Набор для количественного определения авермектинов методом одностадийного конкурентного иммуноферментного анализа

Набор реагентов для количественного определения авермектинов содержит конъюгат ивермектина с бычьим сывороточным альбумином, иммобилизованный на полистироловом планшете, пероксидазный конъюгат высокоспецифических мышиных моноклональных антител к ивермектину, калибровочные пробы ивермектина (с конентрациями от 0 до 100 нг/мл). Моноклональные антитела (МКАТ), входящие в набор, продуцируются штаммом гибридных культивируемых клеток Mus. Musculus L., депонированным в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского под №05/09. Из неспецифических компонентов набор содержит буфер для разведения конъюгата МКАТ с пероксидазой хрена, буфер для разведения анализируемых проб и промывки планшетов, реагенты для выявления пероксидазной активности, субстратный раствор, перекись водорода и тетраметилбензидин, стоп-раствор (1 М серная кислота). Набор по изобретению предназначен для выявления остаточных количеств авермектинов в тканях и биологических жидкостях для контроля химической контаминации продуктов животноводства. Использование набора позволяет определить основные компоненты авермектинового комплекса в продуктах животного происхождения в диапазоне концентраций 0,15-100 нг/мл(г), обеспечивая при этом высокую чувствительность и специфичность выявления. 1 ил. 2 табл.

 

Изобретение относится к области диагностики, токсикологии и биотехнологии, в частности к получению тест-систем для определения остаточных количеств авермектинов в продуктах животного происхождения с помощью иммуноферментного анализа ИФА, и может быть использовано для детекции соединений авермектинового семейства в биологических жидкостях и тканях животных, санитарно-гигиенической оценки пищевых продуктов и продовольственного сырья.

Авермектины представляют собой семейство структурно родственных соединений, обладающих широким спектром действия и высокой акарицидной, инсектицидной и антигельминтной активностями. Препараты этого класса антибиотиков широко используются в ветеринарной практике и агрономии в качестве антипаразитарного и антигельминтного средства (Putter I., MacConnel J.D., Preiser F.A. et al. Avermectins: novel insecticides, acaricides and nematocides from a soil microorganism // Experientia, 1981; v.37, p.963-964).

Природные авермектины синтезируются микроорганизмами из рода Streptomyces avermitilis при культивировании в глубинных условиях в виде комплекса из восьми близких по строению индивидуальных соединений, получивших обозначения A_1a, A_1b, A_2a, A_2b, B_1a, B_1b, B_2a и B_2b (патент GB 1573955, 1980). Все авермектины по химическому строению являются 16-членными макроциклическими лактонами (сложными эфирами гидроксиловой кислоты) и отличаются между собой радикалами-заместителями у 5 и 26 атомов углеродного кольца. Производные авермектинов получают также традиционными методами химического синтеза.

В ветеринарной практике нашли применение как авермектиновый комплекс в целом (аверсектин), так и индивидуальные авермектины, содержащиеся в препаративной форме в определенных сочетаниях (абамектин, ивермектин и др.). Наиболее активными являются авермектины B₁, особенно 22, 23-дигидроавермектин B₁, получивший название ивермектин. Ивермектин состоит из основного компонента - 22, 23 - дигидроавермектина B_1a и минорного компонента - 22, 23 - дигидроавермектина B_1b, содержащегося в смеси в количестве не более 20%.

Помимо высокой антипаразитарной активности авермектины отличаются токсичностью и способностью аккумулироваться в молоке, органах и тканях животных, что создает угрозу попадания авермектинов в пищу человека. Допустимая суточная доза ивермектина для человека, по заключению CVMP (Committee For Veterinary Medicinal Products - европейский комитет по медикаментам, используемых для животных), составляет 1 мкг/кг массы тела. В связи с этим, предъявляются высокие требования к содержанию остаточных количеств ивермектина и других соединений этой группы в пищевых продуктах и продовольственном сырье, что вызывает необходимость создания точных и чувствительных тест-систем для контроля уровня авермектинов в тканях и биологических жидкостях сельскохозяйственных животных.

