Способ экспресс-определения антибактериального потенциала хитозана в отношении стафилококков

Авторы патента:

Шакирова Диана Рустемовна (RU)

Хайруллин Руслан Зуфарович (RU)

Филиппова Юлия Александровна (RU)

Куликов Сергей Николаевич (RU)

Фассахов Рустэм Салахович (RU)

G01N33/52 - использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги

Владельцы патента RU 2488116:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора (RU)

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно микробиологии, и описывает способ определения антибактериального потенциала хитозана в отношении стафилококков путем оценки активации хитозановым полимером ферментативного разрушения клеток бактерий, при котором к суспензии инактивированных клеток стафилококка в буферном растворе добавляют аликвоту исследуемого образца хитозана в виде раствора, затем добавляют аликвоту лизостафина в виде раствора и смесь инкубируют при 37°C, после чего определяют лизис клеток бактерий по уменьшению оптической плотности смеси. Способ обеспечивает быстроту определения антибактериального потенциала хитозана в отношении стафилококков, отсутствие необходимости использовать живую культуру бактерий и малый расход исследуемого вещества. 2 пр., 2 табл.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения антибактериального потенциала хитозана в отношении стафилококков путем оценки активации хитозановым полимером ферментативного разрушения клеток бактерий.

Хитозан - группа веществ, представляющая собой сополимер глюкозамина и ацетилглюкозамина, различающихся по молекулярной массе, степени деацетилирования, расположению ацетилированных и деацетилированных остатков вдоль полимерной цепи и другим молекулярно-массовыми параметрами. Такая вариация химической структуры хитозана влияет на проявление им биологической активности, в частности - антибактериальной активности [1, 2]. Стандартное определение антибактериальной активности хитозана сводится к оценке его минимальной бактериостатической (ингибирующей) и/или минимальной бактерицидной концентраций в отношении бактерий, которое требует длительной, от 24 до 48 ч, инкубации [3]. Кроме того, использование живых условно-патогенных бактерий ведет к необходимости соблюдения специальных требований норм безопасности и дополнительных специальных условий, например, наличие стерильного бокса, необходимость подготовки стерильной посуды и питательных сред.

Вместе с тем известно, что антибактериальное действие хитозана, как и других антибактериальных веществ, определяются теми биохимическими процессами, которые подвергаются изменению под их воздействием. Одним из механизмов действия хитозана может являться активация этим полимером ферментативного разрушения клеток бактерий. Известно, что в клеточных стенках всех грам-положительных бактерий, к которым относятся и стафилококки, содержатся автолизины - ферменты, участвующие в деградации гликопептидной основы клеточной стенки в процессе роста и деления бактериальных клеток. В регуляции активности этих ферментов принимают участие тейхоевые и тейхуроновые кислоты - отрицательно заряженные полимерные компоненты клеточных стенок грам-положительных прокариот. Отрицательно заряженные тейхоевые и тейхуроновые кислоты за счет электростатического взаимодействия связывают автолизины, которые заряжены положительно (характерная особенность для всех автолизинов), тем самым препятствуя их чрезмерному вовлечению в деградацию гликопептида клеточной стенки [4]. Поэтому, искусственное высвобождение автолизинов из их комплекса с тейхоевыми и тейхуроновыми кислотами способно привести к усилению ферментативного расщепления гликопептида клеточной стенки, приводящее к лизису всей клеточной стенки и гибели самой бактериальной клетки. Такими веществами могут выступать положительно заряженные молекулы, в особенности поликатионные, которые будут конкурентно вытеснять автолизины из их комплекса с полианионными кислотами клеточных стенок. В литературе описан эффект усиления действия автолитических ферментов бактерий на клеточные стенки при добавлении положительно заряженных веществ белковой природы, также показано, что это связано именно с препятствованием этими веществами связывания автолизинов с тейхоевыми и тейхуроновыми кислотами [5]. Учитывая поликатионную природу хитозана он также способен проявлять свои антибактериальные свойства посредством активации ферментативного разрушения клеток бактерий.

