Функциональный иммуноанализ in vitro

Изобретение относится к способу и набору для исследования in vitro действия иммуномодулирующих, а также индуцирующих апоптоз или некроз соединений в процессах in vivo, а также к способу и набору для идентификации in vitro иммуномодулирующих соединений и/или обнаружения действия иммуномодулирующих соединений, а также идентификации вызывающих апоптоз и/или некроз соединений при помощи иммунной системы в процессах in vivo. Сущность способов заключается в том, что проводят выделение эффекторных клеток иммунной системы, первичную инкубацию клеток с исследуемым веществом, получают супернатант или смеси из клеток и супернатанта первичной инкубации, проводят вторичную инкубацию клеток-мишеней с супернатантом или смесью из клеток и супернатанта, в котором в случае клеток-мишеней для вторичной инкубации речь идет об опухолевых клетках человека или клеточных линиях онкогенетического происхождения, анализ клеток-мишеней, где анализ выбирают из группы, включающей анализ экспрессии специфических белков и анализ апоптоза и/или некроза. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 14 ил.

 

Данное изобретение относится к способу для исследования in vitro действия веществ в процессах in vivo, а также к способу обнаружения in vitro для идентификации иммуномодулирующих соединений и/или обнаружения действия иммуномодулирующих соединений, а также идентификации индуцирующих апоптоз и/или некроз соединений посредством иммунной системы в процессах in vivo.

В последние годы в фармацевтической промышленности были разработаны совершенно новые классы веществ, которые предусмотрены для терапии самых различных заболеваний. Среди них находятся, в частности, также средства из генотерапии или генотерапевтически модифицированных гомологичных веществ, таких как, например, белки или ДНК-конструкции.

Поскольку с этими совершенно новыми классами веществ отчасти нет еще опыта в фармацевтической терапии заболеваний, существует потребность в способе для тестирования эффективности этих средств без необходимости одновременного использования экспериментов на животных и/или клинических испытаний с пациентами. Подобные опыты с новыми, неизвестными веществами запрещены уже по этическим причинам. Напротив, рекомендуется предварять эту стадию результатами исследований in vitro, которые делают возможными предсказания в отношении эффективности in vivo этих веществ. При этом при опытах in vitro важно как можно более приблизиться к ситуации in vivo.

Кроме того, важно разработать простые способы для динамического наблюдения («мониторинга») пациентов до, во время и/или после способа терапии (например, иммунотерапии или терапии, которая действует на иммунную систему), при котором исследуется реакция организма или иммунной системы на соответствующие способы терапии.

Наряду с общепринятыми способами терапии раковых заболеваний, такими как лучевая терапия и химиотерапия, которые с 1950-х годов представляют единственную возможность лечения далеко зашедших и широко распространившихся опухолевых заболеваний, теперь целью является разработка терапий, которые связаны с меньшими побочными действиями для пациентов, но при этом являются высокоэффективными в отношении достижения цели терапии.

Одним подходом для этого является иммунотерапия, которая нацелена на то, чтобы усилить природный иммунный ответ против опухолевых заболеваний генно-инженерными модификациями и, следовательно, повлиять на «внимание» иммунной системы к раковым клеткам и тем самым на защитную реакцию таким образом, что опухоль может быть побеждена самим организмом.

В настоящее время большинство клинических исследований делают ставку на удаление опухоли, последующую трансфекцию ex vivo опухолевых клеток терапевтическим геном, облучение популяции опухолевых клеток и последующую повторную имплантацию теперь модифицированных опухолевых клеток. Посредством этой вакцинации опухолевых клеток можно повысить противоопухолевый ответ в зависимости от трансфицированного терапевтического гена в различной степени.

Однако, наряду с трансфекцией опухолевых клеток, разрабатываются также иммуномодулирующие вещества, которые побуждают иммунную систему к подавлению опухолевых клеток. Посредством этих иммуномодулирующих веществ иммунная система должна побуждаться к тому или «программироваться» на то, чтобы опухолевые клетки специфически поражались и, в конечном счете, уничтожались. Таким образом, иммуномодулирующие вещества действуют при терапии рака опосредованно через иммунную систему на соответствующую опухоль или лежащий в ее основе тип опухолевых клеток.

Способ, который позволяет исследовать действие in vitro новых веществ на процессы in vivo, например на разрушение опухолевых клеток, позволил бы, с одной стороны, избежать опытов in vivo, находящихся под большими этическими сомнениями, и, с другой стороны, позволил бы за короткое время тестировать множество веществ при множестве различных опухолевых клеток. Кроме того, можно было бы при помощи подобного способа обеспечить дальнейший ход терапии в отношении индуцируемых in vivo эффектов в так называемом «мониторинге терапии».

На основании этого уровня техники задачей данного изобретения является способ, который позволяет исследовать эффективность in vitro веществ на процессах in vivo у людей или высших млекопитающих.

Эта задача решается признаками независимых пунктов формулы изобретения.

В контексте этого изобретения обозначают:

эффекторные клетки иммунной системы - смесь иммунных клеток, таких как, например, PBMC [периферические мононуклеарные клетки из крови (человека или высших млекопитающих), клетки селезенки (модели животных) и т.д.], или полученных FACS-сортингом или МACS-сортингом субпопуляций, таких как, например, В-, Т- и NK-клетки, моноциты, дендритные клетки и т.д.;

CpG-основание - неметилированное основание цитозин-гуанина;

dSLIM - иммуномодулирующие олигодезоксирибонуклеотиды с двойной структурой стебель-петля, причем каждая петля обнаруживает CpG-основание, предпочтительно три CpG-основания;

ODN - олигодезоксирибонуклеотид;

PBMC - периферические мононуклеарные клетки крови.

