Рекомбинантная плазмидная днк pтв323, кодирующая гибридный полипептид gst-дельтамрт64 со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена мрт64 (мрв64), рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного полипептида gst-дельтамрт64 и рекомбинантный полипептид gst-дельтамрт64
Владельцы патента RU 2458130:
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)
Рекомбинантная плазмидная ДНК рТВ323 по изобретению, кодирующая гибридный полипептид глутатион-S-трансфераза (GST) и укороченный вариант белка МРТ64 (rΔМРТ64), имеет среднюю м.м. 3,6 МДа, размер 5574 п.н., состоит из: а) EcoRI-BamHI-фрагмента векторной плазмиды pGEX-2T размером 4938 п.н., содержащего ген β-лактамазы, индуцируемый tac-промотор, внутренний ген lacIq, кодирующий белок-репрессор лактозного оперона, фрагмент гена глутатион-S-трансферазы из S. japonicum с множественным сайтом для клонирования (МСК) генов в 3'-концевой части этого гена и нуклеотидной последовательностью, кодирующей сайт протеолиза тромбина и располагающейся перед МСК; б) EcoRI-BamHI-фрагмента размером 636 п.н., содержащего фланкированный сайтами для эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI укороченный ген МРТ64, полученный амплификацией соответствующего гену фрагмента с геномной ДНК М. tuberculosis; в) генетического маркера - ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой рТВ323 клеток Е. coli к антибиотику ампициллину; г) уникальные сайты рестрикции: BamHI - 930/934, EcoRI - 1566/1570. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli BL21/pTB323 - продуцент гибридного полипептида GST-ΔМРТ64 со свойствами микобактериального антигена ΔМРТ64 депонированв Коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" под №В-1028. Рекомбинантный полипептид GST-ΔMPT64, продуцируемый рекомбинантным штаммом по изобретению, содержит в качестве белка-носителя N-концевой полипептидный фрагмент глутатион-S-трансферазы S.j. (226 а.о., 26,31 кДа) и имеет полную аминокислотную последовательность (431 а.о., 48,76 кДа), приведенную в описании. Использование изобретения позволяет нарабатывать высокоочищенный полипептид в препаративных количествах при сохранении иммуногенных свойств и возможности отделения целевого белка от аминокислотной последовательности белка-носителя для исследования иммуногенных свойств целевого белка. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 6 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и позволяет получать микробиологическим синтезом по упрощенной технологии новый гибридный полипептид GST-ΔMPT64 со свойствами видоспецифичного белка-антигена Mycobacterium tuberculosis MPT64 (также cоответствующего гомологичному белку MPB64 Mycobacterium bovis), который может быть использован для ранней диагностики туберкулезной инфекции, вызванной одним из двух видов - Mycobacterium tuberculosis или Mycobacterium bovis.
Разнообразие форм туберкулеза, распространение стертой картины заболевания, а также индивидуальная реакция организма на инфекцию представляют собой серьезную проблему для диагностики туберкулезной инфекции вообще и для ранней диагностики в частности.
Классическая методология диагностики туберкулеза связана с применением кожных реакций на введение туберкулина (PPD) - очищенного деривата протеина [1]. Однако проблема специфичности и чувствительности кожных тестов в случае лиц, вакцинированных BCG, не позволяет отличить их от индивидуумов, инфицированных патогенными микобактериями, вызывающими развитие туберкулеза, в данном тесте [2]. Одна из причин получения ложноположительных результатов после проведения реакции Манту связана с проявлением кросс-реактивности к нетуберкулезным микобактериям. Известно, что около 10% лиц проявляют реактивность к нетуберкулезным микобактериям, из которых 30% оказываются позитивными в кожном тесте.
Среди классических методов диагностики туберкулеза наибольшей специфичностью обладает метод идентификации культуры возбудителя в посеве исследуемого образца. Широкое распространение получили также цитологические (микроскопические) методы определения микобактерий в мазках после окраски красителем. Однако оба этих метода оказываются малопригодными при небациллярных формах туберкулеза, когда микобактерии отсутствуют в биопробах. Кроме того, культивирование микобактерий ввиду их медленного роста является длительной процедурой, а цитологическая идентификация не обладает достаточной чувствительностью, чревата ошибками и в значительной степени зависит от квалификации персонала.
Методы серодиагностики, основанные на определении антител к антигенам микобактерий, в настоящее время нашли широкое применение для скрининговых исследований благодаря относительно невысокой стоимости, быстроте постановки используемых процедур, высокой чувствительности и специфичности среди инфицированных лиц [3]. Серологические методы отличаются большим разнообразием. Чувствительность и специфичность тестов, использующих технологию иммуноферментного анализа (ИФА), варьируется в довольно широком диапазоне и составляет 40-85% и 67-100% соответственно. С одной стороны, это связано с тем, что зачастую показатели гуморального иммунного ответа при туберкулезе снижены, и это в свою очередь приводит к тому, что антитела, полученные в организме человека к вирулентным микобактериям, вызывающими туберкулез у человека, перекрестно реагируют с набором антигенов непатогенных микобактерий и многих возбудителей других болезней. С другой стороны, антимикобактериальная и гормональная терапия оказывают супрессирующее влияние на продукцию антител при туберкулезе. Именно последний фактор является основным при выявлении маркеров гуморального иммунитета у больных туберкулезом, поскольку снижение уровня антител влечет за собой и снижение доли позитивных результатов в ИФА, которая оказывается сравнительно невысокой [4].
В литературе описано большое количество новых белков (полипептидов) микобактерий туберкулезного комплекса, которые могут быть использованы в диагностических тестах. Известны и нуклеотидные последовательности, кодирующие эти белки. Большая часть этой коллекции имеет сходства с белками других видов рода Mycobacterium и даже бактерий других родов. Некоторое количество белков культурального фильтрата, секретируемых микобактериями M. tuberculosis и обладающих иммуногенной и ферментативной активностью, ассоциированы с патогенезом. Однако полный анализ белковой композиции (состава) в этих фракциях остается до конца не изученным [5].
При развитии туберкулезной инфекции важная роль принадлежит Т-лимфоцитам и другим Т-клеткам, или Т-клеточным эффекторам (например, CD4, CD8) [6]. Так, например, CD4-Т-клетки продуцируют иммунный интерферон (гамма-интерферон, IFN-γ), который является стимулятором выработки в инфицированном организме антимикобактериальных макрофагов, как показано на мышиных моделях [7], а также активатором макрофагов человека при подавлении инфекции M. tuberculosis [8].
Сопоставление характера изменения Т-клеточного и В-клеточного звеньев иммунитета позволяет выявить уровень защитной реакции иммунной системы организма, направленной на синтез антител к бактериальным антигенам. Изучение состояния внутриклеточной функциональной активности иммунокомпетентных клеток позволяет получить сведения о патологическом процессе [9].
Высокий уровень продукции γ-IFN стимулирует Т-клеточную активацию, характеризуя клеточный иммунитет при туберкулезной инвазии. Выбор в качестве прогностического фактора в диагностике туберкулеза γ-интерферона является не случайным. Нарушение функционирования в цепи продукции IFN является отражением нарушения функции иммунной системы [10].
γ-IFN-анализ основывается на количественном определении уровня γ-IFN при стимуляции лимфоцитов цельной клеточной культуры крови, инкубированных в течение 16-20 ч с белковыми антигенами M. tuberculosis и контрольными антигенами. В результате стимуляции эффекторов T-клеток в крови происходит быстрая секреция цитокинов, ответственных за эффекторные функции клеточного иммунного ответа, при этом IFN-γ является одним из немногих цитокинов, который продуцируется в этом процессе и служит специфическим маркером для клеточных медиаторов иммунного ответа.
В качестве комплекса микобактериальных антигенов для такого рода диагностических исследований могут быть использованы туберкулин (PPD) или культуральные фильтраты (CF) M. tuberculosis H37Rv. В отличие от кожного теста γ-IFN-анализ позволяет проводить дифференцирование между BCG-вакцинированными и инфицированными пациентами. Как правило, результаты исследования клинических изолятов с использованием гамма-интерферонового анализа показывают более низкий процент вакцинированных, имеющих позитивный результат на наличие туберкулезной инфекции, определенный по данным кожного теста. Такое различие указывает на то, что результаты кожной пробы с использованием PPD имеют низкую специфичность в случае BCG-вакцинированных пациентов.
Наиболее подходящими полипептидами, играющими роль микобактериальных антигенов в гамма-интерфероновом анализе, являются белки, высокоспецифичные для вирулентных штаммов возбудителей туберкулеза и одновременно отсутствующие в вакцинных штаммах BCG.
Применение видоспецифичных белков позволяет дифференцировать различные фазы развития туберкулезной инфекции в сравнении с результатами, полученными при использовании других, неспецифичных белков, а также высокий уровень Т-клеточного ответа на видоспецифичные антигены, который коррелирует с протективным иммунитетом при туберкулезе и с риском развития активной формы туберкулеза.
В литературе известен иммуногенный белок MPB64, впервые идентифицированный Harboe M. и соавт. [11]. В виде нативного белка MPB64 был обнаружен в культуральной жидкости (фильтрате) Mycobacterium bovis BCG Tokyo. Позднее Andersen А.B. и соавт. [12], используя моноклональные антитела, полученные на белок MPB64, обнаружили аналогичный белок в культуральном фильтрате Mycobacterium tuberculosis H37Rv, который обозначили как MPT64. Также было показано, что нуклеотидная последовательность обоих генов, кодирующих эти белки, совпадает [13, 14]. Молекулярная масса очищенного нативного белка равна 24 кДа. Основное преимущество белка MPT64 в том, что он является высокоспецифичным именно для вирулентных видов возбудителей туберкулеза (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) [12] и в отличие от таких хорошо известных ранних белков, как ESAT-6 и CFP10, отсутствует, как было показано Li H. и соавт., к сожалению, лишь в некоторых геномах вакцинных штаммов BCG [15]. MPT64 наряду с основными секреторными белками, такими как ESAT-6 и CFP10, является одним из антигенов, вызывающих развитие Т-клеточного ответа. Этот процесс сопровождается повышенной продукцией γ-IFN. Ген белка MPT64 входит в состав геномного фрагмента RD2 размером 10,79 тыс. п.н., присутствующего в геномах штаммов M. tuberculosis и M. bovis, в том числе и в некоторых штаммах M. bovis BCG [16]. Несмотря на это он может быть использован в диагностических целях как в сочетании с другими ранними белками (ESAT-6, CFP10), так и самостоятельно в случае его использования применительно к лицам, ранее вакцинированными вакцинными штаммами, не содержащими в своем геноме гена mpt64. Также он может быть использован по отношению к лицам в тех странах, в которых отменена вакцинация против туберкулеза, или к вакцинированным и заболевшим (инфицированным), основываясь на различии полученного иммунного ответа между только вакцинированными и одновременно вакцинированными и заболевшими (инфицированными).
Выделение и очистку белка MPT64 из культурального фильтрата микобактерий можно проводить, используя безопасные вакцинные штаммы, содержащие ген белка MPB64, гомологичный на 100% MPT64. Однако эта процедура является дорогостоящей и сложной, и выход целевого продукта при этом оказывается чрезвычайно низким. Именно поэтому применение техники рекомбинантных ДНК для получения указанного белка для практических целей диагностики является экономически более целесообразным.
Известен генно-инженерный способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами микобактериального антигена MPT64, используемого для диагностических целей [17, прототип]. В этом случае целевой белок получают в составе рекомбинантного слитного белка, содержащего на С-конце в виде доменной структуры целевой белок (полный и укороченный - без лидерного пептида - варианты аминокислотной последовательности), тогда как N-концевая аминокислотная последовательность включает последовательность мальтозосвязывающего белка (ген malE) в качестве белка-носителя (экспрессирующий вектор pMAL-p).
Однако данная конструкция (прототип) не содержит сайта протеолиза, позволяющего отделить целевой белок от аминокислотной последовательности белка-носителя для проведения в последующем исследований, касающихся сравнения иммуногенных свойств, с белком, приближающимся к нативной структуре целевого или непосредственно на целевом.
Техническим результатом изобретения является создание такой генетической конструкции и рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli на ее основе - продуцента гибридного полипептида со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена ΔMPT64, имеющего такую конструкцию, которая бы позволяла нарабатывать целевой высокоочищенный полипептид в препаративных количествах при сохранении иммуногенных свойств последнего и возможности отделения целевого белка от аминокислотной последовательности белка-носителя для исследования иммуногенных свойств целевого белка.
Указанный результат достигается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pTB323, кодирующей химерный полипептид: глутатион-S-трансфераза (GST) + укороченный вариант, без лидерного пептида, белка MPT64 (далее rΔMPT64). При этом ген, кодирующий полипептид со свойствами микобактериального антигена ΔMPT64, находится в одной рамке считывания с геном глутатион-S-трансферазы из Schistosoma japonicum (GST S.j.) (Фиг. 1А и Б).
Рекомбинантная плазмидная ДНК pТB323 (Фиг. 1 А и Б) со средней молекулярной массой 3,6 МДа имеет размер 5574 п.н. (изображения конструкции плазмиды, рестриктной карты, расчет размера выполнены с помощью программы NEBcutter V2.0 (UK) в режиме on-line (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)) и состоит из следующих элементов:
- EcoRI-BamHI-фрагмента векторной плазмиды pGEX-2T (Pharmacia Biotech) размером 4938 п.н., содержащего ген β-лактамазы, индуцируемый tac-промотор, внутренний ген lacIq, кодирующий белок-репрессор лактозного оперона, фрагмент гена глутатион-S-трансферазы из S. japonicum с множественным сайтом для клонирования (МСК) генов в 3΄-концевой части этого гена и нуклеотидной последовательностью, кодирующей сайт протеолиза тромбина и располагающейся перед МСК;
- EcoRI-BamHI-фрагмента размером 636 п.н., содержащего фланкированный сайтами для эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI укороченный ген MPT64, полученный амплификацией соответствующего гену фрагмента c геномной ДНК M. tuberculosis;
а также содержит:
- в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pТB323 клеток E. coli к антибиотику ампициллину;
- уникальные сайты рестрикции: BamHI - 930/934, EcoRI - 1566/1570 (указаны позиции расщепления соответствующими эндонуклеазами рестрикции по обеим цепям, нумерация при этом проводится по одной цепи).
Наличие в составе рекомбинантного полипептида rΔMPT64 GST-фрагмента позволяет нарабатывать препаративные количества целевого белка с использованием аффинной хроматографии на глутатионсефарозе. Данные свойства конструкции важны для биотехнологического цикла, связанного с выделением рекомбинантного белка. Именно наличие GST-фрагмента позволяет облегчить процесс очистки рекомбинантного полипептида и получать высокоочищенный белок со свойствами микобактериального антигена MPT64. При накоплении в клетке rΔMPT64 практически (лишь в незначительной степени) не подвергается деградации. Он также устойчиво ведет себя и при стимуляции цельной клеточной культуры крови в процессе диагностического анализа. По-видимому, присутствие GST-фрагмента в составе химерного белка позволяет защитить его от воздействия ферментов крови при стимуляции цельной клеточной культуры крови в процессе диагностического анализа. Пролонгирование его действия при стимуляции цельной крови или мононуклеарных клеток цельной крови с использованием такого рода структур относится к важным факторам стабильности таких белков. При этом иммуногенные свойства предлагаемой химерной структуры полипептида не утрачиваются. Принципиальным отличием предлагаемого химерного полипептида rΔMPT64 от исходного в прототипе MAL-ΔMPT64 является то, что рекомбинантный белок, полученный в результате экспрессии, является единым образованием, включающим иммунодоминантные видоспецифические структурные эпитопы нативного белка ΔMPT64 и не обладающим функциональной активностью GST-фрагмента. Расположенный между полипептидными фрагментами GST и ΔMPT64 (Фиг. 2) сайт гидролиза тромбина позволяет при необходимости получать микобактериальный антиген ΔMPT64, свободный от N-концевого полипептидного фрагмента GST. Рекомбинантный антиген ΔMPT64 на N-конце после расщепления тромбином будет содержать только два дополнительных аминокислотных остатка: глицин является N-концевым, серин - вторым аминокислотным остатком, далее следует аминокислотная последовательность строго соответствующая целевому белку ΔMPT64 - без лидерного пептида, первых 23-х аминокислотных остатков полного MPT64.
Для получения бактериального штамма-продуцента химерного белка rΔMPT64 компетентные клетки E. coli BL21 трансформируют сконструированной целевой плазмидой pТB323. Полученный штамм бактерий E. coli BL21/pТB323 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. По морфологическим признакам штамм-продуцент рекомбинантного белка rΔMPT64 не отличается от исходного штамма E. coli BL21, не содержащего целевую плазмиду.
Культуральные признаки. По культуральным признакам штамм-продуцент рекомбинантного белка rΔMPT64 не отличается от исходного штамма E. coli BL21, не содержащего целевую плазмиду.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки штамма-продуцента рекомбинантного белка rΔMPT64 проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием целевой плазмиды.