Большинство известных способов определения остаточных количеств ивермектина и других авермектинов в биоматериале основаны на различных модификациях метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Методические указания: МУК 4.1.1821-03 «Определение остаточных количеств ивермектина в печени, почках, мясе, жире сельскохозяйственных животных и молоке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, утв. Главным государственным санитарным врачем РФ 18.12.2003 г.; патент RU №2207547, G01N 21/64, опубл. 27.06.2003).

Однако метод ВЭЖХ имеет ряд недостатков, ограничивающих его широкомасштабное применение, к которым относятся высокая стоимость используемого оборудования, сложность приготовления проб для анализа, необходимость привлечения высококвалифицированных специалистов, а также низкая скорость проведения анализа.

Более предпочтительным методом определения авермектинов является иммуноферментный анализ (ИФА), к преимуществам которого относится высокая специфичность, скорость и простота постановки реакции, сравнительно невысокая стоимость и универсальность применяемого оборудования, возможность автоматизации процедуры анализа (Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа // М.: Высш. шк. 1991).

В настоящее время фирмы, специализирующиеся на производстве средств для молекулярно-биологической диагностики, выпускают коммерческие наборы реагентов для проведения ИФА с целью контроля содержания соединений авермектинового ряда в продуктах растительного и животного происхождения после применения препаратов, содержащих авермектины.

Так, компания Eurodiagnostica B.V. (Голландия) предлагает ИФА-набор Ivermectin EIA для количественного определения ивермектина, содержащий иммобилизованные на поверхности иммунологического планшета антитела к IgG кролика, буфер для разведения проб, промывочный буфер, субстратный раствор, стоп-раствор, ивермектин, конъюгированный с пероксидазой хрена (Конъюгат), кроличьи поликлональные антитела к ивермектину, 7 калибровочных проб с различными концентрациями ивермектина. Принцип определения авермектинов с помощью данной тест-системы заключается в конкурентном взаимодействии свободного ивермектина и конъюгата ивермектин-пероксидаза со специфическими кроличьими поликлональными антителами к ивермектину и последующем связывании полученного комплекса иммобилизованными на планшете антителами к IgG кролика. Пероксидазная активность связанного конъюгата определяется после добавления хромоген-субстратного буфера по изменению оптической плотности при 450 нм. Величина оптической плотности обратно пропорциональна количеству ивермектина в пробе. Набор позволяет определять ивермектин в экстрактах тканей, молоке и моче животных с чувствительностью 10 нг/мл (List of EURO-DIAGNOSTICA products: Ivermectine EIA, cat. code 5141IVERlp © 2008 ELISA Technologies, Inc).

Недостатками данного набора являются относительно невысокая чувствительность для ивермектина (10 нг/мл), узкая специфичность (эффективность детекции других авермектинов от 13 до 17% относительно ивермектина) и сложность синтеза конъюгата ивермектин-пероксидаза.

Компания Jiudingyang Technology Co., Ltd. (КНР) выпускает набор Competitive Enzyme Immunoassay Kit for Quantitative Analysis of Avermectins (AVMS), содержащий иммобилизированный на поверхности иммунологического планшета антиген, 6 калибровочных проб с различными концентрациями авермектинов, концентрированный стандартный раствор, меченные пероксидазой вторичные антитела, раствор антител к авермектину, раствор хромогена, раствор субстрата, стоп-раствор, концентрат промывочного буфера, концентрат буфера для разведения проб. Определение авермектинов в исследуемых образцах основано на конкурентном взаимодействии антител к авермектину с антигенами, находящимися в жидкой фазе и иммобилизованными на планшете. При отсутствии антигена в пробе антитела связываются с иммобилизованным антигеном; при наличии в пробе свободного антигена, связывание антител с иммобилизованным антигеном снижается. Связавшиеся антиавермектиновые антитела детектируются с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой. Пероксидазная активность определяется после добавления хромоген-субстратного буфера по изменению оптической плотности при 450 нм. Величина оптической плотности обратно пропорциональна количеству авермектина в пробе. Набор позволяет определять авермектин в экстрактах тканей животных и растений с чувствительностью 0,5 нг/мл (ELISA Kits for Food and Feed Safety: AVMs (Avermectin, Ivermectin, abamectin) ELISA kit, product number 246-1602008 Gentaur Molecular Products).

Недостатками данного набора являются низкая эффективность детекции ивермектина (33% относительно авермектина), наличие дополнительной стадии анализа из-за использования немеченых антиавермектиновых антител, неприспособленность тест-системы для анализа авермектинов в молоке.

