Способ оценки устойчивости исходного селекционного материала риса к пирикуляриозу
Владельцы патента RU 2427128:
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт риса Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИ риса) (RU)
Изобретение относится к области сельского хозяйства и селекции. В способе оценивают устойчивость селекционного материала риса к пирикуляриозу. При этом поперечные срезы главных побегов, отобранные в фазу молочно-восковой спелости, обрабатывают последовательно растворами азотно-кислого натрия, мочевины, уксусной кислоты, едкого натрия и по степени окрашивания поперечного среза судят о степени устойчивости анализируемого материала к пирикуляриозу: от коричневого до светло-коричневого - высокоустойчивый (ВУ); от ярко-оранжевого до ярко-желтого - устойчивый (У); от желтого до бледно-желтого - неустойчивый (НУ). Способ позволяет оценивать формы исходного материала на устойчивость к пирикуляриозу и разрабатывать соответствующие рекомендации. 1 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности, к способам оценки устойчивости исходных селекционных форм риса к опасному заболеванию, возбудителем которого является гриб-патоген Piricularia orizae Cavara. Имея мощный ферментативный аппарат, гриб воздействует на клетку, что приводит к нарушению целостности растительного организма, проявляющемуся не только в механическом повреждении растительной ткани, но и в расстройстве физиолого-биохимического метаболизма, конечным результатом которого может быть гибель растения.
Растение риса - саморегулирующаяся система, способная оказать сопротивление неблагоприятным внешним воздействиям, если они не носят запредельный характер. Потери урожая от действия гриба могут составить более 30%. Поэтому оценка исходного селекционного материала на устойчивость к пирикуляриозу, отбор устойчивых форм, вовлекаемых в дальнейшем в селекционный процесс, весьма актуальна.
Известен способ оценки исходного материала риса к пирикуляриозу по чувствительности к гебберелловой кислоте (ГК) (см., например, Авакян Э.Р., Алешин Н.Е., Алешин Е.П. «О механизме действия гиббереллина на растение риса. / /Сельскохозяйственная биология. 1988. - №3. С.9-19), включающий проращивание семян риса на растворе гибберелловой кислоты (0,001%). В зависимости от уровня эндогенного ГК в исходном материале, реакция сорта (высота проростков - биотест) будет различной, что обусловит доступность или недоступность к патогену. Гиббереллин утончает клеточные стенки растения, облегчая проникновение патогена вовнутрь нее. Гриб повреждает тем самым механическую ткань, нарушает метаболизм растения, что, в конечном итоге, приводит к гибели растения, а, в большем масштабе, к значительным потерям.
Недостатками метода являются продолжительность выполнения метода (18-20 дней) и высокая цена препарата (ГК).
Известен способ определения устойчивости растений риса к пирикуляриозу по активности фермента пероксидазы, обуславливающей энергетический потенциал клетки (см., например, Авакян Э.Р., Кумейко Т.Е., Ольховая К.К. Параметры модели восприимчивости сортов риса к пирикуляриозу. Материалы XVIII Международного симпозиума «Нетрадиционное растениеводство, селекция, эниология, экология, здоровье». Алушта. Симферополь.2008. - С.430-432), включающий измерение времени, за которое исследуемый раствор достигает определенной оптической плотности. В качестве субстрата используется бензидин (краситель), при окислении которого образуется соединение синего цвета.
Недостатками метода являются продолжительность выполнения (гомогенизация растительного материала в присутствии жидкого азота, фильтрование, фотоэлектрокалориметрический анализ), бензидин-дорогостоящий препарат.
Все перечисленные биохимические критерии устойчивости к пирикуляриозу достаточно четко отражают восприимчивость растения риса к патогену. Однако они сложны в исполнении и затратны по времени и реактивам.
Известен способ определения устойчивости к пирикуляриозу по содержанию кремнезема в клеточных стенках проростков, стебля, листьев, покровных чешуй. Кремнезем создает преграду для инвазии гриба, предотвращая тем самым развитие болезни (см., например Авакян Э.Р., Алешин Н.Е., Дякунчак С.А. Роль кремния в устойчивости риса к пирикуляриозу. // ДАН СССР, 1986, т.291, №2. - С.499-502), принятый нами в качестве прототипа, включающий весовое определение тотального содержания SiO2 в навеске изучаемого растительного объекта. Растительный материал сжигается в смеси концентрированных неорганических кислот (HNO3:HClO4:H2SO4 в соотношении 5:2:1) до обесцвечивания смеси. Образовавшийся осадок промывается дистиллированной водой на беззольный фильтр до нейтральной реакции, фильтр переносится в заранее взвешенный фарфоровый тигель, высушивается при 80°С и фильтр с осадком обугливается на электрической печке, а затем прокаливается в муфельной печи при 550°С до постоянного веса. Осадок, выраженный в процентах, дает информацию о содержании кремнезема в изучаемом материале.
