Способ получения сыворотки крови плодов коров для культивирования клеток животных и человека
Владельцы патента RU 2455015:
Федеральное государственное учреждение "Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных" (ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и иммунологии и может быть использовано при культивировании линии клеток животных и человека. Способ включает взятие крови, отделение сыворотки, ее 2-кратную стерилизующую фильтрацию. Кровь у плодов берут унифицированной стерильной системой в стеклянные флаконы емкостью 250 мл с гипертоническим раствором NaCl. Флаконы заполняют на 80-100%. Взятие крови осуществляют через углубление у краниальной части грудной кости. Сыворотку отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30-40 минут. После сбора сыворотку замораживают при -15…-20°С не менее 7 суток. После разморозки при +4…+20°С сыворотку собирают и удаляют сильно гемолизированные слои. После чего полученную сыворотку предварительно фильтруют через глубинные фильтры EKS, а затем через стерилизующие мембранные фильтры при +2…+6°С. Способ позволяет увеличить выход целевого продукта и улучшить его качество. 7 табл., 7 пр.
Изобретение относится к биотехнологии при культивировании клеток животных и человека. Фетальная сыворотка обеспечивает рост крайне прихотливых культур клеток, но она дефицитна и дорогостоящая по причине, прежде всего, ограниченного количества доноров, а также несовершенства существующих технологий ее получения.
Известен ряд способов получения сыворотки плодов коров, которые взяты нами в качестве аналогов предлагаемого изобретения (Романюк Е.Н. и др. Опыт получения препарата сыворотки крови эмбрионов коров // Цитология // 1983. - Т.25. - №9. - С.1093; Каулен Д.Р. и др. А.с. 1015894, МКИ3 А61К 31/00 (СССР), 1983. Способ получения эмбриональной сыворотки крови; Хазипов Н.З. и др. Методические рекомендации по ускоренному получению сыворотки крови животных для культивирования клеток и вирусологических исследований методом центрифугирования. М., 1985, с.2-5; Хаертынов К.С. и др. Фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота // Ветеринария. - 1990. - №3. - С.62-63; Franz H. et al. Patent 223921, MKI3 А61К 35/16. (DDR), 1985. Verfahren zur Gewinung von fetalen Kälberserum und fetaler substanzen; W. Wittmann et al. Patent 223922, MKI3 А61К 35/16 (DDR), 1985. Verfahren zur Gewinung von fetalem und neonatalem Kälberserum). Близких аналогов данного способа за последние годы в доступной литературе и в интернете нами не обнаружено.
Общими для этих способов получения фетальной сыворотки плодов коров являются следующие недостатки:
1. Взятие крови проводится у 5-9-месячных плодов коров без учета эффективности их обескровливания. Поэтому при совершенствовании технологии получения данной сыворотки первостепенное внимание было уделено оптимизации взятия крови, что отражено в авторском свидетельстве СССР №1544965 «Способ взятия крови из сердца эмбрионов коров» от 3 января 1991 года (Гурьянов Н.И. и др.), которое взято нами в качестве близкого аналога по данному звену технологической цепи получения фетальной сыворотки.
2. Выход сыворотки к объему взятой крови мал и составляет 50%.
3. Данные технологии не имеет профилактических мер и методов удаления факторов, ингибирующих рост клеток (остаточный гемоглобин, общие липиды и др.). Для улучшения качественных параметров фетальной сыворотки в качестве аналога нами взят способ, описанный в патенте РФ №1813783 «Способ получения сыворотки крови животных для культивирования клеток животных тканей» от 5 марта 1994 года (Гурьянов Н.И. и др.)
