Интерферониндуцирующее средство для лечения острых респираторных вирусных инфекций (орви)
Владельцы патента RU 2470634:
Общество с ограниченной ответственностью "Научно-исследовательская компания "Медбиофарм" (RU)
Изобретение относится к медицине и к фармакологии, а именно к лекарственному средству, индуцирующему альфа- и бета-интерферон, и может быть использовано для лечения острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ). Средство представляет собой гидрохлорид 5-гидрокси-4-диметиламинометил-1-циклогексил-2-метил-3-этилоксикарбонилиндол. Изобретение обеспечивает расширение его противовирусного действия. 13 табл.
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и созданию лекарственных средств, обладающих интерфероногенным действием, и может быть использовано для лечения острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ).
ОРВИ является самым распространенным инфекционным заболеванием в развитых странах. Взрослый болеет ОРВИ не реже 2-3 раз в год, в дошкольном возрасте дети болеют ОРВИ 6-12 раз в год (Г.З.Пискунов, С.З. Пискунов, Клиническая ринология, М., 2006, стр.181). В России на ОРВИ, включая грипп, ежегодно приходится до 90% от всей регистрируемой инфекционной заболеваемости. По данным Минздравсоцразвития РФ в 2004 г. экономические потери от этой группы заболеваний составили 86% от всего ущерба, наносимого инфекционными болезнями. ОРВИ вызывается большим числом возбудителей, среди которых не менее 7 различных групп вирусов. Наиболее частыми возбудителями ОРВИ является вирус гриппа, парагриппа, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы, реовирусы, пикорнавирусы. Против большинства возбудителей ОРВИ в настоящее время не разработаны химиопрепараты. Большое количество вирусных агентов, вызывающих ОРВИ, и достаточно высокая к ним восприимчивость способствуют возникновению смешанной инфекции. Поскольку дифференциальная диагностика вирусной инфекции хотя и возможна, но затруднена, для лечения ОРВИ рекомендуют использовать в первые часы заболевания препараты интерферона, которые эффективны в отношении всех вирусов-возбудителей ОРВИ, не зависимо от вида. Профилактическая эффективность интраназального применения интерферона достаточно убедительно доказана и подтверждена результатами мета-анализа (Jefferson Т.О., Tyrrell D., Antivirals for the common cold. The Cochrane Database of Systematic Reviews, 2005, Issue 3. Available at: http://www.cochrane.org/reviews/en/pkl67000032810144047.html). Однако применение экзогенного интерферона с лечебной целью имеет низкую эффективность действия, возможно, вследствие низкой его концентрации в растворе (Г.З.Пискунов, С.З.Пискунов, Клиническая ринология, М., 2006, стр.218). Поскольку в патогенезе ОРВИ самым важным звеном являются изменения в месте входных ворот инфекции (слизистая оболочка носа), то вполне оправдано местное интраназальное применение препарата. Недостатком интраназально вводимых препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона является высокая частота нежелательных реакции: кровянистые выделения из носа, гриппоподобные симптомы, сонливость, аллергические реакции и другие. Перспективным направлением в терапии больных гриппом является использование препаратов, которые стимулируют продукцию собственных эндогенных интерферонов, т.е. индукторов интерферонов. Применение индукторов интерферонов не требует многократного введения, они не обладают антигенностью, у них отсутствуют побочные эффекты, свойственные препаратам интерферонов (В.П.Малый, М.Г.Романцов, Ю.В.Сологуб, Грипп, Пособие для врачей, с.61, Санкт-Петербург-Харьков, 2007 г.). Кроме того, с помощью индукторов интерферонов можно добиться стимулирования образования собственных интерферонов в организме человека в таких концентрациях, которые обладают высокой противовирусной активностью.
