Способ прогноза чувствительности к интерферону у больных почечно-клеточным раком
Владельцы патента RU 2437101:
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера Сибирского отделения РАМН (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и онкологии, и касается способа прогноза чувствительности к интерферону у больных почечно-клеточным раком (ПКР). Сущность способа заключается в том, что до начала проведения интерферонотерапии с помощью биолюминесцентного метода определяют активности ферментов в лимфоцитах периферической крови больных: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ) и НАД-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ). Рассчитывают коэффициент соотношения пластического и энергетического обмена (СПЭО), представляющий собой отношение произведения активностей Г6ФДГ и НАДФГДГ к произведению активностей МДГ и НАДГДГ. При значении СПЭО, равном или более 0,12, прогнозируют чувствительность к интерферону, а при значении СПЭО менее 0,12 прогнозируют резистентность к интерферону. Использование способа позволяет достоверно прогнозировать клеточную чувствительность больных ПКР к интерферону до начала интерферонотерапии и может быть рекомендован для применения в клинической практике. 2 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и онкологии, и может быть использовано при лечении больных раком почки.
Известен способ оценки чувствительности к интерферону у больных почечно-клеточным раком (ПКР), заключающийся в исследовании крови пациента in vitro с помощью хемилюминесцентного анализа по индексу чувствительности, который представляет собой отношение индекса активации нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона к индексу активации нейтрофильных гранулоцитов без интерферона [7]. Недостатком способа является невозможность прогноза клеточной чувствительности до начала интерферонотерапии.
Задачей изобретения является создание информативного способа прогноза клеточной чувствительности к интерферону у больных ПКР до начала интерферонотерапии.
Поставленную задачу решают за счет того, что до начала проведения интерферонотерапии с помощью биолюминесцентного метода определяют активности ферментов в лимфоцитах периферической крови больных ПКР: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ) и НАД-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ). Затем рассчитывают коэффициент соотношения пластического и энергетического обмена (СПЭО), представляющий собой отношение произведения активностей Г6ФДГ и НАДФГДГ к произведению активностей МДГ и НАДГДГ, т.е. СПЭО=(Г6ФДГ×НАДФГДГ)/(МДГ×НАДГДГ).
При значении СПЭО, равном или более 0,12, прогнозируют чувствительность больных ПКР к интерферону, а при значении СПЭО менее 0,12 прогнозируют резистентность к интерферону.
Значение 0,12 получено опытным путем на основании сопоставления значений рассчитываемого коэффициента (СПЭО) и эффективности интерферонотерапии больных ПКР. Эффективность интерферонотерапии определялась хемилюминесцентным методом по клеточной чувствительности к интерферону лейкоцитов крови больных ПКР [7] после проведения первого курса интерферонотерапии.
Коэффициент соотношения пластического и энергетического обмена характеризует уровень интенсивности пластических и энергетических процессов, а именно: при значении коэффициента, равном или более 0,12, наблюдается преобладание пластических процессов в лимфоцитах (увеличивается наработка НАДФН). Следовательно, клетки становятся более чувствительными к интерферону. При значении коэффициента менее 0,12 наблюдается преобладание энергетических процессов лимфоцитов, снижение реакций макромолекулярного синтеза (в том числе и синтеза клеточных рецепторов). В этом случае клетки менее чувствительны к интерферону.
Одной из актуальных проблем современной онкологии является высокий уровень заболеваемости почечно-клеточным раком, на долю которого приходится около 97% всех опухолей почек [4, 6]. Известно, что иммунная система играет центральную роль в механизмах противоопухолевой защиты организма [3]. На сегодняшний день наиболее целесообразным подходом в лечении ПКР является комбинация хирургического метода и адъювантной иммунотерапии препаратами интерферона, среди которых используется рекомбинантный интерферон-α2а [6]. Важную роль в эффективности лечебных мероприятий и прогнозе интерферонотерапии играет состояние противоопухолевой реактивности организма, уровень которой связывают главным образом с функциональной активностью клеток иммунной системы [1, 3, 4, 5].
