Способ определения глюкозы, сахарозы, фруктозы
Владельцы патента RU 2492458:
Государственное научное учреждение Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства Россельхозакадемии (RU)
Изобретение относится к аналитической химии сахаров, в частности к способам определения глюкозы, сахарозы, фруктозы в сельскохозяйственном сырье и продукции переработки, и направлено на ускорение, совершенствование и повышение объективности количественного анализа сахаров. Указанный результат достигают тем, что способ предусматривает кратное разбавление пробы до суммарного содержания сахаров не более 10 г/дм3, центрифугирование, и выполнение анализа на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, при этом согласно изобретению для проведения анализа используют ведущий электролит, содержащий 4 г/дм3 сорбата калия, 8 г/дм3 10%-ного водного раствора цетил-триметил-аммоний-основания (ЦТА-ОН), 36 г/дм3 глицерина, 0,16 г/дм3 гидроокиси калия, при отрицательной полярности напряжения и длине волны детектирования 254 нм. 1 табл., 6 пр.
Изобретение относится к аналитической химии сахаров, в частности к способам определения глюкозы, сахарозы, фруктозы в сельскохозяйственном сырье и продукции переработки.
Современные способы количественного определения глюкозы, сахарозы, фруктозы основаны на ферментативных или хроматографических методах анализа.
Известен способ определения и эффективного разделения сахаров методом капиллярного электрофореза с использованием ведущего электролита с высоким значением рН, предусматривающий получение производных сахаров с помощью реагентов, молекулы которых содержат хромофорные ионогенные группы. [Y. Lee, T. - I. Lin. J. Chromatogr. В., 681, 87 (1996)]. Недостатки: высокое значение pH негативно сказывается на работоспособности кварцевого капилляра, и приводит к его быстрому выходу из строя; для определения сахаров необходимы дорогие специфические реагенты, содержащие хромофорные ионогенные группы, кроме того получение производных сахаров неизбежно приводит к ухудшению точности измерений.
Известен способ определения и эффективного разделения сахаров методом капиллярного электрофореза за счет изменения электрофоретической подвижности молекул сахаров путем получения комплексов с борат-ионом или ионами металлов [A. Bazanella, K. Bachmann. J. Chromatogr. A., 799, 283 (1998)]. Недостатки: необходимость получения производных сахаров в виде комплексов с борат-ионом или ионами металлов, что неизбежно приводит к ухудшению точности измерений.
Наиболее близким к заявляемому способу является определение глюкозы, фруктозы, сахарозы методом лигандообменного капиллярного электрофореза после перевода их в форму соответствующих комплексов с катионами двухвалентной меди. Использованы следующие условия разделения на системе капиллярного электрофореза: ведущий электролит - 175 мМ·(дм3)-1 аммиака, 1 мМ·(дм3)-1 двухвалентной меди; напряжение +25 кВ, длина волны детектирования - 245 нм, эффективная длина капилляра 0,5 м, внутренний диаметр 75 мкм [Алексеева, А.В. Определение сахаров методом лигандообменного капиллярного электрофореза / А.В. Алексеева, Л.А. Карцева, Н.В. Казачищева // Ж. Аналитической химии. - 2010. - Т.65. - №2. - С.205-211].
Недостатки: применение аммиака в составе ведущего электролита может служить причиной нестабильности условий анализа, так как содержание газообразного компонента (аммиака) в растворе слишком подвержено влиянию температуры окружающей среды, а высокое значение pH негативно сказывается на работоспособности кварцевого капилляра, и приводит к его быстрому выходу из строя. Использование солей меди нежелательно, так как в процессе электролиза для поверхности электродов будет выделяться медь. Специфичная длина волны детектора ограничивает применение более доступных систем капиллярного электрофореза, а необходимость получения производных сахаров с ионам меди неизбежно будет искажать результаты измерений в реальных пробах и не обеспечивать стабильность количественных результатов.
Задачей изобретения является эффективное разделение и определение глюкозы, сахарозы, фруктозы методом капиллярного электрофореза, обеспечение экспрессных и достоверных количественных результатов при минимальных затратах на выполнение анализа.
Техническим результатом при использовании предлагаемого изобретения является экспрессность и достоверность количественного определения глюкозы, сахарозы, фруктозы методом капиллярного электрофореза с применением нетоксичных и доступных реактивов для проведения анализа.
Технический результат достигают за счет того, что способ предусматривает кратное разбавление пробы до суммарного содержания сахаров не более 10 г/дм3, центрифугирование, и выполнение анализа на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, отличающийся тем, что в анализе используют ведущий электролит содержащий 4 г/дм3 сорбата калия, 8 г/дм3 10%-ного водного раствора цетил-триметил-аммоний-основания (ЦТА-ОН), 36 г/дм3 глицерина, 0,16 г/дм3 гидроокиси калия при отрицательной полярности напряжения и длине волны детектирования 254 нм.
Способ отличается тем, что, с целью повышения достоверности анализа используют раствор ведущего электролита, состоящий из сорбата калия, цетил-триметиламмоний-основания, глицерина и гидроокиси калия при отрицательной полярности напряжения.
Поставленная задача решается за счет того, что свойства ведущего электролита позволяют исключить из процесса анализа многостадийную пробоподготовку и необходимость лигандообразования молекул сахаров с ионами двухвалентной меди и исключение из анализа ведущего электролита, содержащего аммиак и ионы меди.