Другим аналогом, но только по качественным характеристикам, является фетальная сыворотка крови плодов коров, которая до сих пор считается самой лучшей биологической добавкой в питательные среды при выращивании культур клеток животных и человека (ТУ ФС 42-7ВС-85), утвержденной Минздравом СССР 4 апреля 1985 года. В табл.1 приведены качественные показатели, которым должна соответствовать сыворотка крови плодов коров.
| Таблица 1 | |
| Показатели качества сыворотки крови плодов коров по ТУ ФС 42-7ВС-85 | |
| Показатели | Сыворотка крови плодов коров по ТУ ФС 42-7 ВС-85 |
| Прозрачность (535 нм) | Не более 0,300 ед. оптической плотности |
| рН | 7,6±0,2 |
| Свободный гемоглобин | Не более 50 мг/дл |
| Общие липиды | 30-50 мг/дл |
| Холестерин | 10-20 мг/дл |
| Общий белок, в том числе: | 4,5±2,5 г/дл |
| альбумины | 55±5% |
| α-глобулины | 35±5% |
| β-глобулины | 10±5% |
| γ-глобулины | Ниже 1% |
| Ростстимулирующая активность на перевиваемых линиях клеток по | |
| индексу их пролиферации | Не менее 6,0-7,0 |
Наиболее близким по техническому решению является способ получения сыворотки крови плодов коров, описанный Хазиповым Н.З. и др. в 1985 году, который взят нами в качестве прототипа предлагаемого изобретения, но при апробации получения сыворотки по данной технологии обнаружен ряд существенных недостатков, имеющих место при взятии крови, отделении из нее сыворотки и ее стерилизации.
Недостатки при взятии крови сводятся к следующему:
1. Экспериментально установлено, что объем взятой крови, выраженный в процентах от массы тела, мал и составляет: у плодов - 1-5 кг - 3,07±0,23; 5-10 кг - 2,87±0,16; свыше 10 кг - 2,33±0,26.
2. Место прокола иглой довольно неопределенно (между 3 и 4 ребрами с левой стороны плода), поэтому левосторонняя кардиопункция часто бывает неудачной.
3. Объем крови, извлекаемый ординарными системами у плодов массой 1-4 кг, незначителен. Их использование в данном случае практически невозможно. Это большой недостаток, если учесть, что плоды массой 1-4 кг составляют иногда 40-50% от общего их количества. Данный недостаток существует и в экономических патентах ГДР.
4. Иглы типа «Рекорд» имеют малый диаметр (1-1,5 мм), что не дает возможности для быстрого обескровливания, а иглы диаметром 5-7 мм сильно травмируют (особенно при повторном проколе) сердце плода и кровь в значительной степени изливается в грудную полость.
5. Система типа «елочка» неудобна в эксплуатации, так как громоздка и при неудачной кардиопункции в дальнейшем не может быть использована.
6. Флаконы заполняют кровью лишь на 50-60% их объема, что нерационально и требует большего их количества.
Недостатком отделения сыворотки плодов коров по прототипу является то, что полузаполненные кровью флаконы, выдержанные 4-5 часов при температур +6…+10°С, центрифугируют лишь при скорости 700-800 об/мин не менее 40-50 минут. Сбор сыворотки проводят под разрежением у пламени горелки из открытых флаконов, расположенных под углом 45°,с помощью толстой стеклянной трубки, что приводит к попаданию в собранную сыворотку большого количества форменных элементов крови и в каждом флаконе остается по 20-25 мл сыворотки.
Недостатком стерилизации ее является то, что фильтрацию проводят в день сбора сыворотки через набор миллипоровых фильтров при положительном давлении 0,5-0,7 атм, причем в подогретом виде до +30…+37°С. Каждодневная фильтрация сыворотки создает дополнительные трудности, большой расход фильтров и ведет к значительной ее потере. Профильтрованную сыворотку через 7-14 дней подвергают повторной стерилизации, так как на дно флаконов выпадает осадок.
Цель предлагаемого изобретения - повышение эффективности способа на всех этапах технологической цепи получения сыворотки крови плодов коров, включая улучшение ее биологических свойств.
Поставленная цель решается за счет существенных изменений в способах взятия крови, отделения и стерилизации сыворотки крови плодов коров.