Наиболее близким аналогом является набор для определения методом иммуноферментного анализа, включающий иммуносорбент на основе иммобилизованных на планшетах меченных ферментом антител овцы к антителам мыши, меченный ферментом антиген, моноклональные антитела мыши к авермектину, стандартный раствор к авермектину, промывочный раствор, буфер для разведения проб, раствор хромогена и стоп-реагент (Патент CN №100501407, G01N 33/577, опубл. 17.06.2009).

Однако анализ, предусматривающий использование известного набора, является длительным, т.к. проводится в несколько стадий, требует необходимости получения двух типов антител: антивидовых поликлональных против иммуноглобулинов мыши и мышиных моноклональных против авермектинов, что усложняет технологию изготовления набора.

Другой недостаток заключается в том, что используемые в составе набора антивидовые поликлональные антитела являются гетерогенными по специфичности, титру и аффинности, что не позволяет достичь необходимой точности и воспроизводимости анализов.

Задачей изобретения является разработка высокоспецифичной и стандартной отечественной ИФА тест-системы для количественного определения авермектинов в биологических жидкостях, тканях животных, пищевых продуктах и продовольственном сырье.

Технический результат изобретения заключается в повышении чувствительности и точности анализов, расширении количества выявляемых соединений авермектинового семейства, а также сокращении стадий анализа и его продолжительности, простоте и удобстве в применении и расчете концентрации авермектинов, снижении себестоимости изготовления набора и повышении его стабильности.

Технический результат изобретения достигается за счет использования в составе компонентов набора новых моноклональных антител к ивермектину, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L., депонированным в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 05/09.

Отечественный штамм гибридомы, продуцирующий моноклональные антитела (МКА) для количественного определения различных индивидуальных соединений авермектинового семейства, получен нами впервые и является предметом изобретения по заявке на изобретение №2009135982. Моноклональные антитела к ивермектину, продуцируемые новым штаммом, обладают специфичностью и сродством к основным компонентам авермектинового комплекса, что в свою очередь дает возможность определять различные авермектины в биологических жидкостях и тканях животных, пищевых продуктах и продовольственном сырье животного и растительного происхождения.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Набор для количественного определения авермектинов методом одностадийного конкурентного иммуноферментного анализа содержит следующие компоненты:

1. Иммуносорбент - полистироловый стрипованный иммунологический 96-луночный планшет с адсорбированным в лунках конъюгатом ивермектина с бычьим сывороточным альбумином (ивермектин - БСА), готовый к употреблению;

2. Семь калибровочных проб, содержащих ивермектин в концентрациях 0; 1; 5; 10; 20; 50 и 100 нг/мл, жидкие, готовые к употреблению;

3. Буфер для промывки планшетов - фосфатно-солевой буфер, содержащий неионный детергент Твин-20 (ФСБТ), жидкий 20-кратный концентрат;

4. Буфер для разведения проб и конъюгата (БРК) - фосфатно-солевой буфер, содержащий неионный детергент Твин-20 и бычий сывороточный альбумин (БСА), жидкий, готовый к употреблению;

5. Конъюгат моноклональных антител к ивермектину, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L., депонированным в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 05/09, с пероксидазой хрена, жидкий 50-кратный концентрат;

6. Субстратный раствор (СР) - стабилизированная перекись водорода, жидкий, готовый к употреблению;

7. Раствор хромогена - тетраметилбензидин (ТМБ), жидкий, готовый к употреблению;

8. Стоп-реагент - 1 М раствор серной кислоты, жидкий, готовый к употреблению.

Принцип определения авермектинов с помощью предлагаемого ИФА-набора заключается в конкурентном взаимодействии конъюгированных с пероксидазой моноклональных антител к ивермектину (конъюгат) с ивермектином, находящимся в жидкой фазе и иммобилизованным на планшете в комплексе ивермектин-БСА. При отсутствии ивермектина в пробе конъюгат связывается только с ивермектином, иммобилизованным на планшете; при наличии в пробе свободного ивермектина часть конъюгата связывается со свободным ивермектином, в результате чего связывание конъюгата с иммобилизованным ивермектином снижается. Пероксидазная активность определяется после добавления хромоген-субстратного буфера (H₂O₂-ТМБ) по изменению оптической плотности при 450 нм. Величина оптической плотности обратно пропорциональна количеству свободного ивермектина в исследуемой пробе.

