Способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов
Владельцы патента RU 2496149:
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)
Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии и микробиологии. Для оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов в организм контрольной и испытуемой групп беспородных разнополых белых 8-15-суточных мышей линии ICR массой 9-11 г вводят суспензию исследуемого препарата. Интраназальное заражение их проводят штаммом вируса оспы обезьян V79-1-005. Штамм депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером №V-309. Определяют концентрацию вируса в легких животных с последующим вычислением оценочных показателей (индексов), по величине которых судят о противовирусной активности препарата. Исследуемый препарат вводят в организм мышей за сутки до заражения, в день заражения и ежедневно в течение времени инкубации вируса в организме животного. Способ обеспечивает адекватную клиническим проявлениям у человека модель заболевания и эффективную оценку активности препаратов за счет создания условий наибольшей вирулентности вируса в организме выбранного для проведения эксперимента животного, имеющего наибольшее с человеком сходство первичных органов мишеней для вируса. 1 табл., 2 пр.
Изобретение относится к способу определения противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов с использованием штамма вируса оспы обезьян и может быть использовано в медицинской вирусологии и микробиологии.
При разработке и определении эффективности лечебных и профилактических препаратов против инфекционного заболевания для человека, на этапе проведения доклинических испытаний необходимо подобрать модельное животное таким образом, чтобы течение данного заболевания у него было адекватно заболеванию у человека. В связи с этим для выбора животного, моделирующего оспу обезьян у человека, необходимо провести изучение особенностей течения данного заболевания в его организме при инфицировании вирусом оспы обезьян. Учитывая тот факт, что клиническая картина оспы обезьян у человека чрезвычайно похожа на натуральную оспу, выбранный вид животных, как модель оспы обезьян, может быть также использован для оценки эффективности лечебных и профилактических препаратов против натуральной оспы. Оспа обезьян сохраняется в природе благодаря наличию природного резервуара, и случаи заболевания у людей в последние годы стали регистрироваться чаще. BOO может вызвать у человека заболевание с серьезными последствиями. [Parker S., Nuara A., Buller R.М., Schultz D.A. Human monkeypox: an emerging zoonotic disease // Future Microbiol., 2007, 2: 17-34].
Известны способы оценки эффективности лекарств и вакцин, в которых в качестве модели животных для изучения оспы обезьян использовались:
- нечеловекообразные приматы (в основном используются яванские макаки - либо Масаса irus, либо Масаса fascicularis, макака резус - Масаса mulatto);
- суслики (ground squirrel, Spermophilus tridecemlineatus);
- чернохвостые луговые собачки (the black-tailed prairie dog, Cynomys ludovicianus) и 4) африканские сони (African dormouse, Graphiurus kelleni) [Parker S., Handley L., Buller R. M. Therapeutic and prophylactic drugs to treat orthopoxvirus infections // Future Virol., 2008, 3: 595-612; TeshR. В., Watts D. M., SbranaE. etal. Experimental infection of ground squirrels (Spermophilus tridecemlinealus) with monkeypox virus // Emerg. Infect. Dis., 2004, 10: 1563-7; Hutson C.L., Olson V.A., Carroll D.S. et al. A prairie dog animal model of systemic orthopoxvirus disease using West African and Congo Basin strains of monkeypox virus // J. Gen. Virol., 2009, 90: 323-33; Schultz D.A., Sagartz J.E., Huso D.L., Buller R.M. Experimental infection of an African dormouse (Graphiurus kelleni) with monkeypox virus // Virology, 2009, 383: 86-92].
Однако, нечеловекообразные обезьяны - модель сложная, опасная с точки зрения биобезопасности и дорогая: работы с обезьянами требуют специальной подготовки и наличия навыков обращения с ними, биоэтические нормы обращения с животными более строгие, и работы с этим видом животных разрешены не во всех лабораториях. Суслики и чернохвостые луговые собачки живут в прерии, трудно приживаются в неволе и плохо размножаются, и потому для экспериментов должны всегда доставляться из естественной среды обитания. Вследствие этого, животные всегда имеют неизвестный статус здоровья, и, следовательно, условия эксперимента трудно стандартизовать. Африканские сони имеют много адаптационных характеристик, аналогичных лабораторным мышам: они легко могут содержаться в вивариях и размножаются в неволе. Тем не менее, биология их еще изучена не достаточно, и интерпретирование результатов экспериментов на этих животных все еще затруднено.
