих микроорганизмов в процессе длительного выращивания. 1 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к микробиологии и предназначено для выделения чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов из окружающей среды.

Ежегодное загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами приводит к экологическому и экономическому ущербу. На естественное восстановление загрязненных земель и водных поверхностей требуется десятки лет. При этом восстановление загрязненной среды без вмешательства извне практически невозможно. Существуют различные методы восстановления нефтезагрязненной среды.

Известен способ удаления нефтепродуктов с использованием нитчатых бактерий [Патент Японии 03461527, МКИ C02F 3/34] /1/, в котором в нефтепродуктах, разлитых на поверхности воды, диспергируют нитчатые бактерии и удаляют образующиеся шаровидные агломераты. Этот способ непригоден для обработки почв.

Известны различные химические методы удаления нефти. Например, известен способ удаления гидрофобных ароматических примесей из почвы [Патент США 5242598, МКИ C02F 1/40] /2/, заключающийся в обработке загрязненного материала органическими растворителями, взятыми в количестве 20-90% от массы материала, в который затем добавляют частицы пенополистирола в соотношении от 1:1 до 1:100. В результате происходит перераспределение примесей между материалом и пенополистиролом, который вместе с перешедшей в частицы частью примесей отделяют от очищенного материала. Данный процесс очень дорогостоящий и трудоемкий, в связи с чем и не нашедший практического применения.

Известен способ удаления нефти с поверхности воды [Патент Австрии №389691, МКИ C02F 1/40] /3/, заключающийся в опрыскивании пятен химическими составами, включающими жидкую эпоксидную смолу и кремнийорганические полимеры, вызывающие пенообразование и комкование частиц нефти, которые поддаются сбору. Способ непригоден для обработки почв, т.к. способствует вторичному загрязнению обрабатываемой поверхности.

Для удаления нефтяных пятен с поверхности морской воды используют диспергирующий состав, который содержит ПАВ, растворитель и соль моноалкилгуанидиния [Патент США 4623468, МКИ C02F 1/28] /4/. Способ также

непригоден для обработки почв.

Одним из наиболее перспективных методов борьбы с нефтерозливами является микробиологический способ очистки.

Учеными и практиками постоянно ведется работа по выделению эффективных нефтеокисляющих микроорганизмов, способных разлагать нефть и ее компоненты. В настоящее время зарегистрировано достаточное количество штаммов бактерий для очистки сред, загрязненных нефтью, например штамм бактерий Flavebacteril tirenicum ВКПМ В-3369 [Авт. свид. СССР 1409594, C12N 1/20] /5/, штамм бактерий Rhodococus erythropolis ВКМ Ас-1339Д [Авт. свид. СССР 1805097, C12N 1/20] /6/.

Во всех известных микробиологических способах очистки поверхности от нефти и нефтепродуктов формой применения штамма является лиофильно высушенная культура или культура, высушенная при помощи распылительной сушки, что приводит к резкой потере активности препарата. Использование энергоемких процессов (выделение и сушка) приводит к удорожанию процесса очистки.

Известен способ культивирования бактерий в процессе очистки сточных вод [Патент WO 02083577, МКИ C02F 1/28] /7/, в котором производится отбор пробы, загрязненной нефтью воды, которая засевается определенными микроорганизмами. Проба выдерживается в течение определенного времени, достаточного для размножения микроорганизмов, и возвращается в поток воды.