Время анализа - не более 1 ч.

Набор рассчитан на проведение на одном планшете одновременного анализа 41 исследуемой пробы биоматериала (в 2 повторах) и семи калибровочных проб (в 2 повторах). Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала.

Набор характеризуется хорошей воспроизводимостью и достоверностью результатов (коэффициент вариации 5,1-12,4%). Диапазон определяемых концентраций составляет 0,15-100 нг/мл авермектинов в исследуемом образце. Предел чувствительности набора составляет 0,15 нг/мл авермектинов. Срок годности набора - 1 год в условиях хранения при температуре 2-8°C.

Чувствительность набора не изменяется при хранении в течение 1 года при температуре 2-8°C.

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Приготовление компонентов набора.

Приготовление компонентов предлагаемого ИФА-набора осуществляется следующим образом.

1. Получение иммуносорбента.

Берут стандартные 96-луночные (12×8) плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа (фирмы «Greiner», Германия или любой другой с аналогичными характеристиками). В лунки каждого планшета вносят иммуноэлектрофоретически чистый препарат ивермектина, конъюгированного с бычьим сывороточным альбумином (ивермектин - БСА), разведенный в 0,1М карбонатном буфере (pH 9,5) до концентрации 10 мкг/мл и инкубируют при температуре 4°C в течение 18 час. По окончании инкубации лунки планшетов промывают 5 раз ФСБТ. Планшеты высушивают на воздухе, упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно под вакуумом и используют при комплектовании набора.

2. Приготовление калибровочных проб.

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мг ивермектина, растворяют в 50-70 мл этанола, доводят этанолом до метки, тщательно перемешивают. Получают раствор с концентрацией ивермектина 100 мкг/мл. Далее из этого раствора путем последовательных разбавлений в буфере ФСБТ получают раствор с концентрацией ивермектина 1 мкг/мл, который служит для приготовления 6 калибровочных проб.

Калибровочные пробы (1; 5; 10; 20; 50 и 100 нг/мл) готовят объемным методом путем последовательного разбавления полученного стандартного раствора. Далее калибровочные растворы разливают во флаконы и используют при комплектовании набора.

3. Приготовление буфера для промывки планшетов (ФСБТ), (20-кратный концентрат);

Готовят буферный раствор следующего состава:

Na2HPO4×12H2O	61,0 г/л
NaH2PO4×2H2O	3,6 г/л
NaCl	175,6 г/л
Твин 20	20 мл
Мертиолят	0,5 г/л
Деионизованная вода	до 1 л.

Соли последовательно растворяют в 0,8 л деионизованной воды при перемешивании, доводят pH до 7,4, добавляют остальные компоненты, перемешивают и доводят объем до 1 л деионизованной водой.

Разливают во флаконы и используют при комплектовании набора.

4. Приготовление буфера для разведения проб и конъюгата (БРК).

Готовят раствор следующего состава:

Na2HPO4×12H2O	3,05 г/л
NaH2PO4×2H2O	0,18 г/л
NaCl	8,78 г/л
БСА	5,0 г/л
Твин 20	1,0 мл/л
Мертиолят	0,5 г/л
ЭДТА	2,0 г/л
Фенол	0,5 г/л
0,1% феноловый красный	1,0 г/л
Деионизованная вода	до 1 л.

Соли последовательно растворяют в 0,8 л деионизованной воды при перемешивании, доводят pH до 7,4, последовательно добавляют остальные компоненты, перемешивают и доводят объем до 1 л деионизованной водой.

Разливают во флаконы и используют при комплектовании набора.

5. Получение конъюгата МКА к ивермектину.

Для приготовления конъюгата используют МКА, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L., депонированным в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 05/09.

Характеристика продуцируемых МКА к ивермектину:

- мишень - соединения авермектинового ряда;

- специфичность связывания с ивермектином - 100% в конкурентном ИФА;

- перекрестная иммунореактивность к абамектину, авермектину, аверсектину составляет соответственно 50%, 95% и 44% по сравнению с ивермектином в аналогичной концентрации;

- изотип продуцируемых иммуноглобулинов - IgG1 (ИФА, тест-система «Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit» («Sigma», США).