Авторами настоящего изобретения установлено, что соединение гидрохлорид 5-гидрокси-4-диметиламинометил-1-циклогексил-2-метил-3-этилоксикарбонилиндол (далее препарат) обладает противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А. Указанный препарат имеет следующую структуру:
Целью настоящего изобретения является расширение применимости препарата путем распространения его противовирусного действия на другие вирусы - возбудители ОРВИ. Поставленная цель достигается тем, что обнаруженная у препарата способность индуцировать интерфероны ά и β, позволяет его использовать для лечения ОРВИ не зависимо от вируса, вызвавшего данное заболевание. При этом имея в виду, что вирус гриппа является наиболее частой причиной ОРВИ, в большинстве случаев заболевания препарат будет оказывать двойное лечебное действие: как химиотерапевтический препарат и как индуктор интерферона. В тех случаях, когда причиной ОРВИ будут другие вирусы, лечебный эффект будет достигаться за счет эндогеннообразующегося интерферона.
Для доказательства интерферониндуцирующей активности препарата были проведены эксперименты по определению уровней γ-, ά- и β-интерферонов в крови мышей, которым вводили препарат в двух дозах. В качестве препарата сравнения был использован арбидол, который, как было установлено ранее, обладает противовирусной и интерферониндуцирующей активностью (патент №2033157. Опубликовано 20.04.1995. «Средство, обладающее интерферониндуцирующей и иммуномодулирующей (иммуностимулирующей) активностью»). Определение различных типов интерферонов проведено с помощью метода ИФА.
Пример 1. Определение γ-интерферона
Все эксперименты в данном исследовании выполнены на мышах-самцах F1(CBAxC57BL)6 массой 22-24 г. Животные были разделены на 13 групп (12 опытных и 1 контрольную). В качестве контроля использованы интактные мыши. Препаратом сравнения служил арбидол. Препарат изучали в двух дозах (90 и 180 мг/кг). На каждую точку наблюдения использовано по 10 мышей. Препараты, приготовленные на 1%-ном крахмальном геле, вводили однократно по 0,2 мл, внутрижелудочно. Уровень γ-интерферона в сыворотке крови изучали в сроки через 16, 24 и 48 ч после введения препаратов. Кровь забирали под нембуталовым наркозом (60 мг/кг) из сердца, полученные образцы крови оставляли на 2 ч при комнатной температуре для свертывания. Сыворотку крови отделяли центрифугированием, замораживали и хранили при -20°С вплоть до проведения иммуноферментной реакции. Для определения концентрации интерферона использован коммерческий набор реагентов производства фирмы «R&D» Иммуноферментную реакцию проводили в пулированной сыворотке (две мыши/пул). Разведенный стандарт и испытуемые образцы вносили на планшеты в дубликатах. Оценка содержания γ-интерферона проводилась в соответствии с инструкцией фирмы-производителя набора. Использованный набор ИФА имел предел чувствительности 2 пг/мл.
Показатели концентрации интерферона в сыворотке крови анализировали статистически: рассчитывали М±m. Различия между сравниваемыми группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Как показало проведенное исследование, препарат не обладает γ-интерферониндуцирующей активностью. Незначительные концентрации γ-интерферона, близкие к уровню минимально выявляемой концентрации, в данной тест-системе зафиксированы во все сроки исследования в тестируемых образцах сывороток от животных, получавших препарат в двух дозах (Табл. 1, 2). Статистически значимых различий по концентрации γ-интерферона в этих группах не выявлено. Во всех остальных обследованных образцах сывороток (с введением препарата сравнения арбидола и группы биоконтроля) уровень γ-интерферона был ниже возможности их выявления. Концентрация γ-интерферона оставалась ниже предала чувствительности используемого набора ИФА (Табл. 3, 4).
| Табл.1 | ||
| Концентрация γ-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 90 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m |
| 1,46±0,198 | 1,24±0,211 | 1,07±0,179 |
| Табл.2 | ||
| Концентрация γ-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 180 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m |
| 1,94±0,261 | 1,66±0,146 | 1,84±0,336 |
| Табл.3 | ||
| Концентрация γ-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 90 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m |
| 0,352 | 1,346 | 0 |
| Табл.4 | ||
| Концентрация γ-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 180 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m |
| 0 | 0 | 0 |
В сыворотках интактных мышей γ-интерферон не определяется.
Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что препарат обладает крайне низкой γ-интерферониндуцирующей способностью. Препарат сравнения арбидол также не является индуктором γ-интерферона.
Пример 2. Определение ά-интерферона. Условия эксперимента описаны в примере 1.
Результаты исследования ά-интерферона в сыворотке мышей, получавших препарат
Результаты определения ά-интерферона в сыворотках мышей после введения им препарата и Арбидола в различные сроки после введения препарата приведены в Таблицах 5-8.
Как показало проведенное исследование, препарат индуцирует образование ά-интерферона в количествах, сопоставимых с продукцией ά-интерферона препаратом сравнения Арбидолом.
| Табл.5 | ||
| Концентрация ά-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 90 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m |
| 35,13±3,01 | 41,52±2,89 | 17,86±1,45 |
| Табл.6 | ||
| Концентрация ά-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 180 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m |
| 36,39±2,79 | 41,88±2,74 | 24,45±2,03 |
| Табл.7 | ||
| Концентрация ά-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 90 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, M±m |
| 38,41±2,87 | 45,54±3,25 | 26,13±2,44 |
| Табл.8 | ||
| Концентрация ά-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 180 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m |
| 39,21±3,20 | 47,14±3,71 | 21,13±2,11 |
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что препарат, введенный per os, индуцирует образование ά-интерферона в организме мышей. Эффект характеризуется некоторой дозной зависимостью.
Пример 3. Определение β-интерферона. Условия эксперимента описаны в примере 1.
Результаты исследования β-интерферона в сыворотках мышей, получавших препарат
Как свидетельствуют результаты, представленные в Табл.9-12, препарат является эффективным индуктором β-интерферона, который по своей интерферониндуцирующей активности сопоставим с активностью препарата сравнения Арбидолом.
| Табл.9 | ||
| Концентрация β-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 90 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m |
| 28,25±2,54 | 40,60±2,52 | 16,89±0,98 |
| Табл.10 | ||
| Концентрация β-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 180 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m |
| 20,91±2,77 | 33,05±3,59 | 5,65±1,23 |
| Taбл.11 | ||
| Концентрация β-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 90 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m | Кол-во, пг/мл, М±m |
| 27,75±2,70 | 44,82±3,02 | 18,31±2,12 |
| Табл.12 | ||
| Концентрация β-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 180 мг/кг | ||
| ЧЕРЕЗ | ||
| 16 час | 24 час | 48 час |
| Кол-во | Кол-во | Кол-во |
| пг/мл | пг/мл | пг/мл |
| М±m | М±m | М±m |
| 0 | 0 | 0 |
| Табл.13 | ||
| Противовирусная активность арбидола и заявляемого препарата в культуре клеток Нер-2 в отношении респираторно-синцитиального вируса штамма Long | ||
| Концентрация, мкг/мл | Процент защиты (%) клеток от вирусной инфекции | |
| арбидол | заявляемый препарат | |
| 5 | 66 | 0,48 |
| 7,5 | 100 | 0,94 |
| 10 | 100 | 100 |
| 20 | Токсическое действие на клетки | 100 |
Таким образом, результаты представленных экспериментов свидетельствуют о том, что препарат не индуцирует образование γ-интерферона, но является эффективным индуктором ά- и β-интерферонов. По интерферониндуцирующей способности препарат не уступает препарату сравнения Арбидолу.
Средство, индуцирующее альфа и бета интерферон, для лечения острых респираторных вирусных инфекций, представляющее собой гидрохлорид 5-гидрокси-4-диметиламинометил-1-циклогексил-2-метил-3-этилоксикарбонилиндол следующей структурной формулы:
