Способ дифференциальной диагностики бронхиальной астмы

Авторы патента:

Кашинцева Татьяна Валерьевна (RU)

Нестерович Ирина Ивановна (RU)

Трофимов Василий Иванович (RU)

Минеев Валерий Николаевич (RU)

G01N33/573 - ферментов или изоферментов

Владельцы патента RU 2469332:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, аллергологии, внутренним болезням, и может быть использовано для дифференциальной диагностики бронхиальной астмы (БА). Сущность способа: определяют уровень активности эффекторной каспазы-3 лимфоцитов периферической венозной крови. При уровне активности эффекторной каспазы-3 не более 0,98% диагностируют аллергическую БА, а при уровне активности эффекторной каспазы-3 не менее 1,00% диагностируют неаллергическую БА. Способ обладает простотой, безопасностью и достаточной информативностью. 4 пр.

Согласно современным представлениям эпителий бронхов является одним из ключевых регуляторов воспаления при БА.

Известен способ дифференциальной диагностики БА, заключающийся в проведении иммуногистохимического исследования для определения уровня экспрессии гена-регулятора апоптоза (Вах) в бронхиальных эпителиальных клетках, полученных путем биопсии в ходе фибробронхоскопии у больных аллергической бронхиальной астмой (АБА) и неаллергической бронхиальной астмой (НАБА) [Минеев В.Н., Нестерович И.И., Трофимов В.И., Кашинцева Т.В., Рыбакова М.Г., Грозов Р.В. Оценка активности генов - регуляторов апоптоза по экспрессии Bcl-2, Вах, активности каспазы-3 в бронхиальных эпителиальных клетках у больных бронхиальной астмой // Архив патологии. - 2011. - Том 73, №1. - С.11-14.]. Способ основан на статистически значимом повышении уровня экспрессии индуктора апоптоза - Вах в эпителиальных клетках бронхов у больных НАБА по сравнению с больными АБА. Этот способ принят авторами за прототип.

Высокая инвазивность и травматичность способа, включая возможные смертельные исходы, связанные с проведением фибробронхоскопии и биопсии, резко ограничивают его использование даже в специализированных пульмонологических стационарах и пульмонологических отделениях, а в целом ряде случаев даже исключают применение способа для указанной цели. Следует также учитывать, что в ряде случаев БА является относительным противопоказанием к проведению фибробронхоскопии. Трудоемкость, неэкономичность, необходимость специального оборудования - также ограничивают возможное использование данного способа для дифференциальной диагностики БА.

Техническим результатом изобретения является разработка менее опасного, более простого и достаточно информативного способа дифференциальной диагностики БА.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики БА, включающем определение уровня активности индуктора апоптоза биологических клеток, согласно изобретению определяют уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови и при уровне активности эффекторной каспазы-3 не более 0,98% диагностируют АБА, а при уровне активности эффекторной каспазы-3 не менее 1,00% диагностируют НАБА.

В настоящее время не вызывает сомнений ведущая роль протеаз в запуске и развитии процесса апоптоза. После активации эффекторной каспазы-3 процесс апоптоза становится необратимым. В проведенных исследованиях в качестве маркера клетки, подвергшейся апоптозу, использовали эффекторную каспазу-3.

В табл. представлены результаты исследования уровня активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови.

Таблица
Уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах венозной крови у больных БА, процент клеток (М±0) по изобретению
Индуктор апоптоза	Диагноз	Достоверность различий
АБА n=23	НАБА n=23
Каспаза-3	0,68±0,30	1,91±0,91	p=0,0001

Из табл. следует, что у больных НАБА выявлено статистически значимое повышение уровня активности индуктора апоптоза - эффекторной каспазы-3 по сравнению с больными АБА, что позволяет проводить дифференциальную диагностику между вариантами БА.

Было обследовано две группы больных, страдающих БА, общим количеством 46 человек. В первую группу из 23 человек вошли больные с клинически подтвержденным диагнозом НАБА, во вторую группу - больные с клинически подтвержденным диагнозом - АБА. Распределение больных по группам осуществлялось на основании алергологического обследования, клинического анализа крови, анамнестических данных.

Полученные результаты сравнивались с результатами по исследованию уровня экспрессии Вах в эпителии бронхов при БА, используемых для дифференциальной диагностике по способу-прототипу.