В настоящее время не вызывает сомнений, что в основе функциональных проявлений лимфоцитов лежат их метаболические реакции. При этом учитывая, что все модуляторы функциональной активности лимфоцитов прежде всего изменяют метаболизм клетки, переключая субстратный поток с одного метаболического пути на другой, влияя на энергетику клетки и синтетические процессы, нарушения иммунной системы не могут не иметь метаболической основы.
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) осуществляет дегидрирование глюкозо-6-фосфата и кофермента НАДФ. Образовавшийся в ходе данной реакции 6-фосфоглюконо-5-лактон является нестабильным и гидролизуется либо спонтанно, либо с помощью фермента 6-фосфоглюконолактоназы с образованием 6-фосфоглюконата. Г6ФДГ катализирует инициализирующую и ключевую реакцию пентозофосфатного цикла. В норме доля пентозофосфатного цикла в количественном превращении глюкозы обычно невелика и варьирует в зависимости от типа ткани и функционального состояния клеток. Пентозофосфатный цикл имеет важное значение для системы внутриклеточного метаболизма. Он поставляет НАДФН для реакций биосинтеза жирных кислот, холестерина и др. За счет пентозофосфатного цикла приблизительно на 50% покрывается потребность клеток в НАДФН. Кроме того, продуктами пентозофосфатного цикла являются различные пентозофосфаты, которые необходимы для реакций синтеза нуклеиновых кислот и ряда коферментов [2, 12, 14].
Малатдегидрогеназа (МДГ, КФ 1.1.1.37) - фермент, катализирующий обратимое окисление маната в оксалоацетат. Фермент локализуется как в митохондриях (цикл трикарбоновых кислот), так и в цитоплазме. В митохондриях уровень соотношения НАДН/НАД относительно велик, в результате чего внутримитохондриальный оксалоацетат легко восстанавливается в малат, который легко выходит из митохондрий. В цитоплазме уровень отношения НАДН/НАД мал, что приводит к окислению малата при участии цитоплазматической НАД-зависимой МДГ. МДГ принимает участие в реакциях азотного обмена. Одним из ключевых интермедиатов азотного обмена является аспартат, который синтезируется в результате трех сопряженных реакций. В ходе первой реакции фумарат под действием фумаразы присоединяет воду и превращается в малат. Во второй реакции малат под действием МДГ окисляется до оксалоацетата, который в третьей реакции - трансаминирования с глутаматом - преобразуется в аспартат. МДГ принимает активное участие в работе малатаспартатного водородного шунта митохондрий. Данная система работает благодаря наличию МДГ и аспартатаминотрансферазы как в цитоплазме, так и в митохондриях. Водородный шунт работает следующим образом. Сначала водород от синтезированного в цитоплазме НАДН переносится на цитоплазматический оксалоацетат. В результате образуется малат, который с помощью системы, транспортирующей дикарбоновые кислоты, проходит через внутреннюю мембрану митохондрий в матрикс. В матриксе митохондрий с помощью МДГ малат окисляется в оксалоацетат, а матриксный НАД+ восстанавливается до НАДН, который может передавать свои электроны в дыхательную цепь, локализованную на внутренней мембране митохондрий. В свою очередь оксалоацетат в присутствии глутамата и аспартатаминотрансферазы вступает в реакцию трансаминирования. Образовавшиеся в результате данной реакции α-кетоглутарат и аспартат с помощью специальных транспортных систем способны проходить через мембрану митохондрий [2, 15].