Далее ряд общих понятий должны пониматься следующим образом.

Под иммуномодулирующими соединениями, в контексте данного изобретения, следует понимать вещества, которые способны влиять на реакцию иммунной системы или также только на отдельные клетки, в частности эффекторные клетки. К ним относятся, наряду с химическими соединениями, также ДНК-конструкции, белки, антитела, молекулы сахаров или другие вещества, которые обнаруживают свойства, которые приводят к тому, что иммунная система или клетки иммунной системы побуждаются к реакции. Это относится, в частности, к клеткам иммунной системы, называемым в данном изобретении эффекторными клетками, которые способны влиять на реакции иммунной системы или опосредовать реакции иммунной системы. Это опосредование происходит посредством высвобождения специфических мессенджеров.

Таким образом, в соответствии с данным изобретением предлагается способ, который предусматривает следующие стадии:

а) выделение клеток,

b) первичную инкубацию клеток с подлежащим исследованию веществом,

с) получение супернатанта или смеси из клеток и супернатанта первичной инкубации,

d) вторичную инкубацию клеток-мишеней с супернатантом или смесью из клеток и супернатанта,

е) анализ клеток-мишеней.

В одном альтернативном варианте осуществления предлагается способ обнаружения in vitro, который предусмотрен для идентификации иммуномодулирующих соединений и/или обнаружения действия иммуномодулирующих соединений, а также идентификации индуцирующих апоптоз и/или некроз соединений посредством иммунной системы в процессах in vivo, который предусматривает:

а) первичную инкубацию эффекторных клеток иммунной системы с исследуемым на иммуномодулирующее действие или индуцирующим апоптоз или некроз веществом, с последующим;

b) получением супернатанта или смеси из клеток и супернатанта первичной инкубации и с последующей;

с) вторичной инкубацией клеток-мишеней с супернатантом или смесью из клеток и супернатанта первичной инкубации и после этого;

d) анализ иммуномодулирующего и/или индуцирующего апоптоз и/или некроз действия при помощи подходящего способа обнаружения.

При помощи стадий данного способа можно исследовать in vitro действие веществ в процессах in vivo. Вследствие этого новые соединения могут испытываться в очень близкой к in vivo ситуации без создания риска для животных и/или пациентов в клинических испытаниях.

Кроме того, результат уже предпринятой/проведенной терапии может быть подвергнут последующему наблюдению (с использованием анализа релевантных параметров). Это применение способов данного изобретения называют в контексте этого изобретения также «мониторингом терапии». Этим термином обозначают только последующее наблюдение in vitro эффектов терапии in vivo. Эти способы данного изобретения не связаны с самой терапией, кроме того, что результат терапии может контролироваться или наблюдаться (подвергаться мониторингу) после терапии.

В случае выделенных клеток речь идет в предпочтительном варианте осуществления способа этого изобретения об эффекторных клетках иммунной системы в соответствии с приведенным выше определением. Способы по данному изобретению пригодны, в частности, для того, чтобы исследовать действия веществ на клетки, которые опосредуются иммунной системой.

После того как клетки иммунной системы с веществами в первичной инкубации смогли проявить их действие на них, эффекты вещества in vivo обнаруживают затем во вторичной инкубации посредством того, что супернатанты или смесь из клеток и супернатанта первичной инкубации, которые, в том числе, содержат выделившиеся продукты клеток иммунной системы, инкубируют с клетками-мишенями.

В качестве клеток-мишеней предпочтительно предусмотрены клетки человека или клетки высших млекопитающих. В одном особенно предпочтительном варианте осуществления способа по данному изобретению для первичной инкубации используют выделенные клетки, в частности клетки иммунной системы, а для вторичной инкубации используют в качестве клеток-мишеней опухолевые клетки или клеточные линии, происходящие из опухолевых клеток. При такой схеме способа по данному изобретению этот способ называют также «функциональным иммуноанализом in vitro».

В качестве опухолевых клеток рассматриваются в основном всякие типы опухолевых клеток различного происхождения. Целью «функционального иммуноанализа in vitro» является идентификация или исследование веществ, которые способны посредством иммунной системы приводить к апоптозу или некрозу опухолевых клеток.

Но следующей целью способа этого изобретения является также исследование узнавания опухолевых клеток иммунной системой, вызываемое усиленной экспрессией молекул МНС-I (например, HLA-АВС) и молекул адгезии (например, ICAM-1) на поверхности опухолевых клеток. Решающим преимуществом способа этого изобретения является то, что эффект in vivo может быть обнаружен без необходимости проведения опытов на животных и/или пациентах в клинических исследованиях со связанными с ними недостатками.

Для применения способа этого изобретения для исследования изменений экспрессии поверхностных молекул на основе индуцированной иммуномодулирующим веществом иммунной реакции предлагается набор. Этот набор содержит приготовленные для хранения аликвоты клеток, предпочтительно эффекторных клеток иммунной системы, для первичной инкубации с исследуемыми веществами, средства для проведения первичной и вторичной инкубации, а также подходящие средства для анализа картины экспрессии поверхностных молекул клеток вторичной инкубации. Набор согласно этому изобретению содержит для анализа картины экспрессии поверхностных антигенов клеток-мишеней средство второй инкубации для проведения ОТ-ПЦР, для которой этот набор содержит подходящие праймеры для амплификации мРНК поверхностных молекул, ферменты для амплификации и необходимые буферы, и/или средства для FACS-анализа, для которого этот набор содержит флуоресцентно меченые антитела, которые направлены против поверхностных антигенов и маркеров апоптоза/некроза, а также, кроме того, средства для обработки клеток-мишеней, такие как буферы и химикаты.