Преимущества заявляемого способа заключаются в использовании нетоксичных и доступных реактивов и систем капиллярного электрофореза, обеспечении объективности и достоверности анализа реальных проб, стабильности во времени раствора ведущего электролита, отсутствии гальванических процессов на поверхности рабочих электродов системы капиллярного электрофореза.
Использование предлагаемой совокупности существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, позволяет достичь желаемого технического результата - объективного и экспрессного определения массового содержания глюкозы; сахарозы и фруктозы как в градуировочных растворах, так и в реальных пробах. Примеры конкретного выполнения.
Пример 1
Пробу яблок измельчали в ступке или лабораторной мельнице до гомогенного состояния, с помощью лабораторного пресса получали 5-10 см3 яблочного сока, содержащий в основном фруктозу. Сок фильтровали и центрифугировали. Разбавляли пробу сока в 20 раз дистиллированной водой и подвергли анализу в следующих условиях. Система капиллярного электрофореза с источником питания отрицательной полярности, например, серии «Капель», оборудованная фотометрическим детектором с установленной длиной волны 254 нм, кварцевым капилляром внутренним диаметром 75 мкм, эффективной длиной 0,5 м; напряжение на капилляре «минус 16 кВ»; рекомендуемая температура термостатирования капилляра «+22°C»; ввод пробы - пневматический - 30 мбар в течение 5 секунд; время анализа - 20 мин. Используют раствор ведущего электролита следующего состава: 4 г/дм3 сорбата калия, 8 г/дм3 10%-ного водного раствора цетил-триметил-аммоний-основания (ЦТА-ОН), 36 г/дм3 глицерина, 0,16 г/дм3 гидроокиси калия. Срок хранения ведущего электролита не более суток. Ведущий электролит готовят в количестве, обеспечивающем потребности рабочего дня. Ориентировочное время миграции (выхода) глюкозы - 15 мин, сахарозы - 17 мин, фруктозы - 14 мин.
Контролем служило определение глюкозы, сахарозы, фруктозы, согласно способу-прототипу.
Пример 2
Аналогично примеру 1, кроме того, что прессованием получали из арбузов сок, содержащий глюкозу, сахарозу и фруктозу. Применяли разбавление 20 раз.
Пример 3.
Аналогично примеру 1, кроме того, что анализу подвергали натуральный пчелиный мед, содержащий около 70% сахаров (фруктоза и глюкоза), и применяли разбавление 100 раз.
Пример 4
Аналогично примеру 1, кроме того, что анализу подвергали полусухое красное вино.
Пример 5
Навеску виноградных листьев в количестве 1,00 грамма растирали в ступке при добавлении 9 см3 дистиллированной воды до гомогенного состояния. Затем массу настаивали в течение 1 часа, фильтровали, центрифугировали и подвергали анализу в условиях, аналогичных примеру 1.
Пример 6
Аналогично примеру 1, кроме того, что анализ проводили согласно способу-прототипа.
Полученные результаты, характеризующие способ определения глюкозы, сахарозы, фруктозы отражены в таблице.
| Таблица | ||||||
| Определение глюкозы, сахарозы, фруктозы в исследуемых объектах, г/дм3 | ||||||
| № примера | Предлагаемый способ | Согласно прототипу | ||||
| Глюкоза | Сахароза | Фруктоза | Глюкоза | Сахароза | Фруктоза | |
| 1 | 12,6 | 17,5 | 81 | 12 | 14,0 | 77 |
| 2 | 23,8 | 13,0 | 38,4 | 22 | 14 | 33,5 |
| 3 | 370 | 0 | 340 | 430 | 0 | 460 |
| 4 | 15,5 | 0 | 15,9 | 11 | 2 | 10,4 |
| 5 | 4,6 | 5,1 | 4,4 | 2 | 2,2 | 1,4 |
| 6 | 4,3 | 1,8 | 6,7 | 1,7 | 2,4 | 3,1 |
Анализ полученных результатов показал, что:
В случае анализа яблочного или арбузного сока занижение результатов определение сахаров согласно способу прототипа не превышает 10-15% в сравнении с результатами предлагаемого способа. В случае анализа объектов с более сложным составом - красное полусухое вино, вытяжка виноградного листа или лозы результаты согласно прототипу занижены на 50% и более. Ведущий электролит прототипа не способен устранить помехи в анализе сложных биологических объектов, так же как и в случае анализа продукции с высоким содержанием сахара - пчелиного меда. Искажение результатов определения глюкозы и фруктозы в меде согласно способу-прототипу связано с высокой кратностью разбавления пробы для проведения анализа составляющей тысячу раз, что негативно сказывается на качестве анализа.
Предлагаемый способ практически лишен данных недостатков - для корректного анализа требуется небольшая кратность разбавления сахаросодержащих проб, не сказывается влияние мешающих веществ биологической пробы - фенольных соединений, аминокислот, анионов, органических кислот, раствор ведущего электролита не содержит газообразной составляющей и катионов, способных участвовать в гальванических процессах.
При реализации способа получены количественные результаты анализа сахаров, превосходящие по своему качеству прототип.
Способ определения глюкозы, сахарозы, фруктозы, характеризующийся тем, что предусматривает кратное разбавление пробы до суммарного содержания сахаров не более 10 г/дм3, центрифугирование и выполнение анализа на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, отличающийся тем, что для анализа используют ведущий электролит, содержащий 4 г/дм3 сорбата калия, 8 г/дм3 10%-ного водного раствора цетил-триметил-аммоний-основания (ЦТА-ОН), 36 г/дм3 глицерина, 0,16 г/дм3 гидроокиси калия при отрицательной полярности напряжения и длине волны детектирования 254 нм.