При применении штаммов, утилизирующих нефть, в различных регионах не всегда наблюдалась адаптация используемого штамма к конкретным источникам загрязнения. Было установлено, что при внесении в загрязненную почву ассоциации штаммов, которая способна разрушать нефть и нефтепродукты, но которая не свойственна экологическому сообществу конкретной почвы, "дикая" местная микрофлора создает ей серьезную конкуренцию, что приводит к замедлению процессов жизнедеятельности вносимой ассоциации, вплоть до ее гибели, т.е. происходит вытеснение местным, более сильным сообществом, адаптированным к данным источникам субстратов и геохимическим условиям. В настоящее время для очистки нефти используют аборигенные микроорганизмы, которые выделяют из мест загрязнения в каждом конкретном регионе, что позволило эффективнее и глубже утилизировать различные сложные субстраты, недоступные для монокультур. Определяющим в этом направлении являются различные способы выделения микроорганизмов, отобранных с мест загрязнения. В частности известны способы выделения нефтеокисляющих микроорганизмов на жидких питательных средах. Например, в способе рекультивации нефтезагрязненных земель [Б.Е.Чижов, В.И.Вавер, В.А.Долингер и др. (Лекции по рекультивации нефтезагрязненных земель в Ханты-Мансийском автономном округе. Тюменский Государственный университет. - 2000. - с.64-65] /8/ предлагают пробы грунта, воды, отобранные в местах разлива нефти, использовать в качестве посевного материала, и на жидкой минеральной среде с добавлением нефти и нефтепродуктов выделять аборигенные комплексы углеводородокисляющих микроорганизмов. Жидкая питательная среда позволяет получать комплексы углеводородокисляющих микроорганизмов.

Для выделения чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов используются плотные питательные среды. Известен способ отбора нефтеокисляющих бактерий-продуцентов биосурфактантов [Заявка РФ №2006115033, МКИ C12N 1/20] /9/, включающий культивирование нефтеокисляющих бактерий на плотной среде в чашках Петри при комнатной температуре в течение определенного времени, где в качестве плотной питательной среды для культивирования бактерий используют питательный агар следующего состава, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 24,0; натрий хлористый - 4,0; агар микробиологический - 12,0±2,0. Недостатком способа является высокая стоимость мясопептонного агара (МПА), что приводит к удорожанию процесса выделения чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов. Кроме того, на МПА, учитывая неселективность данной среды, растут не только углеводород-деградирующие микроорганизмы, а практически весь комплекс микроорганизмов, присутствующих в исследуемой пробе.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является, выбранный в качестве прототипа, лабораторный способ культивирования чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов на плотной минеральной среде [Родина А.Г. Методы водной микробиологии. - М.: Наука, 1965. - с.197] /10/. Эта минеральная среда включает все необходимые для развития микроорганизмов соли и не содержит никаких органических веществ. Для развития нефтеокисляющих микроорганизмов в такую среду необходимо введение какого либо углеводорода или нефти. Плотную минеральную среду готовят путем добавления к жидкой минеральной среде микробиологического агара в количестве 20 г на 1 л среды. Посевы исследуемого материала производят в чашки Петри, заливают тонким слоем расплавленной и охлажденной агаризованной минеральной среды, затем крышки чашек приоткрывают на несколько секунд, и на поверхность чашек наносят тонким слоем заранее простерилизованный источник углеводорода таким образом, чтобы получилось равномерное покрытие (не более 1,1 мм толщиной). Известен ряд сложных приемов для нанесения отдельных углеводородов тончайшим слоем.

Известный способ характеризуется сложностью и трудоемкостью процесса культивирования чистых культур микроорганизмов. Связано это с тем, что процесс нанесения тончайшего слоя углеводорода на поверхность среды, во-первых, представляет сложность в техническом исполнении, а во-вторых, позволяет вносить в питательную среду лишь микроколичества углеводородов (не более 1-2 мл/л что составляет 0,1-0,2 мас.%). Приготовленная таким способом питательная среда бедна углеводородами, которые являются питательными веществами для нефтеокисляющих микроорганизмов.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание богатой углеводородами твердой питательной среды, упрощение процесса выделения на ней чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов. Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе выделения нефтеокисляющих микроорганизмов из окружающей среды, включающем приготовление агаризованной минеральной питательной среды, внесение источника углеводорода, засев посевного материала, отобранного с мест загрязнения, и культивирование, согласно изобретению источник углеводорода добавляют в процессе приготовления агаризованной минеральной питательной среды в количестве 1,0-10,0 мас.% от количества среды, одновременно дополнительно вносят поверхностно-активные вещества в количестве 0,01-3,0 мас.% от количества среды, затем компоненты перемешивают, а после застывания полученной однородной эмульсии, где углеводород равномерно распределен по всему объему агаризованной минеральной среды, поверхность последней засевают посевным материалом.