Способы согласно данному изобретению приспособлены в одном усовершенствованном варианте также к мониторингу терапии, причем в качестве исследуемого вещества в первичной инкубации используют цельную кровь, клетки крови, сыворотку крови или плазму крови пациента до, во время и/или после терапии (например, иммунотерапии или терапии, которая изменяет иммунную систему или влияет на иммунную систему).

При помощи этого усовершенствованного варианта способа данного изобретения можно исследовать, достигли ли уже действия in vivo терапевтические вещества, которые вводили пациенту и предпочтительно действовали стимулирующим образом на иммунную систему. Хотя в этом способе исследовали кровь пациента с содержащимися в ней клетками и/или мессенджерами или ее части (например, сыворотку, или плазму, или субпопуляции клеток), способ данного изобретения обеспечивает в этом варианте осуществления, в конечном счете, косвенное доказательство действия in vivo вещества, которое вводили этому пациенту в данной терапии, предпочтительно иммунотерапии.

Поскольку неизвестны никакие специфические антитела, которые могли бы применяться в способе этого изобретения для «мониторинга терапии», можно прослеживать действие in vivo вследствие введенных терапевтических веществ или прослеживать изменения в продуцировании специфических антител вследствие реакции иммунной системы.

При терапиях, при которых способы данного изобретения предусматриваются в виде мониторинга терапии на эффективность вводимых в каждом случае терапевтических веществ, речь идет предпочтительно о таких заболеваниях, как рак, инфекции, аллергии и аутоиммунные заболевания.

Поэтому на основании указанных преимуществ для способов данного изобретения предусматриваются предпочтительно соединения, которые имеют иммуномодулирующее действие или способны вызывать апоптоз или некроз.

В качестве иммуномодулирующих соединений в соответствии с этим изобретением предусматриваются предпочтительно содержащие CpG-мотив олигодезоксинуклеотиды и dSLIM (иммуномодулирующие олигодезоксирибонуклеотиды с двойной структурой стебель-петля, см. ЕР 1196178 В1). Но в объеме настоящего изобретения находится также применение других биомолекул, таких как, например, природные или измененные генной инженерией антитела, вещества на основе ДНК или РНК (антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, короткие интерферирующие РНК (siRNA) и т.д.), аминокислотные соединения, мессенджеры или другие иммуномодуляторы (такие как соли алюминия, имидазахинолин, липополисахариды, производные сапонина, фосфолипиды, сквален и т.д.).

В качестве индуцирующих апоптоз и/или некроз соединений согласно данному изобретению рассматриваются, в частности, такие соединения, которые пригодны для продолжительного нарушения необходимых для сохранения клетки процессов. При этом рассматриваются, в частности, вещества на основе ДНК или РНК (антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, короткие интерферирующие РНК (siRNA) и т.д.), антитела или химиотерапевтические вещества.

Способы согласно данному изобретению могут быть, кроме того, использованы для идентификации мессенджеров, которые высвобождаются вследствие инкубации выделенных клеток в первичной инкубации с иммуномодулирующими или индуцирующими апоптоз и/или некроз веществами из этих клеток. Для этого супернатант первичной инкубации перед добавлением к клеткам-мишеням предъинкубируют с антителами, которые специфически узнают потенциальные мессенджеры. В результате взаимодействия между антителом и эпитопом мессенджера он уже не способен передавать сигналы в клетки-мишени и, следовательно, становится блокированным в его функции. Эта схема способа данного изобретения является важной для обнаружения, какие конкретные мессенджеры ответственны за индуцированное действие, например апоптоз.

В рамках набора для применения способа данного изобретения для идентификации индуцированного высвобождения мессенджеров применяют предпочтительно луночные микротитрационные планшеты с 24-96 лунками, причем поверхность каждой лунки планшета покрывают антителом, которое направлено против эпитопа одного мессенджера (например, IFN-γ), и после инкубации фракций супернатанта первичной инкубации с обработанным таким образом планшетом и последующей инкубации этих фракций с клетками-мишенями существует возможность испытания множества потенциальных мессенджеров за короткое время в отношении того, участвуют ли они действительно в опосредовании иммунного ответа или индукции апоптоза.

Таким образом, набор для применения способа данного изобретения для идентификации мессенджеров, которые высвобождаются в качестве реакции инкубации клеток первичной инкубации с исследуемым веществом, также является предметом этого изобретения. Подобный набор содержит пригодные для хранения, подготовленные аликвоты клеток, предпочтительно эффекторных клеток иммунной системы, для первичной и вторичной инкубации, а также, кроме того, многолуночные планшеты с количеством лунок 24-96, в которых поверхности этих лунок покрыты антителом, причем поверхности разных лунок покрыты различными антителами, но предпочтительно предусмотрены, по меньшей мере, 2 лунки с идентичным антителом в каждом случае.

Стадии инкубаций, необходимые при способе этого изобретения, предпочтительно происходят в термостате с 5% содержанием СО₂. Но возможны также другие условия инкубации, которые в каждом случае соответствуют требованиям инкубируемых клеток.

Получение супернатантов или смесей из супернатанта и клеток из первичной инкубации выполняют согласно изобретению при помощи центрифугирования. Однако согласно изобретению допустимы также все другие способы, которые пригодны для отделения клеток от супернатантов, такие как, например, фильтрование клеток при ширине отверстий, которая позволяет проходить только супернатанту, но не присутствующим остаткам клеток. Кроме того, предусматриваются разделения клеток или сортинг клеток при помощи специфических антител и последующего отбора с использованием магнита (МACS) или основанного на флуоресценции отбора (FACS).