Способ получения сыворотки крови плодов коров для культивирования клеток животных и человека, включающий взятие крови, отделение сыворотки, 2-кратную стерилизующую ее фильтрацию, отличающийся тем, что кровь у плодов берут унифицированной стерильной системой в стеклянные флаконы емкостью 250 мл с гипертоническим раствором NaCl, заполняя их на 80-100%, кардиопункцию проводят через углубление у краниальной части грудной кости, отделение сыворотки центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30-40 минут, после сбора сыворотки ее замораживают при -15…-20°С не менее 7 дней, после разморозки при +4…+20°С сыворотку собирают, удаляя сильно гемолизированные слои, предварительно фильтруют через глубинные фильтры EKS, а затем через стерилизующие мембранные фильтры при +2…+6°С.
Отличительные признаки и полезная эффективность предлагаемого способа взятия крови из сердца плодов коров сводятся к следующему:
1. Кардиопункция через углубление у краниальной части грудной кости более проста, надежна в исполнении;
2. Взятие крови проводят асептически унифицированной системой, включающей в себя иглу с внутренним диаметром 3 мм и силиконовую трубку во флаконы емкостью 250 мл.
3. Для смачивания внутренних поверхностей флаконов и для лучшей ретракции сгустка крови во флаконы наливают 5% раствор натрия хлористого из расчета 2 мл на 100 мл крови.
4. Взятие крови проводят в 2 этапа: первый - кардиопункция и свободное стекание крови (до прекращения) из плодов, подвешенных за задние конечности в вертикальном положении, второй - принудительное удаление крови, заключающееся в массаже тела, поднятии головы и шеи выше уровня проекции сердца, с одновременным наружным его массажем.
5. Флаконы заполняют кровью до 80-100% их объема, помещают в вертикальном положении в холодную воду со льдом (температура +6…+8°С), где их выдерживают до центрифугирования 3-4 часа.
6. Преимущества предлагаемого способа взятия крови у плодов коров дают возможность для увеличения объема забираемой крови в сравнении с прототипом в 2-3 раза, что ведет к снижению себестоимости конечной продукции.
Отделение и сбор сыворотки также имеют отличительные признаки. По усовершенствованной нами методике флаконы, заполненные кровью, центрифугируют 30-40 минут при скорости 1800-2000 об/мин, а сбор отделившейся сыворотки проводят под разрежением специальной системой во флаконы емкостью 500 мл до отметки 400 мл и замораживают при температуре -15…-20°С не менее 7 суток. После первого осторожного сбора светлой сыворотки из флаконов проводят повторный сбор ее со взвесью форменных элементов во флаконы емкостью 250 мл, которые подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10-15 минут, что позволяет дополнительно извлекать в расчете на каждый флакон с кровью плодов коров 10-15 мл светлой сыворотки. Выход сыворотки по сравнению с прототипом велик и варьирует от 60 до 75% от объема крови.
Отличительные признаки стерилизации сыворотки по предлагаемой технологии сводятся к следующему. После оттаивания при температуре +4…+20°С из сыворотки выпадают нестойкие белки в осадок, которые отфильтровывают через плотную ткань, после чего сыворотку крови предварительно фильтруют при +2…+6°С через глубинные фильтры EKS, а затем через стерилизующие мембранные фильтры любой надежной фирмы, например «Millipore Intertec» США, ее филиала в Ирландии, или «Владисарт» Россия.
Существенным отличием способа получения сыворотки крови плодов коров является то, что мы используем унифицированную нами технологию ее получения, что иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Взятие крови у плодов коров по предлагаемому способу в сравнительном аспекте с прототипом
Исследования по взятию крови проведены на достаточно большом количестве плодов коров и результаты отражены в табл.2.
| Таблица 2 | ||
| Результаты взятия крови у плодов коров по известному прототипу и предлагаемому способам | ||
| Группы плодов коров с массой тела, кг | Способ взятия крови | |
| известный М±m | предлагаемый М±m | |
| До 5 кг | ||
| Количество плодов | 12 | 10 |
| Взято крови к живой массе, % | 3,07±0,23 | 5,35±0,23 |
| 5-10 кг | ||
| Количество плодов | 10 | 9 |
| Взято крови к живой массе, % | 2,87±0,16 | 5,20±0,18 |
| Больше 10 кг | ||
| Количество плодов | 6 | 12 |
| Взято крови к живой массе, % | 2,33±0,26 | 5,00±0,13 |
Как следует из табл.2, преимущества предлагаемого способа взятия крови у плодов коров по сравнению с прототипом очевидны.
Пример 2. Влияние концентрации раствора натрия хлористого на выход сыворотки крови плодов коров и содержание в ней общего белка и остаточного гемоглобина
Для изучения влияния концентрации натрия хлористого на выход сыворотки и содержание в ней общего белка и остаточного гемоглобина кровь брали у 13 плодов коров массой тела 13,5-30,6 кг. С возрастанием концентрации раствора натрия хлористого достоверно увеличивался выход сыворотки крови и снижалось содержание в ней остаточного гемоглобина. Изменение уровня белка в сыворотке крови статистически недостоверно, но масса общего белка в объеме сыворотки, отделившейся из 1 л крови, увеличилась с повышением концентрации солевого раствора и составляла при 1%-ной его концентрации 19,1±0,4 г, 5%-ной - 20,7±0,4 г и 10%-ной - 22,5±0,4 г. Результаты проведенных исследований отражены в табл.3.
| Таблица 3 | ||||
| Влияние концентрации раствора натрия хлористого на выход сыворотки крови плодов коров и содержание в ней общего белка и остаточного гемоглобина | ||||
| Концентрация раствора NaCl, % | Выход сыворотки | Концентрация общего белка в сыворотке крови, г/л | Концентрация гемоглобина в сыворотке крови, мл/100 мл | |
| мл | % к объему крови | |||
| 1(контроль) | 130,0±2,4 | 52,0±1,0 | 36,8±0,7 | 28,2±1,3 |
| 5 | 144,8±1,8 | 57,8±0,7 | 35,8±0,7 | 23,7±1,1 |
| Р<0,001 | Р>0,05 | Р<0,01 | ||
| 10 | 160,4±1,7 | 64,2±0,7 | 35,1±0,7 | 23,1±1,0 |
| Р<0,001 | Р>0,05 | Р<0,01 |
Использование гипертонического раствора натрия хлористого не только способствует увеличению выхода сыворотки, но также улучшает ее ростстимулирующую активность на культурах клеток.
Пример 3. Влияние объема 10%-ного раствора натрия хлористого на выход сыворотки крови плодов коров и содержание в ней общего белка и остаточного гемоглобина. Результаты исследований приведены в табл.4.
| Таблица 4 | ||||
| Влияние объема 10%-ного раствора натрия хлористого на выход сыворотки крови плодов коров и содержание в ней общего белка и остаточного гемоглобина | ||||
| Объем раствора NaCl на100 мл крови, мл | Выход сыворотки | Концентрация общего белка в сыворотке крови, г/л | Концентрация гемоглобина в сыворотке крови, мл/100 мл | |
| мл | % к объему крови | |||
| 1 (контроль) | 137,1±2,0 | 54,9±0,8 | 39,8±1,6 | 23,5±2,1 |
| 2 | 154,3±1,8 | 61,7±0,7 | 38,3±1,7 | 22,3±1,3 |
| Р<0,001 | Р>0,05 | Р>0,05 | ||
| 3 | 154,3±1,8 | 61,7±0,7 | 36,8±1,6 | 22,7±1,6 |
| Р<0,001 | Р>0,05 | Р>0,05 | ||
| 4 | 154,3±1,8 | 61,7±0,7 | 35,6±1,7 | 23,3±1,7 |
| Р<0,001 | Р>0,05 | Р>0,05 |
Объем солевого раствора до определенного предела оказывал существенное влияние на выход сыворотки. Максимальный ее выход наблюдали при добавлении раствора натрия хлористого во флаконы из расчета 2 мл на 100 мл крови. Снижение концентрации общего белка и остаточного гемоглобина при увеличении объема солевого раствора статистически недостоверно.
Пример 4. Влияние очередности заполнения флаконов кровью плодов коров на выход сыворотки и содержание в ней общего белка и остаточного гемоглобина.