Существенным отличием штамма E. coli BL21/pТB323 является то, что он обеспечивает синтез химерного полипептида rΔMPT64 (GST-ΔMPT64) со свойствами микобактериального антигена ΔMPT64 с уровнем экспрессии 1,8-12 мг/мл белка.
Полученный штамм депонирован в Коллекции культур микроорганизмов (ККМ) ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора под номером В-1028.
Химерный полипептид rΔMPT64 (GST-ΔMPT64) (Фиг. 2), продуцируемый рекомбинантным штаммом BL21/pТB323 Е. со1i, содержит в качестве белка-носителя N-концевой полипептидный фрагмент глутатион-S-трансферазы S.j. (226 а.о. с молекулярной массой 26,31 кДа; расчет проведен с использованием программы Compute pI/Mw tool (Switzerland) в режиме on-line (http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.htmlhttp://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html)), соединенный через свой концевой сайт гидролиза тромбина (LVPR^GS) с C-концевым полипептидным фрагментом видоспецифичного микобактериального антигена ΔMPT64 (205 а.о. с молекулярной массой 22,46 кДа; расчет проведен с использованием программы Compute pI/Mw tool), и имеет полную аминокислотную последовательность (431 а.о., 48,76 кДа; расчет проведен с использованием программы Compute pI/Mw tool), приведенную на Фиг. 3.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
Фиг. 1 А. Схема организации рекомбинантной плазмиды pТB323, где GST - ген белка глутатион-S-трансферазы; ΔMPT64 - клонированный фрагмент, полученный амплификацией с помощью ПЦР и включающий укороченный ген белка MPT64; уникальные BamHI- и EcoRI-сайты эндонуклеаз рестрикции, использованные при создании данной конструкции; ptac - синтетический промотор, присутствующий в векторной (pGEX-2T) и рекомбинантной плазмидах; ApR - ген β-лактамазы (bla-ген), обеспечивающий трансформированным бактериальным клеткам устойчивость к ампициллину.
Фиг. 1 Б. Рестрикционная карта целевой плазмиды pТB323. Изображение конструкции плазмиды pTB323 (5574 п.н.). a - слитный рекомбинантный белок GST-ΔMPT64 размером 431 а.о. Изображения построены с помощью программы NEBcutter V2.0 (UK) (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)
Фиг. 2. Участки стыковки при внедрении гена Δmpt64 плазмиды pTB323 в ген глутатион-S-трансферазы (gst) в сравнении с аналогичным участком в исходной (векторной) плазмиде pGEX-2T. НП - нуклеотидная последовательность, АП - аминокислотная последовательность. Первый кодон белка-встройки показан после нуклеотидной последовательности сайта протеолиза тромбина, стоп-кодон - в конце гена-встройки подчеркнут.
Фиг. 3. Полная нуклеотидная и аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида GST-ΔMPT64, где LVPR^GS - аминокислотная последовательность сайта узнавания и гидролиза протеазы тромбин (выделен цветом).
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pТB323.
В работе использовали в качестве вектора плазмиду pGEX-2T (Pharmacia) и штаммы: JM103 E. coli {Δ(lac-proAB), thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR-, [F' traD36, proAB, lacIq, ZΔM15]}; BL21 E. coli B {F-, dcm, ompT, hsdS (rB- mB-), gal}.
В качестве источника нуклеотидного материала (матрицы) для получения с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) клонируемого амплифицируемого фрагмента используют геномную ДНК M. tuberculosis H37Rv, выделенную из инактивированных клеток микобактерий. Ген, кодирующий белок ΔMPT64, амплифицируют с помощью праймеров:
5'-CGGGATCCGCGCCCAAGACCTACTG-3' (прямой праймер для гена mpt64);
5'-CGGAATTCGTCCTCGCGAGTCTAGG-3' (обратный праймер для гена mpt64). ПЦР проводят в объеме 50 мкл на амплификаторе «Терцик» (“ДНК-технология”, Москва) с температурно-временным профилем: 94°C - 3 мин; 10 циклов [94°C - 30 с, 45°C - 30 с, 72°C - 50 с], 35 циклов [94°C - 30 с, 60°C - 30 с, 72°C - 50 с], 72°C - 3 мин. Полную нуклеотидную последовательность клонируемого гена (mpt64) для подбора нуклеотидной последовательности праймеров извлекали из базы данных (БД) Института Пастера (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/) (Франция). Температуры плавления праймеров выбирают на основе полученной из БД расширенной нуклеотидной последовательности, включающей укороченный ген Δmpt64, с помощью программы NTI Suite 8. Отжиг праймеров в первых 10 циклах ведут при пониженной температуре отжига (45°C), поскольку 5'-концевая нуклеотидная последовательность из 8 н.о., в структуре которой заложен сайт рестрикции (в данном случае BamHI или EcoRI), не может образовать с ДНК-матрицей (M. tuberculosis) совершенный гибридный дуплекс в начальный момент протекания ПЦР после того, как более протяженная 3'-концевая часть праймера образовала его). В этом случае расчет температур плавления каждого праймера ведут только с полностью гибридизующейся последовательностью, отбросив первые 8 н.о. из структуры праймера. Расчеты температур плавления для праймеров проводили с помощью программы NTI Suite 8 или Oligonucleotide Properties Calculator (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) (USA) 5'-концевая последовательность из 8 н.о. является дополнительной к основной нуклеотидной последовательности каждого праймера и предназначена для создания сайта узнавания для эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI соответственно с целью облегчения последующей стадии клонирования.