Для анализа клеток предлагаются способы в соответствии с данным изобретением, которые могут обеспечить изменения экспрессии белков в клетках-мишенях. При этом рассматриваются, в частности, FACS-измерения (сортинг клеток с активацией флуоресценции), Вестерн-блот-гель-фильтрации или цитоспины, получаемые в цитоцентрифуге.

Кроме того, обеспечены способы для анализа изменений при экспрессии определенных генов, такие как, например, ОТ-ПЦР, ПЦР реального времени, анализы с защитой от РНКазы, а также Нозерн-блоттинг и блоттинг по Саузерну.

Наконец, при анализе эффектов in vivo предусматриваются также анализы апоптоза, такие как, например, окрашивание клеток Аннексином V или Tunel-анализ (опосредованное трансферазой мечение ник-концов dUTP), например, при помощи окрашиваний йодидом пропидия.

Приведенные далее примеры и результаты опытов подтверждают, что применение способа в соответствии с данным изобретением способно не только обеспечить исследования in vitro действия веществ в процессах in vivo, но также, кроме того, пригодно для подтверждения и доказательства специфичности обнаруженных эффектов посредством усовершенствования способа этого изобретения до конкурентного анализа.

Дополнительные предпочтительные варианты осуществления этого изобретения обнаруживаются из приведенной ниже формулы изобретения и описания. Данное изобретение, в том числе осуществления способа по изобретению, будет далее более подробно описано при помощи примеров осуществления и иллюстраций, не ограничиваясь этими примерами.

Получение мононуклеарных клеток

Для осуществления способа по данному изобретению получали периферические мононуклеарные клетки (PBMC) из цельной крови или так называемую «лейкоцитную пленку». При этом речь идет о побочном продукте, который возникает при приготовлении концентратов эритроцитов из цельной крови.

Выделение PBMC выполняли центрифугированием через градиенты фиколла для разделения эритроцитов, гранулоцитов и мертвых клеток. Фиколл представляет собой незаряженный полимер сахарозы, плотность которого устанавливают таким образом, что при наслаивании на него цельной крови или лейкоцитной пленки и последующем центрифугировании частицы с меньшей плотностью проходят через слой фиколла и собираются на дне пробирки, в то время как лимфоциты и моноциты собираются в интерфазе между плазмой (сверху) и фиколлом (снизу).

Интерфазу, которая содержит клетки после центрифугирования, выделяли и несколько раз промывали ЗФР. После этого выделенные клетки помещали в культуральную среду для клеток и доводили до концентрации 1-4×10⁶ клеток на миллилитр.

Двухцепочечные иммуномодуляторные олигодезоксинуклеотиды (dSLIM)

Двухцепочечные иммуномодуляторные олигодезоксинуклеотиды являются молекулами с CpG-последовательностями. Для этого линейные олигодезоксинуклеотиды (ODN) ковалентно замыкаются нуклеотидной петлей, так что они защищены от деградации экзонуклезами. При этом получаются гантелеобразные молекулы, которые называют dSLIM, «иммуномодуляторами с удвоенной структурой стебель-петля». Иммуномодулирующее действие основано на неспецифической активации иммунной системы неметилированными последовательностями СрG, которые связывают Toll-подобные рецепторы, и, прежде всего, особой структурой молекулы dSLIM. Каждая петля dSLIM содержит три неметилированных CpG-основания.

Двухцепочечные иммуномодуляторы dSLIM типа ISS30 (например, dSLIM-30L1) получают в соответствии с SOP и с последующим контролем качества в лаборатории класса В. Для этого одноцепочечные, имеющие форму шпильки, 5'-фосфорилированные олигодезоксирибонуклеотиды (ODN) лигируют с использованием Т4-ДНК-лигазы. После расщепления оставшихся выделенных веществ Т7-полимеразой и хроматографической очистки полученные молекулы dSLIM концентрировали этанолом и осаждением ацетатом натрия-магния и растворяли в ЗФР. Подробный способ приведен в WO 01/07055.

Первичная инкубация иммунных клеток (PBMC) с dSLIM

Выделенные клетки (PBMC) высевали в многолуночных планшетах. Размер исходных смесей и, соответственно, величину лунок выбирали таким образом, что собранный позднее культуральный супернатант имел точно такой объем, который использовали для вторичной инкубации с клетками-мишенями.

В первой исходной смеси находились нестимулированные клетки (отрицательный контроль). Во второй исходной смеси выполняли стимуляцию с использованием 0,1-10 мкМ dSLIM-30L1. В двух дополнительных исходных смесях выполняли стимуляцию 0,1-10 мкМ олигодезоксинуклеотидом (ODN), что дает наиболее сильный положительный результат, чтобы создать возможность установки прибора и компенсации на клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (FACS). В следующих исходных смесях выполняли стимуляцию 0,1-10 мкМ других ODN для сравнения. Исходную смесь инкубировали в течение 48 часов при 37^оС в СО₂-термостате. Супернатанты этих исходных смесей получали центрифугированием и замораживали для последующих работ при -80^оС.