При проведении корреляционного анализа были выявлены достоверные положительные корреляционные связи (p<0,05) между уровнем экспрессии Вах в бронхиальных эпителиальных клетках органа - мишени и уровнем активности эффекторной каспазы-3 (r=0,343) в лимфоцитах периферической венозной крови больных БА, что свидетельствует о достаточной информативности заявляемого способа.

Статистическая обработка материала выполнялась на ПЭВМ с использованием стандартного пакета прикладного статистического анализа SPSS для Windows (от англ.: Statistical Package for the Social Science) (версия 16.0).

Таким образом, технический результат (безопасность, простота, информативность) достигнут за счет определения уровня эффекторной каспазы-3 при исследовании лимфоцитов периферической венозной крови больных БА.

Способ выполняют следующим образом.

Для исследования используют лимфоциты периферической венозной крови больных БА. Выделение мононуклеаров проводят не позднее чем через 2 часа после получения крови методом центрифугирования в градиенте плотности "Limpholite" (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция), плотность 1,077 г/см³. Гепаринизированную кровь разводят в два раза раствором хлорида натрия (9 г/л, pH=7,2), наслаивают на 3 мл градиента плотности и центрифугируют 30 минут при 400 g. Образовавшееся в интерфазе "кольцо" мононуклеаров отбирают пипеткой, полученную клеточную взвесь трижды отмывают раствором хлорида натрия (9 г/л, pH=7,2) и доводят концентрацию до 2×10⁶ клеток/мл. Жизнеспособность клеток, которую определяли по связыванию трипанового синего, составляет 95-100%.

Для определения уровня активности каспазы-3 в лимфоцитах периферической крови полученную взвесь мононуклеаров отмывают дважды в холодном фосфатно-солевом буфере (PBS), затем с целью пермеабилизации мембраны взвесь клеток ресуспендируют в растворе Cytofix/Cytoperm^TM в концентрации 1×10⁶ клеток/0,5 мл. Далее клетки инкубируют в течение 20 минут на льду, центрифугируют 10 минут при 1,500 об/мин, удаляют надосадочную жидкость, после чего дважды отмывают в растворе буфера Perm/Wash^TM в соотношении 0,5 мл буфера/1×10⁶клеток при комнатной температуре. Затем удаляют надосадочную жидкость, к осадку добавляют 100 мкл Perm/Wash^TM буфера и 20 мкл антител. Клетки ресуспендируют и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После этого пробы отмывают в 1 мл раствора Perm/Wash^TM буфера, затем ресуспендируют в 0,5 мл раствора Perm/Wash^TM буфера и анализируют на проточном цитометре. Для измерения интенсивности флуоресценции фикоэритрина (РЕ) используют узкополостной фильтр 585/42 нм (FL2).

Цитометрический анализ лимфоцитов проводят на проточном цитофлуориметре PARTEC PAS (Германия). Накопление производят до 5000 событий в лимфоцитарной области. Сбор данных и компьютерную обработку проводят с использованием программы FloMax.

При уровне активности эффекторной каспазы-3 менее или равном 0,98% диагностируют АБА, а при уровне эффекторной каспазы-3 более или равном 1,0% диагностируют НАБА.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больной Т., 18 лет. Клинический диагноз: АБА (бытовая сенсибилизация), легкое течение, фаза обострения. Аллергический ринит, постоянная форма. Страдает БА с 8-летнего возраста. Впервые приступ удушья возник при контакте с домашней пылью. Наследственность отягощена по БА астме: отец и брат страдают БА.

Аллергологическим обследованием подтверждено наличие бытовой сенсибилизации.

При обследовании предлагаемым способом уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови составляет 0,39%, что характерно для больных АБА.

Рекомендованный курс специфической иммунотерапии (СИТ) с аллергеном домашней пыли обеспечил положительный эффект. Применение интала привело к стойкой ремиссии.

Пример 2. Больная И., 20 лет. Клинический диагноз: АБА (бытовая, эпидермальная сенсибилизация), легкое течение, ремиссия. Аллергический ринит, постоянная форма. Страдает БА в течение 2-х лет. Впервые приступ удушья возник при контакте с домашней пылью. Наследственность отягощена по БА: мать страдает БА.