В отличие от прототипа, в предлагаемом способе источник углеводородов вносится на стадии приготовления плотной питательной среды совместно с поверхностно-активными веществами (ПАВ), в присутствии которых источник углеводородов после перемешивания всех компонентов равномерно распределяется в агаризованной питательной среде путем эмульгирования. При этом количество углеводородов в такой среде может достигать 10,0 мас.%, т.е создается богатая углеводородами твердая питательная среда, более благоприятная для культивирования нефтеокисляющих микроорганизмов. При этом заявляемый способ, по сравнению с известным способом, более простой, несложен в техническом исполнении, а выход нефтеокисляющих бактерий высокий. Неизвестно выделение чистых культур нефтеокисляющих микроорганизмов на твердой питательной среде, в которой углеводороды равномерно распределены по всей толщине твердого питательного агара, благодаря введению в среду поверхностно-активных веществ, что является отличительным признаком предлагаемого способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят агаризованную минеральную питательную среду (плотную). В процессе приготовления плотной питательной среды добавляют нефть или фракции перегонки нефти или индивидуальные углеводороды в количестве 1,0-10,0 мас.% от количества среды, а также добавляют ПАВ в количестве 0,01-3,0 мас.%. Среду автоклавируют при 121°С в течение 15 мин. Компоненты тщательно перемешивают. Образуется однородная эмульсия, в которой углеводороды равномерно распределены по всей толщине агара. Эмульсию разливают в культуральные емкости - чашки Петри, где она застывает в виде равномерно распределенной эмульсии. Затем засевают исследуемый (посевной) материал, отобранный из мест загрязнения, из которого необходимо выделить чистые культуры нефтеокисляющих микроорганизмов. Исследуемый (посевной) материал - это пробы грунта, воды, либо других материалов, отобранные как в местах загрязнения нефтепродуктами, так и любых других местах, а также пробы сточных вод любого происхождения, смывы с поверхностей и любые жидкости или твердые вещества, которые обычно используются в качестве исследуемого (посевного) материала.

Чашки с посевами инкубируют в термостате при 25°С в течение 7 суток. Для каждого посева подсчитывают среднее число колоний. Микроорганизмы, неспособные к утилизации нефти, не могут расти на данной среде. Нефтеокисляющие микроорганизмы, напротив, будут расти на ней, так как способны деградировать нефть, которая входит в состав данной питательной минеральной среды в качестве единственного источника углеводорода.

Экспериментально был проведен подбор оптимального количества ПАВ в питательной среде, а также максимального количества внесенных в такую среду углеводородов и, в зависимости от внесенных компонентов, проведена сравнительная характеристика роста нефтеокисляющих микроорганизмов.

В экспериментах в качестве источника углеводорода использовались сырая нефть (Октябрьское месторождение, скважина №41, пласт XXII), нефтепродукты (дизельное топливо, мазут). В качестве поверхностно-активных веществ (ПАВ) использовались неионные ПАВ - Tween 80, тритон X100 и анионный детергент дезоксихолат натрия. Исследуемым материалом (объектом исследования) служил экстракт донных отложений, отобранных на месте аварии танкера в Керченском проливе в ноябре 2007 г. (доза посевного материала составляла 0,01 мл). Для этого готовили суспензию посевного материала с использованием стандарта мутности в 10 единиц (концентрация микробных клеток в 1 млрд) и ее десятикратные серийные разведения (по 6 разведений включительно). Из 6 разведений высевали по 0,1 мл суспензии прямым посевом на чашки с агаризованной питательной средой. Из каждого разведения делали по три таких посева.