Вторичная инкубация с клетками-мишенями (например, НТ-29)

Для вторичной инкубации с клетками-мишенями нужно было предварительно определить оптимальную концентрацию и объем, в которых они будут высеваться. Цель заключалась в том, чтобы после вторичной инкубации присутствовали, по меньшей мере, 5×10⁵ клеток-мишеней на лунку для анализа. При этом обращали внимание на то, чтобы эти клетки имели оптимальные условия для роста в течение 3 дней, так чтобы после 3 дней они были почти конфлюэнтными. Неоптимальные условия для роста приводят также к некрозу или апоптозу, следствием чего было бы получение ложных результатов. В качестве клеток-мишеней здесь использовали клетки рака ободочной кишки НТ-29.

Клетки высевали в предварительно определенных оптимальных плотностях в исходных смесях соответствующего размера и инкубировали на протяжении ночи при 37^оС с СО₂-термостате (например, 2,4×10⁵ клеток в 700 мкл на лунку в 24-луночном планшете).

На следующий день выполняли стимуляцию отбором среды из слипшихся между тем клеток и добавлением супернатантов из первичной инкубации («непрямая стимуляция») или добавлением указанных веществ (dSLIM-30L1, lin30L1) непосредственно в среду («прямая стимуляция»). В качестве отрицательного контроля к «непрямой» исходной смеси добавляли только среду. Эти клетки для отличения от нестимулированных клеток (добавление нестимулированного супернатанта из первичной инкубации) обозначали как необработанные клетки.

Исходные смеси - прямая стимуляция и непрямая стимуляция - инкубировали в течение 48 часов опять при 37^оС в СО₂-термостате. После этого с этими клетками можно было проводить желаемые в каждом отдельном случае анализы. Для этого сначала супернатанты клеток отбирали и клетки промывали ЗФР. Клетки отделяли от лунок при помощи смеси трипсин/ЭДТА и после еще одной дополнительной стадии промывки переносили в центрифужные пробирки, чтобы затем определить количество клеток.

Окрашивание поверхностных антигенов

Клетки из исходных смесей со стимуляцией центрифугировали и промывали специальным буфером для окрашивания. Сразу после этого суспензию клеток доводили до концентрации 1×10⁶ клеток на миллилитр. 500 мкл (0,5×10⁶ клеток) этой клеточной суспензии центрифугировали в FACS-пробирках и после помещения в 50 мкл буфера для окрашивания добавляли антитела (например, ICAM-1 (CD54), конъюгированные с FITC, и HLA-АВС, конъюгированные с фикоэритрином (PE)). Для каждого антитела вводили соответствующий контроль на изотип, а также отдельно окрашенную положительную пробу для установки прибора и компенсации. После стадии инкубации эти клетки дважды промывали ЗФР и ресуспендировали для измерения в 500-1000 мкл ЗФР. Для дискриминации мертвых клеток добавляли 7-AAD и инкубировали еще 10 минут. После этого выполняли FACS-измерение.

Окрашивание апоптотических/некротических клеток

Апоптотические клетки окрашивали смесью аннексин V-PE, которая обнаруживает апоптотические процессы в клетке. Для отличения некротических клеток проводили окрашивание в контрастный цвет с использованием 7-AAD.

Клетки из исходных смесей со стимуляцией центрифугировали и дважды промывали ЗФР. После этого клетки разбавляли в специальном аннексинсвязывающем буфере и концентрацию клеток доводили до 1×10⁶ клеток на миллилитр. По 100 мкл (1×10⁵ клеток) этой суспензии смешивали с 5 мкл смеси аннексин V-PE и 7-AAF и после тщательного перемешивания в течение 15 минут инкубировали при комнатной температуре. После этого добавляли 400 мкл буфера для связывания и немедленно выполняли измерение в FACS.

Проточно-цитометрическое измерение на приборе FACS

А. Апоптоз/некроз

Измеряли флуоресценцию 2 (аннексин V-PE) и флуоресценцию 3 (7-AAD). Установку прибора выполняли с нестимулированными клетками («прямые» исходные смеси) или необработанными клетками («непрямые» исходные смеси). В дот-блоте FSC (рассеивание вперед=величина клетки) против SSC (рассеивание в сторону=гранулярность клеток) клеточную популяцию устанавливали таким образом, что она находится в середине. После этого выполняли установки PMT и компенсацию для флуоресценции 2 и 3. После этого измеряли все пробы (5000 клеток).

В. Поверхностные антигены

Измеряли флуоресценцию 1 (ICAM-1-FITC), флуоресценцию 2 (HLA-АВС-PE) и флуоресценцию 3 (7-AAD). Установку прибора выполняли с lin-30L1 стимулированными клетками с соответствующими контролями на изотип (в двойном окрашивании) для компенсации неспецифического связывания и с флуоресцентно мечеными антителами (в отдельных окрашиваниях).

В дот-блоте FSC против SSC клеточную популяцию устанавливали таким образом, что она находится в середине. После этого выполняли установки PMT для флуоресценции 1, 2 и 3 с контролями на изотип, а также компенсацию с отдельным окрашиванием. После этого все пробы измеряли (10000 клеток). При этом исключали мертвые клетки (7-AAD-положительные клетки) (флуоресценция 3 против FCS в Dot Blot).

Интерпретация результатов

А. Апоптоз/некроз

Образуют дот-блот 7-AAD против аннексина V. Затем устанавливают квадранты с использованием необработанных клеток. В зависимости от их положения в квадрантах в каждом отдельном случае эти клетки относят к апоптотической или некротической фракции.

• Живые клетки являются аннексин-отрицательными и 7-AAD-отрицательными (LL-квадрант)

• Апоптотические клетки являются аннексин-положительными и 7-AAD-отрицательными (LR-квадрант)

• Некротические клетки являются аннексин-положительными и 7-AAD-положительными (UR-квадрант)

или

аннексин-отрицательными и 7-AAD-положительными (UL-квадрант)

В. Поверхностные маркеры

Образуют два дот-блота (флуоресценция 1 против флуоресценции 2 против FSC) с живыми клетками. В зависимости от их положения в дот-блотах в каждом отдельном случае считывают интенсивность флуоресценции (флуоресценции 1/ICAM-1 или 2/HLA-АВС) клеток. После этого производят сравнение с контролями в каждом случае.

• Сравнение тестируемых исходных смесей с контролями в отношении

• количества положительных в отношении поверхностных маркеров клеток (=количество клеток с соответствующими поверхностными маркерами)

• интенсивности флуоресценции поверхностных маркеров (=количество молекул поверхностных маркеров на клеточной поверхности).

Результаты проведения описанных примеров с использованием способов по данному изобретению изображены на фигурах.

Фигуры показывают:

Фиг. 1 - схематическое представление способа данного изобретения.

Фиг. 2 - анализ действия in vitro иммуномодулятора dSLIM посредством обнаружения апоптоза и некроза в опухолевых клетках НТ-20.

Фиг. 3 - анализ действия in vitro иммуномодулятора dSLIM посредством обнаружения экспрессии поверхностных маркеров HLA-АВС в опухолевых клетках НТ-29.

Фиг. 4 - анализ действия in vitro иммуномодулятора dSLIM посредством обнаружения апоптоза и некроза в опухолевых клетках НЕК-293.

Фиг. 5 - анализ действия in vitro иммуномодулятора dSLIM посредством обнаружения экспрессии поверхностных маркеров HLA-АВС в опухолевых клетках НЕК-293.

Фиг. 6 - анализ механизма действия dSLIM посредством обнаружения апоптоза и некроза в опухолевых клетках НТ-29 с применением способа данного изобретения.

Фиг. 7 - анализ механизма действия dSLIM посредством обнаружения экспрессии поверхностных маркеров HLA-АВС в опухолевых клетках НТ-29 с применением способа данного изобретения.

Фиг. 8 - сравнение эффективности dSLIM с линейным СрG-ODN посредством обнаружения экспрессии поверхностных маркеров HLA-АВС в опухолевых клетках Renca.

Фиг. 9 - сравнение эффективности dSLIM с линейным СрG-ODN посредством обнаружения апоптоза и некроза в опухолевых клетках Renca.

Фиг. 10 - сравнение эффективности dSLIM с линейным СрG-ODN посредством обнаружения экспрессии поверхностных маркеров HLA-АВС в опухолевых клетках НТ-29.

Фиг. 11 - сравнение эффективности dSLIM с линейным СрG-ODN посредством обнаружения апоптоза и некроза в опухолевых клетках НТ-29.

Фиг. 12 - последующее наблюдение (мониторинг) in vitro жизнеспособных опухолевых клеток во время терапии ракового пациента.

Фиг. 13 - последующее наблюдение (мониторинг) in vitro апоптотических/некротических опухолевых клеток во время терапии ракового пациента.

Фиг. 14 - последующее наблюдение (мониторинг) in vitro поверхностных маркеров опухолевых клеток во время терапии ракового пациента.

Фигура 1 показывает схематическое изображение очередности стадий способа в соответствии с данным изобретением. Слева, в части А, находится изображение примерного применения in vivo, справа, в части В, изображен рассматриваемый способ этого изобретения в варианте осуществления в виде «функционального иммуноанализа in vitro».

Фигура 2 показывает результаты анализа действия in vitro иммуномодулятора dSLIM при использовании способа этого изобретения. Применение супернатантов dSLIM-инкубированных PBMC вызывает апоптоз и некроз в опухолевых клетках НТ-29 (рака ободочной кишки), как можно видеть в правой части фигуры. Здесь можно видеть подъем при апоптозе от непосредственно обработанных dSLIM клеток до обработанных супернатантом клеток от 17% до 46,7%.

На фигуре 3 анализировали действие in vitro иммуномодулятора dSLIM в клетках НТ-29. Использование супернатанта dSLIM-инкубированных PBMC вызывает усиленную экспрессию поверхностных маркеров HLA-АВС. Можно хорошо видеть смещение клеточной популяции в самую правую часть изображения.

Для подтверждения полученных в НТ-29 результатов способа при использовании способа этого изобретения аналогичные опыты проводили в клетках НЕК-293.

Фигура 4 показывает, что dSLIM вызывает апоптоз (аннексин V) и некроз (7-ААD). Так, количество апоптотических клеток повышается супернатантом обработанных dSLIM клеток в сравнении с супернатантом обработанных без ODN клеток с 12,1% до 21,7%. Количество некротических клеток повышается с 9,2% до 16%.

На фигуре 5 изображено усиленное влияние поверхностных маркеров HLA-АВС инкубацией клеток-мишеней (РТ-29) с dSLIM-супернатантом PBMC. Верхняя часть фигуры показывает при этом смещение (=повышение экспрессии) клеточной популяции от клеток, которые были обработаны ODN, к клеткам, которые инкубировались с супернатантом обработанных dSLIM PBMC.

Фигура 6 показывает результаты анализа механизма действия dSLIM в клетках НТ-29 при использовании способа этого изобретения и обнаружения апоптоза и некроза. При этом на стадии первичной инкубации PBMC добавляли антитело (анти-IFN-γ, зеленая рамка), которое способно нейтрализовать действие dSLIM. Для сравнения проводили способы с антителами (анти-IFN-α, анти-TNF-α) для доказательства специфичности. Можно ясно видеть (зеленая рамка), что с использованием анти-IFN-γ-антител минимизируется количество как апоптотических, так и некротических клеток.

На фигуре 7 использование способа этого изобретения соответствует использованию фигуры 6, но в клетках-мишенях (РТ-29) анализировали экспрессию поверхностного маркера ICAM-1 (CD54). Однако эти линейные CpG-содержащие олигодезоксинуклеотиды имеют также другую последовательность, чем dSLIM, и защищены против разрушения посредством фосфоротиоата.

Фигура 8 показывает, что обработка клеток-мишеней dSLIM приводит к усиленной экспрессии поверхностного маркера HLA-АВС (верхняя часть), тогда как линейный CpG-ODN не оказывает влияния. Таблица правой части фигуры сопоставляет многочисленные различия. При индукции апоптоза и некроза, фигура 9, dSLIM является явно более эффективным, чем линейный CpG-ODN. В нижней части приводится различие индукции апоптоза в процентах.

Фигуры 10 и 11 сравнивают в каждом случае dSLIM с линейным CpG-ODN при использовании способа этого изобретения в клетках НТ-29 в качестве клеток-мишеней. Результаты этого эксперимента соответствуют результатам, которые получали с опухолевыми клетками Renca и которые изображены на фигурах 8 и 9. Структура этих фигур также соответствует фигурам 8 и 9.

Фигуры 12, 13 и 14 показывают использование способа этого изобретения для последующего наблюдения (мониторинга) in vitro количества жизнеспособных опухолевых клеток (фиг. 12) и апоптотических/некротических клеток (фиг. 13), а также изменения экспрессии поверхностных маркеров ICAM-1/HLA-АВС (фиг. 14) в ходе терапии ракового пациента.

Пациента с раком прямой кишки и метастазированием печени подвергали в первые пять дней первой недели терапии каждый раз 2,5 мг dSLIM. На шестой день первой недели выполняли облучение с последующей химиотерапией.

Для анализа in vitro in vivo-эффектов у пациента каждый раз в первые шесть дней первой недели брали кровь. Во время химиотерапии в конце каждой недели также брали кровь.

Из проб крови выделяли плазму и инкубировали с клетками линии опухолевых клеток НТ-29. После этого определяли количество жизнеспособных клеток (фиг. 12) и апоптотических/некротических клеток, а также исследовали экспрессию поверхностных маркеров ICAM-1/HLA-АВС.

Фигура 12 показывает результаты инкубации клеток НТ-29 с плазмой из восьми проб крови. Можно видеть явное снижение жизнеспособных клеток на второй день введения dSLIM. Количество жизнеспособных клеток снижается на второй день до менее, чем половина клеток первого дня, что сравнимо с количеством жизнеспособных клеток контролей.

На фигуре 13 изображено последующее наблюдение (мониторинг) in vitro апоптотических/некротических опухолевых клеток во время терапии ракового пациента в дни 1, 2, 5 и 20. При этой оценке мониторинга in vivo-эффектов обнаруживается, что уже в первый день после получения dSLIM количество апоптотических/некротических клеток явно увеличивается.

Фигура 14 представляет результаты исследований по изменению экспрессии поверхностных маркеров ICAM-1/HLA-АВС во время терапии ракового пациента с использованием плазмы крови проб 1, 2, 3 и 8. При этом проба 1 берется в качестве ссылочного показателя для представления изменений экспрессии обоих поверхностных маркеров.

ICAM-1 уже на второй день экспрессируется явно более сильно, что видно в нижней части фигуры по перемещению положения интенсивности флуоресценции, которое показывает, что ICAM-1 экспрессируется сильнее.

В случае HLA-АВС на второй день не было никакого смещения интенсивности флуоресценции. Оно обнаруживается лишь на третий день терапии и также показывает более сильную экспрессию HLA-АВС.

Список используемых символов

А=ситуация in vivo

В=иммуноанализ in vitro

1=пациент

2=ткань-мишень, например, опухоль

3=иммунные клетки

4=тест-вещество, например, dSLIM

5=активированные иммунные клетки

6=донор

7=иммунные клетки, например, PBMC

8=тест-вещество, например, dSLIM

9=активированные иммунные клетки, например, PBMC

10=супернатант

11=клетки-мишени, например, опухолевые клетки

12=анализ

1. Способ исследования in vitro действия веществ в процессах in vivo, в котором в случае исследуемых веществ речь идет об иммуномодулирующих, а также индуцирующих апоптоз или некроз соединениях и который предусматривает следующую последовательность стадий способа:
a) выделение эффекторных клеток иммунной системы, которые являются периферическими мононуклеарными клетками из крови, клетками селезенки или подвергнутыми FACS- или MACS-сортингу субпопуляциями смесей клеток, такими как В-, Т- или NK-клетками, моноцитами или дендритными клетками,
b) первичную инкубацию эффекторных клеток с исследуемым веществом,
c) получение супернатанта или смеси из клеток и супернатанта первичной инкубации,
d) вторичную инкубацию клеток-мишеней с супернатантом или смесью из клеток и супернатанта первичной инкубации, в котором в случае клеток-мишеней для вторичной инкубации речь идет об опухолевых клетках человека или клеточных линиях онкогенетического происхождения,
e) анализ клеток-мишеней, где анализ выбирают из группы, включающей анализ экспрессии специфических белков и анализ апоптоза и/или некроза.

2. Способ по п.1, в котором в случае клеток-мишеней вторичной инкубации речь идет о клетках человека или клетках высших млекопитающих.

3. Способ по п.1, в котором проводят стадии способа 1d) и 1е) с кровью, сывороткой или плазмой пациента.