Опытным путем установлено достоверное снижение выхода сыворотки из крови плодов коров от первых флаконов к последним. Данный показатель от 1 до 6 флаконов уменьшался на 14,5%. Снижение концентрации общего белка в сыворотке крови недостоверно. Содержание остаточного гемоглобина в 6 флаконах по сравнению с 1 возрастал более чем в 2 раза. Кровь взята у 8 плодов, а результаты данного опыта приведены в табл.5.
| Таблица 5 | ||||
| Влияние очередности заполнения флаконов кровью плодов коров на выход сыворотки и содержание в ней общего белка и остаточного гемоглобина | ||||
| Номер флакона | Выход сыворотки крови | Концентрация общего белка в сыворотке крови, г/л | Концентрация остаточного гемоглобина в сыворотке крови, мг/100 мл | |
| мл | к объему крови, % | |||
| 1(контроль) | 160,0±2,5 | 64,0±1,0 | 38,3±0,7 | 21,5±1,1 |
| 2 | 158,3±1,8 | 63,3±0,7 | 37,6±0,8 | 24,7±0,9 |
| Р>0,05 | Р>0,05 | Р<0,01 | ||
| 3 | 148,9±1,9 | 59,6±0,8 | 37,1±0,9 | 29,0±1,1 |
| Р<0,01 | Р>0,05 | Р<0,001 | ||
| 4 | 148,3±1,8 | 59,3±0,7 | 36,4±0,9 | 33,5±1,4 |
| Р<0,01 | Р>0,05 | Р<0,001 | ||
| 5 | 141,1±1,9 | 56,4±0,8 | 35,8±1,0 | 40,1±1,7 |
| Р<0,001 | Р>0,05 | Р<0,001 | ||
| 6 | 135,0±2,5 | 54,0±1,0 | 35,5±1,7 | 44,9±3,2 |
| Р<0,001 | Р>0,05 | Р<0,001 |
Пример 5. Влияние времени взятия крови у плодов коров на содержание в сыворотке общего белка и остаточного гемоглобина.
При определении влияния сроков взятия крови у плодов коров на содержание в их сыворотке общего белка и остаточного гемоглобина учитывали то обстоятельство, что во время движения животных на конвейере от момента обескровливания до их нутровки проходит 30 минут. Поэтому отсчет времени начинали с момента обескровливания стельных коров. В зависимости от времени взятия крови достоверно увеличивалась концентрация остаточного гемоглобина, снижение же общего белка по мере обескровливания плодов коров не достоверно, что отражено в табл.6.
| Таблица 6 | ||
| Влияние времени взятия крови у плодов коров на содержание в сыворотке общего белка и остаточного гемоглобина | ||
| Время взятия крови у плодов от момента обескровливания коров, мин | Концентрация общего белка в сыворотке крови, г/л | Концентрация остаточного гемоглобина в сыворотке крови, мг/100 мл |
| 30 (контроль) | 34,9±1,5 | 20,3±1,5 |
| 40 | 34,2±1,4 | 27,2±1,5 |
| Р>0,05 | Р<0,01 | |
| 50 | 33,5±1,5 | 36,2±1,8 |
| Р>0,05 | Р<0,001 | |
| 60 | 32,9±1,5 | 49,6±2,6 |
| Р>0,05 | Р<0,001 | |
| 70 | 32,2±1,5 | 69,1±4,9 |
| Р>0,05 | Р<0,001 |
Сыворотка, полученная из крови плодов через 1 час после обескровливания коров, сильно гемолизирована и часто бывает непригодна для дальнейшей переработки. Если до нутровки животных долго держали на конвейере, то в 2-3 раза снижался и объем взятой крови у плодов.
Пример 6. Зависимость выхода сыворотки крови плодов коров от объема флаконов.
Для изучения влияния объема флаконов, заполняемых кровью, у 6 плодов коров массой тела 13,2-28,2 кг во флаконы емкостью 250 и 450 мл, которые предварительно заполняли 10%-ным раствором натрия хлористого из расчета 2 мл на 100 мл крови. Флаконы разного объема объединяли в общие системы. Выход сыворотки в процентах к объему крови составил во флаконах на 250 мл 65,0±1,2%, а на 450 мл - 60,1±0,7%. Следует отметить, что сыворотку, собранную из флаконов емкостью 450 мл, всегда дополнительно центрифугировали, так как она сильно опалесцировала. Меньший выход сыворотки, ее опалесценция во флаконах емкостью 450 мл, по-видимому, обусловлены их большим диаметром.