Задачей заявленного изобретения является разработка простого способа, позволяющая быстро, менее чем за 1 час, определять антибактериальную активность (потенциал) хитозана в отношении стафилококков, путем оценки активации хитозановым полимером ферментативного разрушения (лизиса) клеток бактерий.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает использование суспензии инактивированных (нагреванием на водяной бане при 100°C в течение 15 минут) клеток Staphylococcus aureus в 0,02 М MES-Na буфере с pH 6,50 с оптической плотностью 0,300 при длине волны 600 нм (что соответствует приблизительной концентрации 500 млн клеток в 1 мл суспензии), к которой добавляется аликвота раствора образца хитозана с известной концентрацией, затем к суспензии добавляется раствор лизостафина (Lysostaphin из Staphylococcus staphylolyticus, «Sigma-Aldrich», USA), содержащего 1U фермента, проведение инкубации смеси при 37°C в течение 30 минут с последующей оценкой лизиса клеток бактерий путем определения уменьшения оптической плотности суспензии при длине волны 600 нм.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка быстрого способа определения антибактериального потенциала хитозана в отношении стафилококков, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов, отсутствием необходимости использовать живую культуру бактерий и малым расходом исследуемого вещества.

Пример 1. Экспресс-определение антибактериального потенциала хитозана в отношении S. aureus. В пробирки вносят суспензию клеток S.aureus (предварительно инактивированных нагреванием на водяной бане при 100°C в течение 15 минут) в 0,02 М MES-Na буфере с pH 6,50 с оптической плотностью 0,300 при длине волны 600 нм (что соответствует приблизительной концентрации 500 млн клеток в 1 мл суспензии). Добавляют к суспензии клеток 2,5 мкл раствора хитозана с молекулярной массой 1 кДа (или 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20, 100, 600 кДа) в концентрации 8 мг/мл и смесь тщательно перемешивают (в контрольный вариант добавляют 2,5 мкл воды). Затем добавляют 25 мкл раствора, содержащего 1U лизостафина (фермента). Полученную смесь тщательно перемешивают и помещают на инкубацию при 37°C. По истечении 15 минут инкубации проводят измерение оптической плотности суспензий при длине волны 600 нм. За условную еденицу активности фермента принимают изменение оптической плотности суспензии на 0,001 за 15 минут. После измерения подсчитывают и сравнивают уровень активации хитозановым полимером ферментативного разрушения клеток бактерий посредством определения условных едениц активности фермента (лизостафина), активируемое хитозаном. Для этого из разницы оптических значений между опытом с хитозаном (суспензия + хитозан) и опытом с добавлением фермента и хитозана (суспензия + фермент + хитозан) вычитаем разницу оптических значений между контролем (суспензия) и опытом с ферментом (суспензия + фермент). Полученные результаты приведены в таблице 1. Сопоставление условных едениц активности фермента, активированная хитозанами с показателями минимальных ингибирующих концентраций (МИК) этих же образцов хитозана позволяет сделать вывод о пригодности заявляемого способа для экспресс-определения антибактериального потенциала хитозанов.

Пример 2. Экспресс-определение антибактериального потенциала хитозана проводят аналогично примеру 1, но в качестве тест-объекта используют суспензию Staphylococcus epidermidis. Полученные результаты приведены в таблице 2.

ЛИТЕРАТУРА

1. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С., Варламов В.П. / Антибактериальная и антимикотическая активность хитозана: механизмы действия и роль структуры // Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии, 2009, №5, с.91-97.

2. Tharanathan R.N., Kittur F.S. Chitin - the undisputed biomolecule of great potential. Crit. Rev. Nutr. 2003. V.43. P.61-87.

3. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Зуева О.Ю., Варламов В.П. / Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов. // Прикл. биохим. микробиол. 2004. Т.40. №3. С.301-306.

4. Дмитриева Н.Ф., Тимофеев Ю.М. / Липотейхоевые и тейхоевые кислоты патогенных стрептококков: структура, функции, роль во взаимодействии возбудителя с макроорганизмом // Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии. 2007, №6: с.100-107.

5. Bierbaum G., Sahl H.G. / Autolytic system of Staphylococcus simulans 22: influence of cationic peptides on activity of N-acetylmuramoil-L-alanine amidase. // J. Bacteriol. 1987, V.169, p.5452-5458.