Глутаматдегидрогеназа осуществляет окислительное дезаминирование L-глутаминовой кислоты. В качестве кофермента глутаматдегидрогеназа использует НАД (НАДГДГ, КФ 1.4.1.2) или НАДФ (НАДФГДГ, КФ 1.4.1.4). Реакция включает анаэробную фазу дегидрирования глутаминовой кислоты с образованием промежуточного продукта - иминоглутаровой кислоты, после чего происходит спонтанный гидролиз с образованием аммиака и α-кетоглутаровой кислоты. Ферментативные реакции глутаматдегидрогеназ обратимые, соответственно аммиак в присутствии НАД(Ф)Н и α-кетоглутаровой кислоты может участвовать в синтезе глутамата. Глутаматдегидрогеназа - один из наиболее изученных олигомерных ферментов азотистого метаболизма с молекулярной массой 312000, который состоит из 6 субъединиц. Фермент проявляет свою активность только в мультимерной форме. При диссоциации глутаматдегидрогеназы на субъединицы, которая происходит в присутствии НАДН, ГТФ и ряда стероидных гормонов, фермент теряет способность осуществлять окислительное дезаминирование глутаминовой кислоты, но приобретает способность дезаминировать ряд других аминокислот. Подобная особенность характеризует аллостерический механизм регуляции глутаматдегидрогеназы и определяет данный фермент как регуляторный в системе аминокислотного обмена [2, 10, 13].
Способ выполняется следующим образом. У больных ПКР после операции радикальной нефрэктомии перед курсом интерферонотерапии забирают 2 мл венозной крови из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином. Выделяют лимфоциты. Центрифугируют на градиенте плотности фиколл-верографина по стандартной методике А. Boyum (1968) [11]. Подсчитывают концентрацию лимфоцитов, например, в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода лимфоцитов, которая составляет не менее 97%. 1 млн выделенных клеток используют для определения уровней активности в лимфоцитах ферментов Г6ФДГ, МДГ, НАДФГДГ и НАДГДГ одним из известных способов, например, биолюминесцентным [8, 9]. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| Фермент | Субстрат, мМ | Кофактор, мМ | рН буфера |
| Г6ФДГ | Глюкоза-6-фосфат - 1,5 | НАДФ - 0,025 | 9,8 |
| МДГ | Малат - 2,0 | НАД - 2,50 | 9,8 |
| НАДФГДГ | Глутамат - 0,5 | НАДФ - 1,65 | 9,8 |
| НАДГДГ | Глутамат - 8,7 | НАД - 8,10 | 9,8 |
Примечание: среду с рН 9,8 готовят на Трис-НСl буфере (ICN Biomedicals Inc., США).
После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×l0-5M, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН: ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1М K+, Na+-фocфaтнoм буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминометра, например марки "БЛМ-8803", измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение производят в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН и НАДН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН или НАДН в диапазоне 10-9-10-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАДФН:ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят на основе соответствующего буфера. Активность дегидрогеназ рассчитывают по формуле: А=Δ[С]×V/Т,
где А - активность дегидрогеназы, Е на 1×104 лимфоцитов (1Е=1 мкмоль/мин [2]);
Δ[С] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;
V - объем пробы, мл;
Т - время инкубации, мин.
Затем рассчитывают коэффициент СПЭО. Значение СПЭО, равное или выше 0,12 свидетельствует о чувствительности больного ПКР к интерферону: интерферонотерапия показана. Значение СПЭО ниже 0,12 свидетельствует об отсутствии чувствительности к интерферону и неэффективности интерферонотерапии: интерферонотерапию не рекомендуют.
Данный способ апробирован на 19 больных ПКР. Исследования были проведены через 4 недели после радикальной нефрэктомии перед началом интерферонотерапии. Все наблюдаемые больные получали реаферон (интерферон-а2а) парантерально 3 раза в неделю. Интерферонотерапия включала: количество инъекций на цикл - 12, интервал между циклами - 3 недели, количество циклов до 4-х. Клеточную чувствительность оценивали с помощью хемилюминесцентного анализа [7]. Результаты представлены в табл.2.