Аллергологическим обследованием подтверждено наличие бытовой и эпидермальной сенсибилизации.

При обследовании выявлена эозинофилия в клиническом анализе крови (5,2%), мокроты (18%). По результатам ФВД: выявлены умеренные обструктивные нарушения, частично обратимая обструкция, выраженный бронхоспазм.

При обследовании предлагаемым способом уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови составляет 0,98%, что подтверждает наличие АБА.

После назначения интала достигнут положительный эффект.

Пример 3. Больная Л., 54 года. Клинический диагноз: НАБА (инфекционно-зависимая, нервно-психическая), средней степени тяжести, фаза затихающего обострения. Страдает БА в течение 1,5 лет. Дебют заболевания после перенесенного бронхита. Отмечает связь приступов удушья с резкими запахами, переохлаждением. Настоящее ухудшение в течение 2-х недель после перенесенного ОРВИ. Наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям не отмечает.

В клиническом анализе крови - лейкоцитоз: лейкоциты - 15,4*10⁹/л, СОЭ - 40 мм в час. При цитологическом исследовании мокроты выявлен выраженный воспалительный процесс (нейтрофилы 70%), небольшая эозинофилия.

При обследовании предлагаемым способом уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови составляет 1,00%, что подтверждает наличие НАБА.

Применение антибактериальной терапии (цефтриаксона) имело положительный эффект.

Пример 4. Больная К., 55 лет. Клинический диагноз: НАБА (инфекционно-зависимая), средней степени тяжести, фаза обострения. Страдает БА в течение 7 лет, дебют заболевания на фоне обострения хронического бронхита. Наследственность по БА не отягощена. Имеет профессиональные вредности.

В клиническом анализе крови - лейкоцитоз: лейкоциты - 12,3*10⁹/л, СОЭ - 33 мм в час. При цитологическом исследовании мокроты выявлен воспалительный процесс (нейтрофилы 44%), небольшая эозинофилия.

При обследовании предлагаемым способом уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови составляет 2,40%, что подтверждает наличие НАБА.

К терапии БА добавлен антибактериальный препарат. На фоне антибактериальной терапии обострение заболевания купировано.

Заявляемый способ обладает простотой, безопасностью и достаточной информативностью при дифференциальной диагностике вариантов БА.

Способ дифференциальной диагностики бронхиальной астмы, включающий определение уровня активности индуктора апоптоза биологических клеток, отличающийся тем, что определяют уровень активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической венозной крови и при уровне активности эффекторной каспазы-3 не более 0,98% диагностируют аллергическую бронхиальную астму, а при уровне активности эффекторной каспазы-3 не менее 1,00% диагностируют неаллергическую бронхиальную астму.

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики нарушений образования энергии в митохондриях у подростков. .

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по классическому пути // 2457491

Изобретение относится к области медицины. .

Способ прогнозирования развития остеопенического синдрома в послеродовом периоде // 2456599

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и касается способа прогнозирования развития остеопенического синдрома в послеродовом периоде.

Молекулярно-генетический способ определения чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого к терапии гефитинибом // 2454464

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, и может быть использовано для молекулярно-генетической диагностики чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом.

Способ определения кардиотоксических осложнений у больных хроническим лимфолейкозом // 2450791

Изобретение относится к медицине, онкологии и гематологии и может быть использовано для определения кардиотоксических осложнений у больных хроническим лимфолейкозом, получающих полихимиотерапию.

Способ дифференциальной диагностики увеитов при болезни бехтерева и ревматоидном артрите // 2450276

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики увеита при ревматоидном артрите и болезни Бехтерева.

Способ прогноза перехода острого бактериального конъюнктивита в затяжное или хроническое течение // 2450271

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и касается способа прогноза перехода острого бактериального конъюнктивита в затяжное или хроническое течение.

Способ количественного определения активности протеолитических ферментов с различным типом активных центров, способных расщеплять иммуноглобулины классов iga, igm, igg // 2447446

Изобретение относится к прикладной биохимии, медицине, ветеринарии и клинической лабораторной диагностике и касается способа определения активности тканевых, бактериальных, вирусных и грибковых протеиназ, расщепляющих иммуноглобулины различных классов.