Реакционная смесь включает полимеразный буфер, содержащий 60 мМ трис-HCl, pH 8,5; 25 мМ KCl; 1,5 мМ MgCl2; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1% тритон X-100; 4 дезоксинуклеозидтрифосфата - дАТФ, дГТФ, дЦТФ и ТТФ - с конечной концентрацией каждого 0,2 мМ; праймеры с концентрацией каждого 0,15-0,25 мкМ и 5 ед. Taq-ДНК-полимеразы («Сибэнзим», г. Новосибирск, Россия). Полученный ПЦР-фрагмент (ампликон) длиной 646 п.н. очищают переосаждением этанолом в присутствии ацетата натрия, pH 4,8, и тРНК в качестве носителя [18]. Очищенный препарат ампликона растворяют в 80 мкл TE-буфера и затем проводят совместный гидролиз в EcoRI-буфере («Сибэнзим») эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI при 37°C в течение 3-5 ч. Полученный из ампликона целевой рестриктный фрагмент с двумя липкими концами переосаждают, как описано выше, растворяют в 40 мкл TE-буфера или бидистиллированной воды и без дополнительной очистки используют в реакции лигирования с расщепленной векторной молекулой (pGEX-2T) с помощью эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI, также содержащей два липких конца - BamHI и EcoRI. Смешивают 2-5 мкл рестрикта-ампликона (0,5 пмоль) с 500 нг (0,15 пмоль) векторной ДНК pGEX-2T/BamHI/EcoRI в 20 мкл лигазного буфера («Сибэнзим»), прогревают при 65°C в течение 3-5 мин, резко охлаждают во льду, добавляют 20 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и реакционную смесь переносят в термостат, где выдерживают в течение ночи при 16°C. Аликвоту лигазной смеси (1-2 мкл) используют для трансформации компетентных клеток E. coli штамма JM103, приготовленных по методике с использованием раствора хлористого кальция [18], которые высевают на чашки с агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Чашки инкубируют при 37°C в течение ночи. Поиск клонов, содержащих искомую встройку, проводят непосредственно из колоний с помощью ПЦР-анализа, использующего в качестве амплимеров олигонуклеотиды, комплементарные разным цепям векторной молекулы и располагающиеся по обе стороны от места клонирования фрагмента. При этом клоны, содержащие встройку укороченного гена Δmpt64, после разделения амплификата электрофорезом в геле агарозы (1,2%) в присутствии бромистого этидия показывают окрашенную под ультрафиолетовым светом полосу, соответствующую длине 806 п.н., что превышает длину клонируемого фрагмента, так как этот фрагмент содержит часть нуклеотидной последовательности исходной векторной молекулы. После отбора целевые плазмиды нарабатывают в аналитических количествах и проводят необходимый рестрикционный анализ (выявление наличия сайтов рестрикции BamHI и EcoRI). Полученную целевую плазмиду обозначили как pTB323. Схема плазмидной ДНК представлена на фиг. 1 А и 1 Б.
Пример 2. Получение штамма-продуцента, при культивировании клеток которого осуществляется продукция химерного белка GST-ΔMPT64.
Трансформацию клеток штамма E. coli BL21 проводят введением ДНК целевой плазмиды pTB323 в компетентные клетки, приготовленные по методике с использованием раствора хлористого кальция [18], после чего высевают на чашки с агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Чашки инкубируют при 37°C в течение ночи. Появившиеся колонии представляют собой клоны штамма-продуцента.
Клетки из каждого отобранного клона (обычно не более 10) высевают в 1 мл жидкой среды YT с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл для получения ночных культур клеток и инкубируют при 37°C без качания. На следующий день засевают ночной культурой каждого клона в отношении 1:100 2 мл свежей среды YT с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют при 37°C со скоростью качания 160 об/мин до плотности D550 = 0,5-0,8. Экспрессию гена Δmpt64 индуцируют добавлением изопропил-β-D-галактопиранозида (ИПТГ) до конечной концентрации 0,5-1,0 мМ, инкубируют при 37°C при интенсивной аэрации (160-170 об/мин) в течение 3-5 ч, после чего отбирают аликвоты суспензии клеток каждого клона и полученные из культур клеток лизаты анализируют электрофорезом в 10%-ном ПААГ в денатурирующих условиях по Лэммли. Окончательный отбор клонов проводят по способности культуры клеток каждого отдельного клона продуцировать в максимально возможных количествах (после проведения индукции) рекомбинантный белок rΔMPT64, количество и концентрацию которого оценивают по электрофоретической картине (в нашем случае параметры культивирования - 37°C и 1,0 мМ ИПТГ).
Пример 3. Выделение рекомбинантного белка GST-ΔMPT64.
Клетки штамма BL21 E. coli, трансформированные плазмидой pTB323, выращивают в среде LB с ампициллином (50 мкг/мл) течение ночи при 37°C. Ночную культуру (1:100) засевают в 150 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и подращивают до плотности D550 = 0,8 в течение 3 ч. Далее индуцируют экспрессию целевого белка GST-ΔMPT64 добавлением ИПТГ до концентрации 1,0 мМ. Индуцированные клетки растят при 37°C в течение 5 ч, после чего культуру клеток охлаждают до 0°C и клетки собирают центрифугированием при 5000g в течение 15 мин при 4°C. Экспрессию целевого белка GST-ΔMPT64 анализируют электрофорезом по Лэммли в 12%-ном полиакриламидном геле и иммуноблотингом с моноклональными антителами к белку-носителю GST. Результаты этого анализа показывают наличие в индуцированной культуре клеток E. coli штамма BL21/pTB323 при обработке клеточных осадков лизирующим буфером GST-ΔMPT64 белка с молекулярной массой около 48-50 кДа, что соответствует расчетной молекулярной массе. В контрольных лизатах клеток E. coli BL21 и E. coli BL21/pGEX-2T белок с этой молекулярной массой отсутствует (по данным электрофореза). Данный белок окрашивается в иммуноблотинге с моноклональными антителами к белку-носителю GST.
Для дальнейших анализов клетки ресуспендируют в 8 мл холодного (0°C) PBS-буфера, содержащего 140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ KH2PO4, pH 7,3, 1 мМ PMSF (ингибитор протеаз), и разрушают ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе (Ultrasonic processor Cole Parmer) 3×30 с с интервалом 1 мин между обработками при амплитуде 50 А. К ультразвуковому дезинтеграту добавляют тритон X-100 до 1%, инкубируют 30 мин при 0°C и отделяют фракцию растворимых белков от дебриса центрифугированием при 12000g в течение 40 мин. Далее смешивают супернатант с 200 мкл глутатионсефарозы (Glutathione Sepharose 4B Amersham, Biosciences AB) и инкубируют 30 мин с низкой скоростью перемешивания при комнатной температуре для аффинного связывания белка GST-ΔMPT64. Затем смесь переносят в микроколонку путем многократного центрифугирования при 600g, несколько раз промывают колонку ФСБ-буфером и проводят элюцию рекомбинантного белка буфером для элюции, содержащим 10 мМ восстановленный глутатион в 50 мМ трис-НСl, pH 8,0. В результате получают препарат очищенного рекомбинантного белка с концентрацией 1,5 мг/мл.
Пример 4. Проведение IFN-γ-анализа.
1-я стадия (стимуляция цельной клеточной культуры крови целевым антигеном). Образцы гепаринизированной венозной крови пациентов перемешивают осторожно круговыми движениями в течение 20 мин. Распределяют по 100 мкл в 96-луночные планшеты (Nunc, USA), содержащие по 150 мкл/лунке полной среды RPMI 1640 с L-глутамином. Тщательно перемешивают и вносят антиген GST-ΔMPT64 в концентрации 10 мкг/мл на лунку. Отдельно вносят по 100 мкл буферного раствора в лунки с нулевым контролем (без добавления антигена) и митоген РНА в концентрации 5 мкг/мл на лунку. Осторожно перемешивают. Инкубируют планшеты 24-48 ч при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.
2-я стадия. Для проведения IFN-γ-анализа в контрольные лунки планшет с сорбированными моноклональными антителами к гамма-интерферону производства BD Biosciences вносят по 100 мкл стандартных образцов гамма-интерферона производства BD Biosciences в разных концентрациях (от 300-150-75-37,5-18,8-9,4-4,7 пг/мл). В остальные лунки планшетов вносят по 100 мкл исследуемых образцов цельной крови после стимуляции, помещают в шейкер и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После окончания инкубации лунки планшетов промывают 3 раза промывочным буферным раствором (ФСБ-Т). После промывки в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл конъюгата биотинилированных антител к IFN-γ производства BD Biosciences и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации промывают планшеты 3 раза буферным раствором ФСБ-Т, после чего в каждую лунку планшета добавляют по 100 мкл конъюгата авидин-пероксидазы хрена производства BD Biosciences в рабочем разведении. Инкубируют 60 мин при комнатной температуре. После окончания инкубации планшеты промывают 5 раз промывочным буферным раствором (ФСБ-Т) и 3 раза дистиллированной водой. Затем вносят в каждую лунку планшета по 100 мкл раствора ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина), помещают планшеты в защищенное от света место и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента (0,9 N раствор Н2SO4). Измеряют оптическую плотность на автоматическом спектрофотометре типа «Мультискан» при длине волны 450 нм.
Для оценки концентрации IFN-γ в исследуемых образцах строят калибровочную кривую в логарифмических координатах: ось абсцисс - концентрация IFN-γ (пг/мл), ось ординат - значение оптической плотности образца. По полученным значениям проводят калибровочную кривую и рассчитывают количественное содержание IFN-γ в пг/мл или МЕ/мл в исследуемых и контрольных образцах. Результаты подсчитывают из среднего значения ОП в трех лунках (ρ < 0,05). Значения Cutoff для IFN-γ > 300 пг считают позитивными.
Пример 5. Мононуклеары цельной клеточной культуры крови (2×105 кл./лунка), выделенные по стандартной процедуре с использованием градиентного центрифугирования в присутствии реагентов Фиколл-Гипак, суспендируют в 50 мкл полной клеточной культуральной среды RPMI 1640 и распределяют в 96-луночные планшеты (Nunc, MaxiSorb, USA), содержащие по 150 мкл/лунку полной среды RPMI 1640 производства ГНЦ ВБ "Вектор". Затем в каждую лунку планшета вносят химерный антиген GST-ΔMPT64 в концентрации 5-10 мкг/мл; в контрольные лунки планшета вносят митоген (Con A или РHA) в концентрации 4 мкг/мл в трипликатах. Конечный объем реакционной среды в лунке планшета составляет 250 мкл. Инкубируют планшеты 16-24 ч при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.
Для проведения IFN-γ-анализа в контрольные лунки планшетов с сорбированными моноклональными антителами к гамма-интерферону вносят по 100 мкл стандартных и контрольных образцов. В остальные лунки планшетов вносят по 100 мкл исследуемых образцов плазмы крови после стимуляции. Помещают в шейкер и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После окончания инкубации лунки планшета промывают 3 раза промывочным буферным раствором (ФСБ-Т). После промывки в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл конъюгата биотинилированных антител к IFN-γ и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации промывают планшеты 3 раза буферным раствором ФСБ-Т, после чего в каждую лунку планшета добавляют по 100 мкл конъюгата авидин-пероксидазы хрена в рабочем разведении и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. После окончания инкубации планшеты промывают 5 раз промывочным буферным раствором (ФСБ-Т) и 3 раза дистиллированной водой. Затем в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина), помещают планшеты в защищенное от света место и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента (0,9 N раствор Н2SO4). Оптическую плотность образцов измеряют на автоматическом спектрофотометре типа «Мультискан» при длине волны 450 нм.