Пример 1. Контроль (прототип). В процессе экспериментов использовался водный раствор питательной минеральной среды Ворошиловой и Диановой, содержащей следующие компоненты, в г/л:

NH4NO3	1,0
K2HPO4	1,0
KH2PO4	1,0
MgSO4·7H2O	0,2
CaCl2·6Н2О	0,02
FeCl3·6Н2О (насыщенный раствор)	2 капли
Дистиллированная вода	1,0 л

В эту среду добавлялся агар микробиологический в количестве 20 г на 1 литр среды. Чашки Петри заливали тонким слоем расплавленной и охлажденной агаризованной питательной среды. Затем крышки чашек приоткрывали на несколько секунд, и на поверхность застывшей среды наносили тонким слоем заранее простерилизованный источник углеводорода в количестве 2 мл на 1 л среды, что составляет 0,2 мас.%, таким образом чтобы получилось тончайшее равномерное покрытие. В чашки Петри засевали исследуемый материал. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 25°С в течение 7 суток. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний нефтеокисляющих микроорганизмов, выросших на трех чашках. Данные приведены в таблице.

Пример 2. Готовили водный раствор питательной минеральной среды Ворошиловой и Диановой, в которую добавляли агар микробиологический в количестве 20 г на литр, источник углеводородов в количестве 10 мл на литр (1,0 мас.%), а также добавляли поверхностно-активные вещества (ПАВ) в количестве 0,05 г на литр (0,005 мас.%). Среду автоклавировали при 121°С в течение 15 мин, интенсивно перемешивали после автоклавирования и немедленно разливали в чашки Петри. В этом эксперименте эмульсия практически не образуется. Получали твердую питательную среду, в которой углеводород был неравномерно распределен по всему объему среды, и, преимущественно, находился в виде жидкости на ее поверхности. После застывания агаризованной среды на ее поверхность засевали культуры микроорганизмов. При этом в одну часть чашек Петри засевали исследуемый материал, как описано в примере 1. Чашки с посевами инкубировали в термостате при температуре 25°С в течение 7 суток. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний. Результаты эксперимента показали отсутствие роста нефтеокисляющих микроорганизмов. Засеянные микроорганизмы были неспособны к росту на данной среде, т.к. на поверхности данной плотной питательной среды находился толстый слой жидкого концентрированного источника углеводорода. Данные приведены в таблице.

Пример 3. Агаризованную питательную среду готовили так же, как и в примере 2, но ПАВ добавляли в количестве 1 г на 1 л питательной среды (0,1 мас.%), и источник углеводорода в количестве 10 мл на 1 л среды (1,0 мас.%). Среду автоклавировали при 121°С в течение 15 мин, затем интенсивно перемешивали до получения равномерной эмульсии и немедленно разливали в чашки Петри. При таком соотношении компонентов получали питательную агаризованную среду, в которой углеводород был равномерно распределен по всему ее объему. В чашки Петри на равномерно застывшую эмульсию засевали исследуемый материал, как описано в примере 1. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 25°С в течение 7 суток. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний. Данные приведены в таблице.

Пример 4. Агаризованную питательную среду готовили так же, как и в примере 2, но ПАВ добавляли в количестве 10 г на 1 л (1,0 мас.%) питательной среды, а источник углеводорода в количестве 50 мл (5,0 мас.%). Полученную эмульсию разливали в чашки Петри. После застывания эмульсии в чашки Петри засевали исследуемый материал, как в примере 1. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 25°С в течение 7 суток. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний. Данные приведены в таблице.

Пример 5. Агаризованную питательную среду готовили аналогично примеру 2, но ПАВ добавляли в количестве 30 г на 1 л питательной среды (3,0 мас.%), а источник углеводорода в количестве 100 мл (10 мас.%). Полученную эмульсию разливали в чашки Петри. После застывания эмульсии в чашки Петри засевали исследуемый материал, как описано в примере 1. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 25°С в течение 7 суток. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний. Данные приведены в таблице.