Для получения больших количеств антител штамм гибридомы выращивают in vivo в виде трансплантируемой опухоли у мышей BALB/c, предварительно (за 14 дней до введения клеток) обработанных внутрибрюшинно 2, 6, 10, 14-тетраметилпентадеканом (Pristane) («Sigma», США) в количестве 0,3-0,5 мл/животное.

Асцитные жидкости, содержащие МКА, получают через 7-15 дней после введения 5-10 млн гибридомных клеток в брюшную полость праймированных мышей линии BALB/c.

МКА очищают из асцитной жидкости методом аффинной хроматографии на Белок-А-агарозе. Для этого сухой коммерческий продукт (Белок-А-агароза, Sigma, США) замачивают в ФСБТ (соотношение вес/объем=1/10) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа при перемешивании на шейкере. После прекращения перемешивания отбирают 2 мл густой смолы из осадка и к полученной суспензии добавляют 5-10 мл асцитной жидкости, разведенной в 3 раза ФСБТ. Полученную суспензию инкубируют в течение 2 час при перемешивании на шейкере. Затем суспензию переносят в хроматографическую колонку и промывают ФСБТ до полного удаления несвязавшегося белка на хроматографе BioLogic LP System (Bio-Rad, США). Концентрацию белка в элюате в процессе хроматографии определяют спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм. Фракцию IgG элюируют глициновым буфером, рН 3,0, нейтрализуют 0,1 N NaOH и диализуют против 0,1М карбонатного буфера, рН 9,5.

Из 1 мл асцитной жидкости получают 5-10 мг МКА. Электрофоретическая чистота выделенных таким образом МКА составляет 95-98%.

Полученный продукт используют для синтеза конъюгата с пероксидазой хрена. Для этого к 1 мл водного раствора пероксидазы (концентрация 4 мг/мл, RZ не менее 3) добавляют 200 мкл 0,1 М водного раствора NaIO₄ и перемешивают на шейкере 20 мин при комнатной температуре в темноте. Активированную таким образом пероксидазу диализуют в течение ночи против 0,001М ацетата натрия. Затем к 1 мл полученного раствора пероксидазы добавляют 1 мл раствора МКА с концентрацией 8 мг/мл в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,5, доводят pH до 9,5 0,4 М карбонатным буфером и инкубируют 2 часа при комнатной температуре в темноте. После этого добавляют 0,1 мл водного раствора NaBH₄ (концентрация 4 мг/мл) и диализуют против ФСБ в течение 18 час. После диализа осаждают иммуноглобулин сульфатом аммония до 50% насыщения, диализуют против ФСБ для удаления сульфата. Полученный конъюгат разводят в 2 раза глицерином и хранят при -20°C.

50-кратный концентрат конъюгата для набора (с титром МКА 1:5000-1:50000) разливают по флаконам и используют при комплектовании набора.

6. Приготовление субстратного раствора (СР).

Берут 5,12 г лимонной кислоты, 9,14 г Na₂HPO₄×2H₂O, растворяют в 1 л деионизованной воды, добавляют 0,25 мл 30% перекиси водорода, перемешивают. Доводят pH до 5,0, разливают во флаконы и используют при комплектовании набора.

7. Приготовление раствора хромогена (ТМБ).

Берут 0,1 г тетраметилбензидина и растворяют в 100 мл этанола при 50°C. Раствор охлаждают до комнатной температуры, разливают во флаконы и используют при комплектовании набора.

8. Приготовление стоп-реагента.

Берут 894 мл деионизованной воды и осторожно добаваляют 106 мл концентрированной серной кислоты. Полученный раствор разливают во флаконы и используют при комплектовании набора.

Пример 2. Применение набора для проведения анализа.

А. Подготовка рабочих растворов для проведения анализа:

А1. Для приготовления рабочего раствора буфера для промывки планшетов (ФСБТ) содержимое флакона с концентратом (ФСБТ) (компонент набора №3) разводят в 20 раз дистиллированной водой. Полученный раствор тщательно перемешивают. Приготовленный промывочный раствор хранят не более 3-х суток при температуре от 2°C до 8°C.