| Таблица 2 | ||||
| Исследование клеточной чувствительности к интерферону-α2а | ||||
| № п/п | Показатель СПЭО | Чувствительность (по предложенному способу) | Чувствительность (хемилюминесцентным методом по [7]) | Совпадение прогноза |
| 1 | 18,26 | Должна быть | Есть | + |
| 2 | 0,29 | Должна быть | Есть | + |
| 3 | 0,00 | Не будет | Есть | - |
| 4 | 7,44 | Должна быть | Есть | + |
| 5 | 9,58 | Должна быть | Есть | + |
| 6 | 0,46 | Должна быть | Есть | + |
| 7 | 0,03 | Не будет | Есть | - |
| 8 | 26,59 | Должна быть | Есть | + |
| 9 | 0,48 | Должна быть | Есть | + |
| 10 | 0,00 | Не будет | Нет | + |
| 11 | 0,01 | Не будет | Нет | + |
| 12 | 0,00 | Не будет | Нет | + |
| 13 | 0,00 | Не будет | Нет | + |
| 14 | 0,00 | Не будет | Нет | + |
| 15 | 0,00 | Не будет | Нет | + |
| 16 | 0,00 | Не будет | Нет | + |
| 17 | 0,00 | Не будет | Нет | + |
| 18 | 0,11 | Не будет | Нет | + |
| 19 | 0,05 | Не будет | Нет | + |
У десяти из 19 наблюдаемых больных (№10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 в таблице) клеточной чувствительности к интерферону-α2а после курса лечения не было. У больных, данные которых представлены под №1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 в таблице, клеточная чувствительность к интерферону-α2а после курса лечения была. У двух больных (№3, 7 в таблице) показатели коэффициента СПЭО не позволили точно спрогнозировать клеточную чувствительность к интерферону-α2а после курса лечения. У 17 из 19 больных этой группы отмечено совпадение прогноза клеточной чувствительности к интерферону-α2а по предложенному способу, что составило 89,5% случаев.
Клинический пример 1. Больная X., 47 лет. История болезни №1437/217. Находилась на стационарном лечении в химиотерапевтическом отделении Красноярского краевого онкологического диспансера с 09.03.2005 г. по 22.03.2005 г. для проведения первого курса интерферонотерапии. Диагноз: Cancer ren dextrae T3N0M0. Состояние после радикальной нефрэктомии справа. An. morbid. По поводу Cancer ren dextrae T3N0M0 01.02.2005 г.выполнена операция: лапаротомия, радикальная нефрэктомия справа. Гистологическое исследование №4008-28: в представленном препарате почки картина почечно-клеточного рака, светлоклеточный вариант.
До проведения интерферонотерапии проведено обследование больной по предложенному способу. СПЭО равен 9,58 (выше 0,12), что позволяет прогнозировать наличие чувствительности к интерферону. Интерферонотерапия показана. Больная получила курс интерферонотерапии реафероном (интерферон-α2а) в суточной дозе 8 млн ME по схеме 7 инъекций препарата внутримышечно через день. Суммарная доза реаферона составила 56 млн ME. Исследование чувствительности к интерферону хемилюминесцентным методом [7], проведенное после I курса интерферонотерапии, показало наличие чувствительности больной к интерферону.
Клинический пример 2. Больная Б., 51 год. История болезни №4733/790. Находилась на стационарном лечении в Красноярском краевом онкологическом диспансере с 19.07.2004 г. по 02.08.2004 г. с диагнозом: Cancer ren dextrae T3N0M0. Состояние после радикальной нефрэктомии справа. An. morbid. По поводу Cancer ren dextrae T3N0M0 02.06.2004 г. выполнена операция: лапаротомия, радикальная нефрэктомия справа. Гистологическое исследование №23947-58: в препарате почки картина почечно-клеточного рака, светлоклеточный вариант с кровоизлияниями и признаками инвазии в капсулу.
До проведения интерферонотерапии проведено обследование больной по предложенному способу. СПЭО равен 0,11 (меньше 0,12), что отражает отсутствие чувствительности данной больной к интерферону. Интерферонотерапия не рекомендована.