Пример 6. Агаризованную питательную среду готовили так же, как и в примере 2, но ПАВ добавляли в количестве 50 г на 1 л питательной среды (5 мас.%) и источник углеводорода в количестве 100 мл (10 мас.%). Эмульсию разливали в чашки Петри. После застывания агаризованной питательной среды в чашки Петри засевали исследуемый материал, как описано в примере 1. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 25°С в течение 7 суток. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний. В этом эксперименте увеличение ПАВ привело к угнетению роста микроорганизмов. Данные приведены в таблице.

Содержание углеводородов в среде и интенсивность роста нефтеокисляющих микроорганизмов в зависимости от содержания ПАВ
№	Исследуемый материал, мл	Содержание ПАВ, мас.%	Содержание углеводородов, мас.%	Интенсивность роста микроорганизмов, КОЕ/г
1	0,01	0	0,2	15-17
2	0,01	0,005	1,0	0
3	0,01	0,01	1,0	27-31
4	0,01	1,0	5,0	46-50
5	0,01	3,0	10,0	21-25
6	0,01	5,0	10,0	6-8

Из данных, приведенных в таблице, видно, что добавление ПАВ в количестве 0,01-3,0 мас.% позволяет обогащать агаризованную питательную среду углеводородом от 1,0 до 10,0 мас.%, что в 5-50 раз превышает возможность добавления углеводорода в агаризованную питательную среду в прототипе. При этом количество микроорганизмов, выросших на предлагаемой питательной среде, в 2-3 раза превышает количество нефтеокисляющих микроорганизмов, выросших на средах, не содержащих ПАВ. Это позволяет сделать вывод о явных преимуществах предлагаемого способа выделения нефтеокисляющих микроорганизмов на плотных агаризованных средах, в которых углеводороды равномерно распределены по всему объему твердой питательной среды в результате добавления поверхностно-активных веществ. При этом ПАВ добавляется в количестве 0,01-3,0 мас.% от количества питательной среды, а источник углеводорода может вводиться в количестве 1,0-10,0 мас.% от количества питательной среды.

Если в прототипе количество добавленного источника углеводорода не может превышать 1,0-2,0 мл на 1 л минеральной среды, то в предлагаемом изобретении количество источника углеводорода возрастает до 100 мл на 1 л минеральной среды, т.е. создается богатая углеводородами питательная среда. При этом процедура внесения углеводородов несложна, что значительно упрощает выделение нефтеокисляющих микроорганизмов на таких средах.

Источники информации

1. Патент Японии 03461527, МКИ C02F 3/34.

2. Патент США 5242598, МКИ C02F 1/40.

3. Патент Австрии №389691, МКИ C02F 1/40.

4. Патент США 4623468, МКИ C02F 1/28.

5. Авт. свид. СССР 1409594, C12N 1/20.

6. Авт. свид. СССР 1805097, C12N 1/20.

7. Патент WO 02083577, МКИ C02F 1/28.

8. Б.Е.Чижов, В.И.Вавер, В.А.Долингер и др. Лекции по рекультивации нефтезагрязненных земель в Ханты-Мансийском автономном округе. Тюменский Государственный университет. - 2000. - с.64-65.

9. Заявка РФ №2006115033, МКИ C12N 1/20.

10. Родина А.Г. Методы водной микробиологии. - М.: Наука, 1965. - С.197. - прототип.

Способ выделения нефтеокисляющих микроорганизмов из окружающей среды, включающий приготовление агаризованной минеральной питательной среды, внесение источника углеводорода, засев посевного материала, отобранного с места загрязнения, культивирование, отличающийся тем, что источник углеводорода добавляют в процессе приготовления агаризованной минеральной среды в количестве 1,0-10,0 мас.% от количества среды, одновременно дополнительно вносят поверхностно-активные вещества в количестве 0,01-3,0 мас.% от количества среды, затем все компоненты перемешивают, а после застывания полученной однородной эмульсии, где углеводород равномерно распределен по всему объему агаризованной минеральной среды, поверхность последней засевают посевным материалом.