Таблица 1
Изменение оптической плотности (ОП) суспензии S.aureus
Хитозан, кДа	Суспензия + фермент, ОП	Суспензия + хитозан, ОП	Суспензия + фермент + хитозан, ОП	Ус.ед. активности фермента, активируемая хитозаном	МИК хитозана в МИК, мкг/мл опыт in vitro
1	0,230	0,300	0,220	10	≥2000
2	0,230	0,300	0,215	15	2000
3	0,230	0,305	0,190	45	500
4	0,230	0,310	0,170	70	250
5	0,230	0,320	0,165	85	250
8	0,230	0,325	0,135	120	125
10	0,230	0,330	0,135	125	125
15	0,230	0,330	0,135	125	125
20	0,230	0,340	0,145	125	125
100	0,230	0,340	0,150	120	125
600	0,230	0,340	0,180	90	250
* ОП контрольного варианта (суспензия) равна 0,300

Таблица 2
Изменение оптической плотности (ОП) суспензии S. epidermidis
Хитозан, кДа	Суспензия + фермент, ОП	Суспензия + хитозан, ОП	Суспензия + фермент + хитозан, ОП	Ус.ед. активности фермента, активируемая хитозаном	МИК хитозана, мкг/мл
1	0,250	0,300	0,240	10	250
2	0,250	0,300	0,225	25	62
3	0,250	0,305	0,225	30	31
4	0,250	0,315	0,230	35	15
5	0,250	0,320	0,230	40	7,5
8	0,250	0,330	0,230	50	1
10	0,250	0,335	0,230	55	1
15	0,250	0,335	0,220	65	0,5
20	0,250	0,340	0,220	70	0,5
100	0,250	0,340	0,220	70	0,5
600	0,250	0,345	0,245	50	1
* ОП контрольного варианта (суспензия) равна 0,300

Способ определения антибактериального потенциала хитозана в отношении стафилококков путем оценки активации хитозановым полимером ферментативного разрушения клеток бактерий, характеризующийся тем, что к суспензии инактивированных клеток стафилококка в буферном растворе добавляют аликвоту исследуемого образца хитозана в виде раствора, затем добавляют аликвоту лизостафина в виде раствора и смесь инкубируют при 37°C, после чего определяют лизис клеток бактерий по уменьшению оптической плотности смеси.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования повышенного риска формирования у ребенка 3-7 лет хронической оториноларингологической патологии.

Способ обнаружения экзогенных стероидов в биологической жидкости человека // 2483309

Изобретение относится к области медицины, а точнее к клинической химии и, в частности, к способам определения наличия экзогенных стероидов в организме. .

Способ определения концентрации селена в крови // 2482492

Изобретение относится к аналитической химии, а также может быть использовано в медицине для определения содержания селена в крови и контроля состояний селеновой недостаточности человека и животных.

Способ диагностики эндометриоидных кист яичников // 2480761

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и найдет широкое применение для объективной диагностики эндометриоидных кист яичников (ЭКЯ). .

Способ индивидуального подбора иммуноактивных препаратов при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний // 2480760

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний. .

Способ диагностики различных форм острого пиелонефрита // 2478968

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для дифференциальной диагностики острого пиелонефрита. .

Способ прогнозирования исхода травматических внутричерепных гематом на нейрореанимационном этапе // 2478208

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, и может быть использовано для прогнозирования исхода у пациентов с травматическими внутричерепными гематомами в течение первых 10 суток нейрореанимационного периода.

Способ прогнозирования манифестации внутриутробной герпесвирусной инфекции у новорожденных детей // 2477484

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования манифестации внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, у новорожденных детей, рожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности.

Способ определения н-бутилового эфира 2-[4-(5-трифторметилпиридил-2-окси)фенокси]пропионовой кислоты в биологическом материале // 2477479

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способу определения н-бутилового эфира 2-[4-(5-трифторметилпиридил-2-окси)фенокси]пропионовой кислоты в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидемстанций, химико-токсикологических, ветеринарных и экологических лабораторий.

Способ дифференциальной диагностики причины смерти от алкогольной кардиомиопатии и смерти в результате иных причин // 2475750

Изобретение относится к судебной медицине и может быть использовано для определения причины смерти. .

Способ диагностики травм глаза // 2488825

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной и клинической офтальмологии, аналитической химии и может быть использовано для экспресс-диагностики проникающих и непроникающих травм роговицы при отсутствии клинических данных

Способ определения активности клеток костного мозга // 2488826

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, цитологии, патоморфологии, и может быть использовано для определения энергетической активности клеток костного мозга (ККМ)

Способ диагностики комбинированного воздействия ароматических углеводородов, оксидов олефинов и их смеси на работников нефтехимических и химических производств // 2488827

Способ определения допинга у лошадей // 2489719

Изобретение относится к области исследования или анализа материалов, в том числе ксенобиотиков, путем разделения образцов материалов на составные части с использованием хроматографии и масс-спектрометрии, а точнее к способам идентификации и определения в живом организме веществ, запрещенных к применению, и может быть использовано например в допинговом контроле лошадей