Технический результат от реализации предложенного способа:
- возможность прогнозирования чувствительности больных ПКР к препаратам интерферона до начала интерферонотерапии;
- дифференцированный подход к использованию интерферонотерапии в лечении больных ПКР;
- избавление больного от токсического действия малоэффективных для него препаратов в случае интерферонорезистентности;
- высокий уровень совпадения прогноза.
Таким образом, предложенный способ позволяет достоверно прогнозировать клеточную чувствительность больных ПКР к интерферону до начала интерферонотерапии и может быть рекомендован для применения в клинической практике.
Источники информации
1. Бережная Н.М. Иммунитет и злокачественные новообразования //Вестник РАМН. - 1998. - №1. - С.20-31.
2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М.: Высшая школа, 1998, 479 с.
3. Долгих Ф.И. Опухолевый рост. - М.: Медицинская книга, 2001, 81 с.
4. Заридзе Д.Г., Мень Т.Х. Приоритетные направления противораковой борьбы в России //Российский онкологический журнал.-2001. - №5. - С.5-14.
5. Зимушко Е.И., Белозеров Е.С., Митин Ю.А. Клиническая иммунология. - СПб., 2001. - 576 с.
6. Козлов В.К., Молчанов О.Е., Жаринов Г.М. Иммунотерапия рекомбинантными цитокинами в лечении онкологических больных // Сб. "Успехи клинической иммунологии и аллергологии", том III. Под ред. А.В.Караулова. - М.: Изд-во регионального отделения РАЕН. - 2002. - С.263-279.
7. Способ оценки чувствительности к интерферону у больных раком почки. RU 2293988 С2, опубл. 20.02.2007.
8. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови биолюминесцентным методом // Лабораторное дело. - №11. - С.23-25.
9. Савченко А.А. Биолюминесцентное определение активности НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ лимфоцитов//Лабораторное дело. - 1991. - №11. - С.22-25.
10. Brosnan J.T. Glutamate, at the interface between amino acid and carbohydrate metabolism//J.Nutr. - 2000. - Vol.130, Suppl. 4. - P.988S-990S.
11. Boyum A. Isolation of lymphocytes from blood and bone marroow//Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1968. - Vol.21, Suppl. 97. - P.77-80.
12. Clarke J.L., Vulliamy T.J., Roper D. et al. Combined glucose-6-phosphate dehydrogenase and glucosephosphate isomerase deficiency can alter clinical outcome //Blood Cells Mol. Dis. - 2003. - Vol.30, №3. - P.258-263.
13. Herrero-Yraola A., Bakhit S.M., Franke P. et al. Regulation of glutamate dehydrogenase by reversible ADP-ribosylation in mitochondria //EMBO J. - 2001. - Vol.20, №10. - P.2404-2412.
14. Salati L.M., Amir-Ahmady B. Dietary regulation of expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase //Annu. Rev. Nutr. -2001. - Vol.21. - P.121-140.
15. Steen I.H., Hvoslef H., Lien Т., Birkeland N.K. Isocitrate dehydrogenase, malate dehydrogenase, and glutamate dehydrogenase from Archaeoglobus fulgidus //Methods Enzymol. - 2001. - Vol.331. - P.13-26.
Способ прогноза чувствительности к интерферону у больных почечно-клеточным раком путем исследования ферментов лимфоцитов периферической крови больных, отличающийся тем, что до начала проведения интерферонотерапии с помощью биолюминесцентного метода определяют активности ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ) и НАД-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ), после чего рассчитывают коэффициент соотношения пластического и энергетического обмена (СПЭО), представляющий собой отношение произведения активностей Г6ФДГ и НАДФГДГ к произведению активностей МДГ и НАДГДГ, т.е. СПЭО=(Г6ФДГ×НАДФГДГ)/(МДГ×НАДГДГ), и при значении СПЭО равном или более 0,12 прогнозируют чувствительность к интерферону, а при значении СПЭО менее 0,12 прогнозируют резистентность к интерферону.