Способ прогноза клинического течения бактериального конъюнктивита // 2446399

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и касается способа прогнозирования клинического течения бактериального конъюнктивита. .

Способ прогнозирования развития осложнений у больных внебольничной пневмонией // 2444017

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования осложненного течения у больных внебольничной пневмонией.

Способ оценки репаративных процессов у пациентов при оперативном удлинении костей конечности // 2478973

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и применяется для оценки остеорепаративных процессов

Способ оценки степени цитолиза кардиомиоцитов при инфекционных поражениях миокарда // 2487361

Изобретение относится к лабораторной диагностике осложнений инфекционных болезней и может быть использовано для оценки степени выраженности цитолиза кардиомиоцитов при поражениях миокарда, развивающихся на фоне различных острых инфекционных заболеваний

Композиция реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции // 2488120

Изобретение относится к химическим композициям реагентов

Способы созревания фолликулов яичника in vitro // 2492866

Группа изобретений относится к медицине, фармакологии, к способам и композициям ингибиторов фосфатазы PTEN для созревания овариальных фолликулов и ооцитов in vitro. Использование ингибиторов фосфатазы PTEN, таких как комплексы оксованадата и пероксованадата: биспероксо (бипиридин) оксованадат, биспероксо (1,10-фенантролин) оксованадат, биспероксо (пиколинато) оксованадат, биспероксо (5-гидроксипиридин-2-карбоксил) оксованадат, ди-(пиколинат) оксованадат, ди-(3-гидроксипиколинат) оксованадат, биспероксо (фенилбигуанид) оксованадат, ди-(фенилбигуанид) оксованадат и биспероксо (изохинолинкарбоновой кислоты) оксованадат, обеспечивает созревание и/или активацию in vitro ооцитов и фолликулов, таких как примордиальные, промежуточные и первичные фолликулы. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

Способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроогранизмов к антибиотикам на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат // 2518249

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат, с пороговой чувствительностью 50 пг/мл, включающий: 1) выделение фосфодиэстеразы-мишени из лизированных бактериальных клеток; 2) связывание фосфодиэстеразы биотинилированными антителами, специфичными к некаталитическим доменам фосфодиэстеразы; 3) аффинную очистку комплексов, сформированных фосфодиэстеразой-мишенью и биотинилированным антителом при помощи парамагнитных частиц, содержащих нейтравидин или его аналоги, связывающие биотин; 4) взаимодействие комплексов фосфодиэстераза/биотинилированное антитело, иммобилизованных на парамагнитных частицах, с комплексами, содержащими с-di-GMP в форме G-квадруплексов с интеркалированным красителем, сопровождающееся падением интенсивности флуоресценции по мере разрушения комплексов интеркалирующего красителя c-di-GMP; 5) измерение падения флуоресценции при гидролизе c-di-GMP и разрушении комплекса c-di-GMP с интеркалирующим красителем с последующим количественным определением активности фосфодиэстеразы на основании калибровочных кривых, построенных с использованием известных количеств рекомбинантного фермента фосфодиэстеразы, идентичного исследуемой мишени; 6) выявление повышенного уровня фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемого тестируемыми антибиотикоустойчивыми бактериальными штаммами, способными к формированию биопленок, по сравнению с уровнем фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемым для контрольных штаммов бактерий того же вида, не обладающих антибиотикоустойчивостью и способностью к формированию биопленок. Способ позволяет определить неспецифическую устойчивость патогенных микроорганизмов к антибиотикам и установить факт присутствия бактериальных биопленок. 4 ил., 5 пр.

Высокочувствительный способ определения иммуноглобулин-протеиназной активности с использованием полимерных матриц // 2519071

Изобретение относится к области биохимии и предназначено для определения IgG-протеиназной активности. В лунках полистиролового планшета сорбируют полимерные матрицы небелковой природы - ДНК, хитин, затем в лунки добавляют специфические к этой матрице IgG и раствор, содержащий протеолитические ферменты. После инкубации, в ходе которой происходит протеолитическое расщепление иммуноглобулиновых молекул, в лунки вносят конъюгат фермента пероксидазы с белком A стафилококка и субстрат этого фермента. Далее производят учет результатов реакции с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм и проведение расчета IgG-протеиназной активности по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции. Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью, отсутствием необходимости использовать белковые антигены, малым расходом субстрата, при котором саму реакцию и ее детекцию осуществляют в одной и той же лунке микропланшета. 1 ил., 1 табл., 12 пр.

Способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления // 2522231

Группа изобретений относится к области медицинской диагностики, иммунологии и онкологии, в частности к новым онкомаркерам и способам диагностики онкологических заболеваний. Предложены новые антигены для проведения иммуноферментного анализа для выявления аутоантител, ассоциированных со злокачественными новообразованиями, а именно фрагменты плазминогена, содержащие кринглы. Предложен также способ выявления диагностического признака при онкологических заболеваниях, заключающийся в выявлении аутоантител типа IgA, IgG, IgM к следующим фрагментам плазминогена: тяжелая цепь (Glu-H), тяжелая цепь (Lys-H), легкая цепь (L), K1-4 (Tyr80-Ala440), K1-3 (Tyr80-Val338), K1-3 (Tyr80-Val354), K1-4 (Asn60-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro446), K1-4 (Lys78-Lys468), K1-4,5 (Lys78-Arg530), K4-5 (Val355-Phe546), K1 (Tyr80-Glul64), K2-3 (Cysl65-Val338), K4 (Val354-Ala440), K5 (Ser441-Fhe546), K5 (Val442-Arg561), мини-плазмин в образце плазмы крови человека. Настоящая группа изобретений эффективна в ранней диагностике онкологических заболеваний. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 5 пр.

Способ прогнозирования неблагоприятного исхода гипертрофической кардиомиопатии // 2527768

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования неблагоприятного исхода гипертрофической кардиомиопатии. Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) в крови пациента определяют величины тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP 1) и терминального фрагмента мозгового натрийуретического пептида (NT pro BNP). Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяют генотипы полиморфных вариантов G894T гена эндотелиальной NO-синтазы (NOS3) и A(-1903)G гена химазы (СМА1). При величинах TIMP 1 =< 635,7 нг/мл, NT pro BNP => 42,56 пмоль/мл в сочетании с наличием генотипа g/t G894T NOS3 и генотипа a/g A(-1903)G СМА1 делают вывод о неблагоприятном исходе заболевания. Изобретение обеспечивает прогнозирование неблагоприятного исхода гипертрофической кардиомиопатии (фибрилляция предсердий, прогрессирующее течение гипертрофической кардиомиопатии, внезапная сердечная смерть) еще до появления первых клинических симптомов и способствует более эффективному проведению первичной профилактики внезапной сердечной смерти и других жизненно опасных осложнений заболевания. 2 табл., 3 пр.

Способ дифференциальной диагностики стадий хронизации вирусного гепатита с у подростков // 2528911

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, инфектологии и гепатологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики стадий хронизации вирусного гепатита С у подростков. Для осуществления изобретения в лимфоцитах, выделенных из венозной крови больных, определяют активность фермента глутатионредуктазы (ГР). При значении показателя равном или выше 0,37 мкЕ/10000 кл диагностируют первую-вторую стадию хронизации, а при значении показателя ниже 0,37 мкЕ/10000 кл - третью стадию хронизации инфекционного процесса. Способ позволяет прогнозировать течение заболевания без биопсии печени, определять адекватную стратегию лечения и может быть рекомендован для широкого использования в клинической практике. 1 табл., 2 пр.

Способ идентификации модуляторов катехол о-метилтрансферазы // 2535125

Изобретение относится к медицине и описывает способ идентификации модуляторов активности фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ), включающий а) получение 4-нитрокатехола, ковалентно связанного с Alexa Fluor® 488, б) приведение в контакт молекулы из этапа а) с ферментом катехол-O-метилтрансферазой (COMT), S-аденозилметионином (SAM) и соединением-кандидатом и в) измерение показателей флуоресценции смеси из этапа б), в котором измененные показатели флуоресценции в присутствии соединения-кандидата по сравнению с контролем являются признаком наличия модулятора фермента катехол-O-метилтрансферазы (COMT). Также описан способ идентификации субстрата фермента катехол-O-метилтрансферазы. Заявленное изобретение может быть использовано для идентификации соединений, которые ингибируют фермент СОМТ, для определения активности СОМТ в образцах тканей животных. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 пр.,7 ил.