А2. Для приготовления рабочего раствора конъюгата МКА с пероксидазой концентрированный раствор конъюгата (компонент набора №5) разводят в 50 раз буфером для разведения конъюгата (БРК, компонент набора №4). Раствор готовят непосредственно перед использованием. Рабочий раствор конъюгата хранению не подлежит.

A3. Рабочий раствор хромоген-субстратного буфера (H₂O₂-ТМБ).

Раствор хромогена (ТМБ - компонент набора №7) разводят субстратным раствором (СР, компонент набора №6) в соотношении 1 к 1 и перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед использованием. Раствор H₂O₂-ТМБ хранению не подлежит.

Б. Постановка иммуноферментной реакции (ИФА).

Б1. Построение калибровочной кривой для расчета концентрации авермектина в пробе.

В лунки планшета вносят по 50 мкл каждой калибровочной пробы, содержащей ивермектин в концентрациях: 0-1-5-10-20-50-100 нг/мл (компонент набора №2) соответственно. Далее во все лунки с калибровочными пробами добавляют по 50 мкл рабочего раствора конъюгата МКА с пероксидазой хрена. Планшет встряхивают на шейкере в течение 1 минуты и инкубируют 1 час при +37°C. Планшет промывают 4 раза рабочим раствором буфера для промывки планшетов (ФСБТ) (по 300 мкл/лунку), каждый раз полностью удаляя жидкость постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге. Затем добавляют 100 мкл приготовленного хромоген-субстратного раствора с ТМБ. Инкубируют 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляют 50 мкл стоп-раствора для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А₄₅₀) измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом.

Ингибирование связывания антител с иммобилизованным ивермектином (в составе комплекса ивермектин-БСА) и свободным ивермектином (К_инг) вычисляют по формуле:

К_инг=100-(А₄₅₀ОП/А₄₅₀ «0»)×100,

где А₄₅₀ОП - оптическая плотность пробы, содержащей свободный ивермектин;

А₄₅₀ «0» - оптическая плотность пробы без свободного ивермектина (0 нг/мл).

Стандартная калибровочная кривая представлена на чертеже.

Как следует из полученных результатов, диапазон концентраций авермектинов, определяемых с помощью предлагаемого набора, составляет 0,15-100 нг/мл.

Б2. Постановка иммуноферментной реакции.

В лунки планшета вносят по 50 мкл каждой калибровочной пробы, содержащей ивермектин в концентрациях: 0-1-5-10-20-50-100 нг/мл (компонент набора №2). В остальные лунки планшета вносят по 50 мкл подготовленных исследуемых образцов. Если количество исследуемых образцов не позволяет использовать планшет полностью, при исследовании следующих партий образцов необходимо каждый раз строить калибровочную кривую с использованием калибровочных проб. Далее во все лунки с калибровочными и исследуемыми пробами добавляют по 50 мкл рабочего раствора конъюгата МКА с пероксидазой хрена. Планшет встряхивают на шейкере в течение 1 минуты и инкубируют 1 час при +37°C. Планшет промывают 4 раза рабочим раствором буфера для промывки планшетов (ФСБТ) (по 300 мкл/лунку), каждый раз полностью удаляя жидкость постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге. Затем добавляют 100 мкл приготовленного хромоген-субстратного раствора с ТМБ. Инкубируют 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляют 50 мкл стоп-раствора для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А₄₅₀) измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом.

Концентрацию авермектинов в исследуемом образце определяют по калибровочной кривой. Для этого определяют концентрацию авермектинов в исследуемой пробе, соответствующей вычисленному К_инг. К_инг определяют по формуле, вышеприведенной в разделе Б1.

Пример 3. Оценка специфичности и чувствительности набора при определении различных соединений авермектинового семейства.

Для исследования специфической активности предлагаемого набора для количественного определения разных соединений авермектиновой группы в качестве маркеров специфичности используют стандартные растворы, содержащие ивермектин, абамектин, авермектин и аверсектин в концентрации 50 нг/мл.

Постановку ИФА и определение К_инг проводят так, как описано в Примере 2. К_инг в пробах с абамектином, авермектином и аверсектином в среднем составляет соответственно 50%, 95% и 44% от К_инг в пробах с ивермектином в аналогичной концентрации. Таким образом, помимо ивермектина, метод позволяет определять авермектин, абамектин и аверсектин.