Способ оценки развития сингенного перевивного миелобластного лейкоза у мышей линии akr/jy // 2490637

Изобретение относится к медицине, в частности, к экспериментальной гематологии, а именно к способу оценки развития сингенного перевивного миелобластного лейкоза у мышей линии AKR/JY

Способ оценки сорбционной способности клетки // 2492486

Способ диагностики нарушения иммунного статуса у детей в условиях химической контаминации // 2494401

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и аллергологии, и может быть использовано для диагностики реактивного изменения специфического иммунитета у детей в условиях химической контаминации. Для этого производят отбор пробы крови у детей, проживающих в условиях химической контаминации. Затем выполняют клинико-лабораторные исследования крови на содержание вредных химических соединений. Далее у детей проводят ультразвуковое исследование селезенки для оценки ее эхоструктуры с использованием датчика частотой не менее 10 МГц. При наличии в ультразвуковом срезе селезенки гипоэхогенных однородных округлых включений размером 0,3-1,0 мм, расположенных на расстоянии 1,5-2 мм друг от друга, а также при одновременном превышении концентрации вредного химического соединения в крови по сравнению с его референтным значением диагностируют реактивные изменения специфического иммунитета у детей. Изобретение обеспечивает создание информативного, безопасного и точного способа ультразвуковой диагностики при одновременной простоте и доступности для широкого практического применения. 3 пр., 3 табл., 5 ил.

Способ определения рода возбудителей бактериемий // 2495939

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения рода возбудителей бактериемий. Изобретение может быть использовано в бактериологических лабораториях клиник для идентификации рода возбудителей бактериемии. Способ включает инкубацию пробы крови в питательной среде с последующим выявлением роста микроорганизмов в первичной гемокультуре. Проводят пробоподготовку исследуемого образца центрифугированием. Осуществляют количественный хромато-масс-спектрометрический анализ исследуемой пробы с определением маркерных молекул, в качестве которых используют молекулы свободных и замещенных высших жирных кислот из клеточных липидов микроорганизмов. Идентифицируют свободные и замещенные высшие жирные кислоты путем сравнения полученных данных с базой данных NIST хромато-масс-спектрометра. Определяют род возбудителей бактериемий с помощью таблицы. Предложенное изобретение позволяет обеспечить раннюю диагностику бактериемии. 5 ил., 1 табл., 5 пр.

Способ оценки содержания пероксида водорода в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата // 2497121

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть применено для определения содержания пероксида водорода (H2O2) в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата, в частности цисплатина. Способ осуществляют следующим образом: на опухолевые клетки, которые представляют собой клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, воздействуют цисплатином при его концентрации 1,85-3,85 мкг/мл. Измеряют внутриклеточное содержания H2O2 методом лазерной сканирующей микроскопии, определяя интенсивность сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм. Рассчитывают величину отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм (F488/F458), по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода. Для оценки содержания пероксида водорода в динамике осуществляют определение интенсивности сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм и расчет величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода, каждые 60 секунд в течение 30 минут. Способ позволяет выявлять место образования пероксида водорода в клетке, и на основе этого судить о механизмах токсического действия цисплатина на молекулярном уровне, а также позволяет исключить возможную погрешность оценки содержания пероксида водорода, обусловленную неспецифическим накоплением сенсора. 2 з.п. ф-лы, 3 пр., 1 ил.

Способ снижения предела обнаружения иммунохроматографических методов контроля содержания низкомолекулярных соединений // 2497126

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу снижения предела обнаружения иммунохроматографических методов контроля содержания низкомолекулярных соединений. Способ включает проведение в ходе движения реагентов вдоль иммунохроматографической тест-полоски конкурентного взаимодействия специфических антител с определяемым соединением (антигеном) в пробе и конъюгатом антиген-белок, иммобилизованным на поверхности рабочей мембраны тест-полоски. Выявляют окрашенные комплексы в результате иммобилизации коллоидного маркера в составе комплекса с конъюгатом антиген-белок. При этом первая стадия представляет собой конкурентное взаимодействие свободных специфических антител с антигеном в пробе и с иммобилизованным на поверхности рабочей мембраны конъюгатом антиген-белок. Вторая стадия представляет собой взаимодействие образовавшихся комплексов специфических антител и конъюгата антиген-белок с антивидовыми антителами, меченными коллоидным маркером. Предложенное изобретение позволяет уменьшить количество специфических антител на стадии конкурентного взаимодействия и благодаря этому снизить предел обнаружения. 5 ил., 1 пр.