Пример 7. Изучение физико-биохимических показателей и биологической активности сыворотки крови плодов коров, получаемой по предлагаемой технологии.
Многократными опытами по получению фетальной сыворотки установлены определенные параметры ее качества, которые отражены в табл.7.
| Таблица 7 | ||
| Рекомендуемые параметры контроля качества жидкой сыворотки крови плодов коров для культивирования клеток | ||
| № п/п | Показатели | Параметры |
| 1 | Внешний вид | Прозрачная жидкость соломенно-желтого или красновато-желтого цвета |
| 2 | Прозрачность, ед. опт. плотности | 0,114±0,019 |
| 3 | рН | 7,26±0,13 |
| 4 | Остаточный гемоглобин, мг/100 мл | 30,0±5,2 |
| 5 | Общие липиды, мг/100 мл | 70,0±4,6 |
| 6 | Холестерин, мг/100 мл | 38,2±3,8 |
| 7 | Общий белок, г/100 мл | 3,16±0,20 |
| в том числе: | ||
| альбумины | 1,32±0,12 | |
| α-глобулины | 1,26±0,10 | |
| β-глобулины | 0,42±0,08 | |
| γ-глобулины | 0,17±0,02 | |
| 8 | Ростстимулирующая активность по индексу пролиферации перевиваемых | |
| клеток РК-15, Vero, NGUC-1, Hela и др. | 6,16-7,48 | |
| 9 | Возможные контаминанты: бактерии, | |
| грибы, микоплазмы, вирусы | отсутствуют |
Необходимо отметить, что по предлагаемой методике получения фетальной сыворотки удаление ингибиторов роста клеток (остаточный гемоглобин, общие липиды, холестерин и др.) проводят после размораживания сыворотки крови плодов коров только из флаконов, в которых у их дна содержатся сильногемолизированные слои сыворотки.
Преимущества предлагаемых методов взятия крови и отделения сыворотки у плодов коров дают в совокупности возможность для увеличения объема производства конечного продукта в сравнении с существующими технологиями более чем в 3 раза. Технологический цикл по получению фетальной сыворотки несколько удлиняется, но это приводит к позитивным изменениям как биохимического состава, так и биологических ее свойств. Улучшение качественных показателей фетальной сыворотки за счет снижения концентрации общего белка, в том числе γ-глобулинов, остаточного гемоглобина, общих липидов, в том числе общего холестерина, достигается методом замораживания - оттаивания ее и сбора лишь верхних светлых слоев сыворотки до границы с гемолизированными слоями в случае, если сыворотка сильно гемолизирована. Ни одна из серий сыворотки, получаемой предлагаемым методом, не оказывала токсического действия на разнообразные перевиваемые культуры клеток. Кроме того, мы культивировали на среде с этой сывороткой перевиваемую линию клеток Hela, Vero, а также данная сыворотка успешно прошла испытания в г. Казани в городском диагностическом центре и центре гигиены и эпидемиологии на перевиваемых линиях клеток человека.
Способ получения сыворотки крови плодов коров для культивирования клеток животных и человека, включающий взятие крови, отделение сыворотки, 2-кратную стерилизующую ее фильтрацию, отличающийся тем, что кровь у плодов берут унифицированной стерильной системой в стеклянные флаконы емкостью 250 мл с гипертоническим раствором NaCl, заполняя их на 80-100%, кардиопункцию проводят через углубление у краниальной части грудной кости, отделение сыворотки - центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30-40 мин, после сбора сыворотки ее замораживают при (-15)-(-20)°С не менее 7 суток, после разморозки при 4-20°С сыворотку собирают, удаляя сильно гемолизированные слои, предварительно фильтруют через глубинные фильтры EKS, а затем - через стерилизующие мембранные фильтры при 2-6°С.