Для оценки концентрации IFN-γ в исследуемых образцах строят калибровочную кривую в логарифмических координатах: ось абсцисс - концентрация IFN-γ (пг/мл), ось ординат - значение оптической плотности образца. По полученным значениям проводят калибровочную кривую и рассчитывают количественное содержание IFN-γ в пг/мл или МЕ/мл в исследуемых и контрольных образцах. Результаты подсчитывают из среднего значения ОП в трех лунках (ρ < 0,05). Значения Cutoff для IFN-γ > 300 пг/мл считают позитивными.
Пример 6. Сорбцию МКА к IFN-γ производства BD OptEIA Reagent проводят с использованием 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,6 в течение 16 ч при 4оС на планшетах (Nunc, MaxiSorb, USA). После отмывки планшетов промывочным буферным раствором (ФСБ, рН 7,0) 3 раза по 300 мкл/лунку проводят блокировку поверхности лунок блокировочным буферным раствором ФСБ, рН 7,0, содержащим 10% фетальной сыворотки, в течение 60 мин при комнатной температуре, после чего проводят отмывку планшетов, как указано выше.
Подготовленный планшет с сорбированными МКА к IFN-γ используют при проведении IFN-γ-анализа. Для этого в каждую лунку планшета вносят по 150 мкл полной среды RPMI 1640. Образцы гепаринизированной венозной крови пациентов осторожно перемешивают и затем распределяют по 100 мкл в 96-луночные планшеты (Nunc, USA). Тщательно перемешивают и вносят раствор антигена GST-ΔMPT64 в RPMI 1640 с 0,2 мМ глутамина в концентрации 10 мкг/мл на лунку. В лунки А-1, В-1 и С-1 вносят митоген РНА, в лунки D-1, E-1 добавляют по 100 мкл разводящего буферного раствора (нулевой контроль). Осторожно перемешивают, инкубируют планшеты 24-48 ч при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, при перемешивании. После окончания инкубации планшеты промывают 5×300 мкл/лунку буферным раствором ФСБ-Т и 5×300 мкл дистиллированной водой. Для построения калибровочного графика при проведении IFN-γ-анализа предварительно проводят инкубацию со стандартными калибровочными образцами IFN-γ. Для этого в контрольные лунки планшетов с сорбированными моноклональными антителами к гамма-интерферону производства BD Biosciences вносят по 100 мкл стандартных образцов гамма-интерферона производства BD Biosciences в разных концентрациях (от 300-150-75-37,5-18,8-9,4-4,7 пг/мл) или по 100 мкл стандартных калибровочных образцов, содержащих IFN-γ (2000-1000-500-300-100-50-0 пг/мл) и контрольный образец (330 пк/мл IFN-γ) производства «Вектор-Бест». Инкубируют согласно инструкции по применению наборов. После окончания инкубации стрипы планшетов промывают 3 раза промывочным буферным раствором (ФСБ-Т). После промывки в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл конъюгата биотинилированных антител к IFN-γ и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации планшеты промывают 3 раза буферным раствором ФСБ-Т, в каждую лунку планшета добавляют по 100 мкл конъюгата авидин-пероксидазы или стрептавидин-пероксидазы хрена в рабочем разведении и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. После окончания инкубации планшеты промывают 5 раз промывочным буферным раствором (ФСБ-Т), 3 раза дистиллированной водой, после чего вносят в каждую лунку планшета по 100 мкл раствора ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина). Планшеты помещают в защищенное от света место и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента (0,9 N раствор Н2SO4) и измеряют оптическую плотность на автоматическом спектрофотометре типа «Мультискан» при длине волны 450 нм. Результаты анализа представляют в значениях Cutoff, которые получают по построенным калибровочным кривым, как описано выше.
Туберкулезный контроль проводится для выявления активного туберкулеза и скрининга лиц, имеющих контакт с использованием туберкулиновой пробы. Быстрый путь раннего выявления инфекции в крови с использованием рекомбинантных белков является альтернативным кожному тесту. Выявление уровня IFN-γ коррелирует со стадией и степенью туберкулезной инфекции, уровнем иммунного ответа и вероятностью прогрессирования активной формы туберкулеза. В таблице 1 представлены результаты выявления активного туберкулеза легких с использованием IFN-γ-анализа, а также среди здорового контингента. Как показывают проведенные исследования, полученный рекомбинантный белок позволяет выявлять активный туберкулезный процесс среди больных туберкулезом легких. Уровень IFN-γ среди здорового контингента не превышает предельные значения - >300 пг/мл IFN-γ, соответствующие группе риска или группе больных туберкулезом. Эти данные свидетельствуют о специфичности метода.
Таблица 1
IFN-γ-анализ туберкулеза при стимуляции гибридным белком rMPT-64 у пациентов с активной формой туберкулеза легких
| Пациенты | IFN-γ (пг/мл) | |||
| PPD | rΔMPT-64 | Митоген | ||
| ConA | PHA | |||
| 21 | 4100 | 845 | 6700 | 4782 |
| 22 | 3650 | 1985 | 7324 | 5421 |
| 23 | 2850 | 55 | 4530 | 3218 |
| 24 | 4870 | 3200 | 7300 | 6710 |
| 25 | 5110 | 2755 | 9650 | 8971 |
| 26 | 6200 | 2849 | 7861 | 8764 |
| 27 | 17320 | 5780 | 12344 | 14230 |
| 28 | 3980 | 67 | 4851 | 4352 |
| 29 | 5830 | 4210 | 19870 | 21340 |
| 30 | 10350 | 7400 | 18300 | 17235 |
| 31 | 21200 | 415 | 16540 | 14530 |
| 32 | 5730 | 2065 | 12347 | 13247 |
| 33 | 670 | 57 | 23450 | 32410 |
| 34 | 15340 | 3875 | 17650 | 18930 |
| 35 | 23 | 19 | 640 | 985 |
| 36 | 7458 | 2190 | 23410 | 28750 |
| 37 | 10480 | 6240 | 19340 | 18745 |
| 38 | 6130 | 1745 | 34500 | 29560 |
Значения Cutoff для IFN-γ > 300 пг/мл считали положительными, результаты подсчитывали из среднего значения трех лунок (ρ < 0, 01) и выражали в пг/мл, используя калибровочный график.