Результаты представлены в табл.1.

Табл.1
Специфическая активность набора при определении соединений авермектинового семейства.
Соединение	% специфичности по отношению к ивермектину
Ивермектин	100%
Абамектин	50%
Авермектин	95%
Аверсектин	44%

Таким образом, предлагаемый набор помимо ивермектина детектирует авермектин, абамектин и аверсектин и может быть использован для количественного определения этих соединений методом конкурентного ИФА.

Пример 4. Использование набора для количественного определения авермектинов в пробах биоматериала.

Для анализа используют молоко от животных, обработанных и не обработанных (контроль) авермектинсодержащими препаратами. Перед анализом проводят экстракцию авермектинов из молока.

Для анализа используют пробы молока, печени, мышц и жира животных в количестве не менее 1 г. Перед анализом ивермектин экстрагируют из биоматериала.

Реактивы и оборудование для экстракции в состав набора не входят. Для этой процедуры необходимы:

- стеклянные или пластиковые пробирки объемом не менее 10 мл;

- лабораторная центрифуга;

- источник сжатого воздуха или азота (компрессор, воздушный насос, баллон со сжатым воздухом или азотом с редуктором);

- вортекс;

- устройство для упаривания проб в токе газа (Reacti-Therm™III, Thermo scientific, США или аналогичное устройство);

- ацетон, изооктан, гексан, ацетонитрил, этанол квалификации ХЧ или ОСЧ.

Процедура экстракции:

- пробы исследуемого материала массой 1,0±0,1 г вносят в пробирки объемом не менее 10 мл;

- добавляют 5 мл смеси ацетон-вода (1:1) в каждую пробирку с материалом, перемешивают 5 мин на вортексе;

- добавляют 5 мл изооктана, мешают осторожно 10 минут на вортексе;

- центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин;

- верхнюю фазу (изооктан) переносят в чистую пробирку;

- к оставшейся смеси ацетон-вода добавляют еще 5 мл изооктана, мешают осторожно 10 мин на вортексе;

- центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин;

- верхнюю фазу объединяют с предыдущей и упаривают досуха при 60°C на устройстве для упаривания под током воздуха или азота;

- к остатку добавляют 4 мл ацетонитрила и мешают на вортексе 2 мин;

- добавляют 2 мл гексана;

- перемешивают 2 мин на вортексе;

- центрифугируют при 40°C 2 мин при 3000 об/мин;

- удаляют верхний гексановый слой;

- оставшийся слой ацетонитрила досуха упаривают на устройстве для упаривания при 60°C в токе азота или воздуха;

- после охлаждения до комнатной температуры, остаток растворяют в 500 мкл этанола;

- раствор досуха упаривают на устройстве для упаривания при 60°C в токе азота или воздуха;

- осадок растворяют в 50 мкл этанола, добавляют 450 мкл рабочего раствора буфера для разведения проб (БРК, компонент набора №7);

- используют по 50 мкл полученного раствора для ИФА.

Постановку ИФА и определение К_инг проводят так, как описано в примере 2. В качестве стандарта используют ивермектин в концентрациях 0-1-5-10-20-50-100 нг/мл. По калибровочной кривой определяют концентрацию авермектинов в экстрактах молока, как в примере 2. Результаты представлены в табл.2.

Табл.2
Определение концентрации ивермектина в молоке коров после обработки ивермектином в дозе 200 мкг/кг
Номер животного	Концентрация ивермектина С, нг/мл
	1 сутки	3 сутки	5 сутки	7 сутки	10 сутки
№1	2,9	5,5	5,3	3,8	2,9
№2	3,2	6,1	5,4	3,7	3
№3	2,7	5,4	5,2	3,2	2,5
№4 (контроль)	0	0	0	0	0

Набор для количественного определения авермектинов методом одностадийного конкурентного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что содержит иммунологический планшет с иммобилизированным конъюгатом ивермектина с бычьим сывороточным альбумином, конъюгат моноклональных антител к ивермектину, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток животных
Mus. musculus L., депонированным в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под номером 05/09, с пероксидазой хрена, калибровочные растворы ивермектина с концентрацией 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100 нг/мл, буфер для разведения конъюгата, буфер для разведения проб и промывки планшетов, субстратный раствор, раствор хромогена и стоп реагент.