4. Способ обнаружения in vitro, который пригоден для идентификации иммуномодулирующих соединений и/или обнаружения действия иммуномодулирующих соединений, а также идентификации вызывающих апоптоз и/или некроз соединений при помощи иммунной системы в процессах in vivo, который предусматривает:
a) первичную инкубацию эффекторных клеток иммунной системы, которые являются периферическими мононуклеарными клетками из крови, клетками селезенки или подвергнутыми FACS- или MACS-сортингу субпопуляциями смесей клеток, такими как В-, Т- или NK- клетками, моноцитами или дендритными клетками, с исследуемым на иммуномодулирующее действие или индуцирующим апоптоз или некроз веществом, с последующим
b) получением супернатанта или смеси из клеток и супернатанта первичной инкубации и с последующей
c) вторичной инкубацией клеток-мишеней с супернатантом или смесью из клеток и супернатанта первичной инкубации, в котором в случае клеток-мишеней для вторичной инкубации речь идет об опухолевых клетках человека или клеточных линиях онкогенетического происхождения и после этого
d) анализ иммуномодулирующего и/или индуцирующего апоптоз и/или некроз действия при помощи подходящего способа обнаружения, где указанный способ обнаружения выбирают из группы включающей анализ экспрессии специфических белков и анализ апоптоза и/или некроза.

5. Способ по п.4, в котором клетки для первичной инкубации предварительно выделяют в стадии способа 1а).

6. Способ по п.4, в котором в случае клеток для первичной инкубации и клеток-мишеней для вторичной инкубации речь идет о клетках человека или клетках высших млекопитающих.

7. Способ по п.4, в котором проводят стадии способа 4 с) и 4d) с кровью, сывороткой или плазмой пациента.

8. Способ по любому из пп.1 или 4, в котором в случае иммуномодулирующих соединений, действие которых исследуется, речь идет о CpG-содержащих олигодезоксинуклеотидах или частично двухцепочечных ДНК-конструкциях, по меньшей мере, с одним CpG-основанием в одноцепочечной области.

9. Способ по любому из пп.1 или 4, в котором в случае индуцирующих апоптоз и/или некроз соединений, действие которых исследуется, речь идет предпочтительно об антисмысловых олигодезоксинуклеотидах, коротких интерферирующих РНК (siRNA), антителах или химиотерапевтических веществах.

10. Способ по любому из пп.1 или 4, в котором в качестве исследуемого вещества в первичной инкубации используют цельную кровь, клетки крови, субпопуляции клеток крови, сыворотку крови или плазму крови до, во время и/или после лечения.

11. Способ по любому из пп.1 или 4, в котором инкубация происходит в термостате.

12. Способ по любому из пп.1 или 4, в котором супернатанты получают центрифугированием.

13. Способ по любому из пп.1 или 4, в котором клетки-мишени для анализа окрашивают, в частности аннексином V, или проводят окрашивание иодидом пропидия.

14. Способ по любому из пп.1 или 4, в котором проводят анализы клеточного цикла.

15. Способ по любому из пп.1 или 4, в котором при первичной инкубации с исследуемым веществом добавляют антитела или другие конкурирующие вещества.

16. Набор для проведения способа обнаружения in vitro, который пригоден для идентификации иммуномодулирующих соединений и/или обнаружения действия иммуномодулирующих соединений, а также идентификации индуцирующих апоптоз и/или некроз соединений при помощи иммунной системы в in vivo-процессах, имеющий, по меньшей мере, следующие компоненты:
- подготовленные для хранения аликвоты эффекторных клеток иммунной системы, которые являются периферическими мононуклеарными клетками из крови, клетками селезенки или подвергнутыми FACS- или MACS-сортингу субпопуляциями смесей клеток, такими как В-, Т- или NK-клетками, моноцитами или дендритными клетками,
- средства для проведения первичной и вторичной инкубации,
- многолуночные планшеты с количеством лунок 24-96, у которых поверхности этих лунок покрыты антителом, для обнаружения мессенджеров, которые высвобождаются в результате инкубации клеток первичной инкубации с исследуемым соединением, и/или
- средства для FACS-анализа, содержащие подходящие флуоресцентно меченые антитела, которые направлены на поверхностные антигены, для исследования изменений в экспрессии поверхностных молекул вследствие вызываемой исследуемым соединением иммунной реакции и дополнительно средства для обработки клеток-мишеней, такие как буферы и химикалии.

17. Набор для изображения in vitro действия иммуномодулирующих соединений, а также индуцирующих апоптоз и/или некроз соединений посредством иммунной системы в in vivo-процессах до, во время и/или после введения подобных соединений, имеющий, по меньшей мере, следующие компоненты:
- подготовленные для хранения аликвоты клеток-мишеней для инкубации с кровью, сывороткой или плазмой, а также
- средства для проведения вторичной инкубации, а также
- многолуночные планшеты с количеством лунок 24-96, у которых поверхности этих лунок покрыты антителом, для обнаружения мессенджеров, которые высвобождаются в результате инкубации клеток первичной инкубации с исследуемым соединением и/или
- средства для FACS-анализа, содержащие подходящие флуоресцентно меченые антитела, которые направлены на поверхностные антигены для исследования изменений в экспрессии поверхностных молекул вследствие индуцируемой исследуемым соединением иммунной реакции и дополнительно средства для обработки клеток-мишеней, такие как буферы и химикаты.

18. Набор по п.17, в котором в случае содержащихся клеток-мишеней речь идет об опухолевых клетках или клеточных линиях онкогенетического происхождения.