Аналитическая чувствительность теста составила 1,2-1,7 МЕ/мл IFN-γ для отрицательного (нулевого) контрольного образца из плазмы крови исследуемых (результаты представлены в табл. 2).
Таблица 2.
IFN-γ-анализ легочного туберкулеза при стимуляции гибридным белком rΔMPT64 и митогенами
| Пациенты | IFN-γ (МЕ/мл) | |||
| PPD | rΔMPT-64 | Митоген | ||
| ConA | PHA | |||
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 |
54,3 27,0 59,2 73,0 24,8 11,7 4,7 2,9 5,3 27,6 57,2 10,9 62,3 1,7 33,4 7,2 98,7 74,6 43,1 67,3 |
4,23 4,1 3,1 1,3 1,9 0,98 1,12 1,2 0,57 0,23 0,12 3,7 6,1 0,3 0,78 9,75 8,9 11,7 111,2 103,4 |
56,7 32,1 148,4 129,2 49,7 19,7 139,7 24,6 44,7 163,1 68,7 56,9 67,2 23,8 36,0 77,8 72,2 23,5 184,2 154,7 |
63,5 47,6 123,0 117,0 43,2 23,1 126,8 21,3 53,1 143,9 65,3 72,1 57,4 19,7 34,5 67,3 78,1 32,3 179,3 165,7 |
Для другой группы пациентов с туберкулезной инфекцией результаты продукции IFN-γ выражали в МЕ/мл с применением калибровочного графика. Аналитическая чувствительность теста составила 1,2-1,7 МЕ/мл IFN-γ для отрицательного (нулевого) контрольного образца из плазмы крови исследуемых.
Клинический статус больных с разной формой туберкулезной инфекции, выявленных с использованием гибридного белка rΔMPT64, представлен в таблице 3. Для другой группы пациентов с туберкулезной инфекцией результаты продукции IFN-γ выражали в МЕ/мл с применением калибровочного графика.
Таблица 3.
Клинический статус больных туберкулезом, выявленных с использованием рекомбинантного белка rMPT-64 с помощью IFN-γ-анализа
| № пп |
Туберкулезная инфекция | Чувствительность (%) | Специфичность (%) |
| 1 | Инфильтративный туберкулез легких | 73-84 | 74-97 |
| 2 | Очаговый туберкулез легких | 72-83 | 80-94 |
| 3 | Диссеминированный туберкулез легких | 70-82 | 82-94 |
| 4 | Фиброзно-кавернозный туберкулез легких | 77-85 | 83-100 |
В таблице 4 представлены результаты сравнительного изучения специфичности и чувствительности рекомбинантного белка rΔMPT64 в сравнении с PPD-туберкулином при стимуляции цельной клеточной культуры крови. Специфичность рекомбинантного белка в IFN-γ-анализе при выявлении туберкулеза оказывается выше, чем PPD-туберкулина.
Некоторые формы туберкулеза (остро прогрессирующие) не могут быть выявлены при проведении профилактических обследований. Больные с такими процессами попадают в основном в больницы общего профиля, где диагностика их часто затруднена из-за схожести рентгенологической картины с неспецифическими заболеваниями легких. Единственным методом достоверной диагностики в таких случаях является прямая бактериоскопия мокроты или применение IFN-γ-анализа. Все исследованные группы больных туберкулезом легких имели положительную реакцию с использованием микроскопических методов, культуральных, рентгеноскопии и молекулярно-биологических (ПЦР-анализ).
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рТВ323, кодирующая гибридный полипептид: глутатион-S-трансфераза (GST) и укороченный вариант белка МРТ64 (rΔМРТ64), имеет среднюю молекулярную массу 3,6 МДа, размер 5574 п.н. и состоит из следующих элементов:
- EcoRI-BamHI - фрагмента векторной плазмиды pGEX-2T размером 4938 п.н., содержащего ген β-лактамазы, индуцируемый tac-промотор, внутренний ген lacIq, кодирующий белок-репрессор лактозного оперона, фрагмент гена глутатион-S-трансферазы из S. japonicum с множественным сайтом для клонирования (МСК) генов в 3'-концевой части этого гена и нуклеотидной последовательностью, кодирующей сайт протеолиза тромбина и располагающейся перед МСК;
- EcoRI-BamHI - фрагмента размером 636 п.н., содержащего фланкированный сайтами для эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI укороченный ген МРТ64, полученный амплификацией соответствующего гену фрагмента с геномной ДНК М. tuberculosis;
и содержит:
в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой рТВ323 клеток Е. coli к антибиотику ампициллину;
- уникальные сайты рестрикции: BamHI - 930/934, EcoRI - 1566/1570.
2. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli BL21/pTB323-продуцент гибридного полипептида GST-ΔMPT64 со свойствами микобактериального антигена ΔМРТ64, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рТВ323 по п.1 и депонированный в Коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора под номером В-1028.
3. Рекомбинантный полипептид GST-ΔMPT64, продуцируемый рекомбинантным штаммом BL21/pTB323 E.coli по п.2, содержит в качестве белка-носителя N-концевой полипептидный фрагмент глутатион-S-трансферазы S.j. (226 а.о. с молекулярной массой 26,31 кДа), соединенный через свой концевой сайт гидролиза тромбина (LVPR^GS) с С-концевым полипептидным фрагментом видоспецифичного микобактериального антигена ΔМРТ64 (205 а.о. с молекулярной массой 22,46 кДа) и имеет полную аминокислотную последовательность (431 а.о. с молекулярной массой 48,76 кДа), приведенную на фиг.3.