Способ, наряду с преимуществами (простота исполнения, недорогостоящие реактивы), имеет следующие недостатки: длительность исполнения (6 дней), использование концентрированных (неорганических) кислот, требующих большой осторожности и аккуратности при выполнении.
В последнее время при изучении устойчивости к пирикуляриозу наибольший интерес представляют изменения, происходящие в фенольном комплексе растений. Эти соединения обладают высокой и разнообразной физиологической активностью и их роль в устойчивости растений по многим грибным заболеваниям считается установленной (Кефели В.И. Природные ингибиторы и фитогормоны. М.: Наука. 1974. - 253 с.).
Задачей изобретения является определение устойчивости риса к патогену по интенсивности окрашивания поперечных срезов главных побегов растений риса, обусловленной тотальным содержанием фенолов.
Поставленная задача достигается тем, что поперечные срезы главных побегов растений риса, отобранные в фазу молочно-восковой спелости, обрабатывали по Фурст Г.Г. (Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей. М.: Наука. 1979. С.111) последовательно растворами азотно-кислого натрия, мочевины, уксусной кислоты и едкого натрия и затем микроскопировали.
Пример конкретного выполнения.
Свежие срезы сортообразцов риса из контрольного питомника и конкурсного сортоиспытания последовательно обрабатывали реактивами, взятыми в равных объемах. Срезы выдерживали в 10%-ом растворе азотнокислого натрия (NaNO3) в течение 5 минут, затем раствор удаляли фильтровальной бумагой. Срезы помещали в 20%-ый раствор мочевины CO(NH2)2 на 5 минут, раствор удаляли фильтровальной бумагой и помещали срезы в 10%-ный раствор уксусной кислоты (СН3СООН) на 5 минут. Ополаскивали срезы дистиллированной водой и удаляли воду фильтровальной бумагой. Затем помещали срезы на 5 минут в два объема 2н раствора едкого натрия (NaOH). Появление окраски различной интенсивности свидетельствовало о наличии фенольных соединений.
Срезы просматривали на микроскопе (Wild) и по степени окрашивания поперечного среза (от светло-желтого до коричневого), обусловленного количеством синтезированных фенолов, судили о степени устойчивости анализируемого материала к патогену.
На основании проведенных исследований сформулирована шкала устойчивости, позволяющая определить устойчивость форм исходного материала риса к пирикуляриозу с минимальными затратами времени (40 минут/1 образец) и реактивов. Предложенный способ может быть использован для экспрессной оценки исходного материала на устойчивость к патогену:
от коричневого до светло-коричневого - высокоустойчивый (ВУ);
от ярко-оранжевого до ярко-желтого - устойчивый (У);
от желтого до бледно-желтого - неустойчивый.
Результаты исследований приведены в таблице.
Анатомо-морфологические исследования сортообразцов риса из контрольного и конкурсного сортоиспытания
| Вариант | Окрашивание | Степень устойчивости |
| ВНИИР 10178 | коричневый | ВУ |
| Гарант | коричневый | ВУ |
| СПСУ-07-206 | светло-коричневый | ВУ |
| Лиман | оранжево-желтый | У |
| Анаит | оранжево-желтый | У |
| Сонет | ярко-желтый | У |
| КПСУ-07-228 | ярко-желтый | У |
| ВНИИР 10173 | ярко-желтый | У |
| ВНИИР 10191 | оранжево-желтый | У |
| ВНИИР 10186 | оранжево-желтый | У |
| ВНИИР 10191 | оранжево-желтый | У |
| СПСУ-07-155 | оранжево-желтый | У |
| Рубин | бледно-желтый | НУ |
| ВНИИР 10177 | желтый | НУ |
| Серпантин | желтый | НУ |
| Шарм | желтый | НУ |
| Фишт | желтый | НУ |
| Соната | желтый | НУ |
| СПСУ-07-165 | желтый | НУ |
| СПСУ-07-204 | желтый | НУ |
Из полученных данных следует, что сортообразцы по устойчивости к пирикуляриозу разделились на три группы: высокоустойчивые - ВНИИР 10178, Гарант, СПСУ-070206, устойчивые - Лиман, Анаит, Сонет, КПСУ-07-228, ВНИИР 10173, ВНИИР 10191, ВНИИР 10186, ВНИИР 10191, СПСУ-07-155, и неустойчивые - Рубин, ВНИИР 10177, Серпантин, Шарм, Фишт, Соната, СПСУ-07-165, СПСУ-07-204.
Способ оценки устойчивости исходного селекционного материала риса к пирикуляриозу, отличающийся тем, что поперечные срезы главных побегов, отобранных в фазу молочно-восковой спелости, обрабатывают последовательно растворами азотно-кислого натрия, мочевины, уксусной кислоты, едкого натрия и по степени окрашивания поперечного среза судят о степени устойчивости анализируемого материала к пирикуляриозу:
от коричневого до светло-коричневого - высокоустойчивый (ВУ);
от ярко-оранжевого до ярко-желтого - устойчивый (У);
от желтого до бледно-желтого - неустойчивый (НУ).