Известен способ оценки эффективности лекарств и вакцин, в которых в качестве модели животных для изучения оспы обезьян использовались 38 линий мышей 5-11 недельного возраста, которые были экспериментально заражены вирусом оспы обезьян. Гибель была зарегистрирована при интраназальном (и/н) заражении у мышей CAST/EiJ(WD), PERA/EiJ(WD) и MOLF/EiJ(WD). Для заражения была использована доза вируса 104 БОЕ/животное. При этой дозе 100% гибель была достигнута у мышей CAST/EiJ(WD). У мышей PERA/EiJ(WD) и MOLF/EiJ(WD) гибель при и/н инфицировании дозой вируса 104 БОЕ/животное была 75% и 40%, соответственно. Для мышей CAST/EiJ(WD) был определен показатель ЛД50, который составил 14 БОЕ/животное [Americo J.L., Moss В., Earl P.L. Identification of Wild-Derived Inbred Mouse Strains Highly Susceptible to Monkeypox Virus Infection for Use as Small Animal Models // J. Virol., 2010, Vol.84, No. 16, p.8172-8180].
Однако, в данном способе-аналоге из проверенных 38 линий мышей гибель была зарегистрирована только у мышей CAST/EiJ(WD), PERA/EiJ(WD) и MOLF/EiJ(WD), которые являются инбредными линиями, происходящими от диких мышей. Данные линии мышей пока плохо изучены с точки зрения их генетических особенностей, а также иммунитета. Отличительной чертой инбредных линий является их генетическая однородность, как у однояйцовых близнецов, в связи с этим в процессе множественного инбридинга данные виды мышей могли приобрести генетические особенности, которые обеспечивают чувствительность к вирусу оспы обезьян. Кроме этого, для этих мышей не исследованы клетки мишени, в которых размножается BOO, поэтому эта модель не может считаться адекватно воспроизводящей заболевание оспы обезьян, а результаты, полученные на этих животных, не могут считаться валидными.
Известен способ оценки противооспенной активности препаратов с использованием штамма MPXV-USA-2003-044 вируса оспы обезьян, который проверялся на возможность использования в качестве модели для исследования оспы обезьян [Hutson C.L., Abel J.A., Carroll D.S. et al. Comparison of West African and Congo Basin Monkeypox Viruses in BALB/c and C57BL/6 Mice // PLoS ONE | www.plosone.org 1, 2009, Vol.5, №1, e8912].
Однако, этот штамм входит в кладу западно-африканских штаммов BOO (West African MPXV), которые не только менее вирулентны для людей в сравнении с кладом центрально-африканских штаммов BOO (Congo Basin MPXV), но и менее вирулентны для мышей, что делает их использование для модели оспы обезьян менее приемлемым.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ оценки эффективности лекарств и вакцин, в которых в качестве модели животных для изучения оспы обезьян использовались белые мыши-сосунки. (13 линий 8-дневных белых мышей-сосунков), которые были экспериментально заражены вирусом оспы обезьян. Гибель была зарегистрирована при интраназальном (и/н) заражении у 3 линий мышей: SCID, C57B L/6 stat1-/- и 129 stat1-/-. [Stabenow J., Buller R.M., Schriewer J. et al. A Mouse Model of Lethal Infection for Evaluating Prophylactics and Therapeutics against Monkeypox Virus // J. Virol., 2010, Vol.84, No. 8, P.3909-20].
Однако, в способе-прототипе недостаточно адекватно оценивается активность препаратов против вируса оспы обезьян. В указанном способе были использованы мыши линий SCID, являющиеся иммунодефицитными. Линии C57B L/6 stat1-/- и 129 stat1-/- - дефектны по гену Stat1, который играет ключевую роль в сигнальных путях, обусловливающих синтез IFN-β. STAT белки - это семейство факторов транскрипции эукариот, которые участвуют в передаче сигнала от большого числа цитокинов и факторов роста, и дефектные хотя бы по одному из генов, кодирующих это семейство белков, мыши также не могут считаться вполне адекватной моделью инфекционного заболевания.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание способа оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов с использованием высоковирулентного штамма BOO и модели животных, позволяющих более адекватно оценить указанную противовирусную активность.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов, включающем введение в организм модельных животных мышей контрольной и испытуемой группы по заданной схеме суспензию исследуемого противовирусного препарата и интраназальное заражение их штаммом вируса оспы обезьян с последующей инкубацией вируса в организме животных и определением концентрации вируса в легких животных с последующим вычислением оценочных показателей (индексов), по величине которых судят о противовирусной активности препарата, причем для оценки лечебно-профилактического действия исследуемого препарата его вводят в организм мышей за сутки до заражения, в день заражения и ежедневно в течение времени инкубации вируса, согласно изобретения, в качестве модели мышей используют беспородные разнополые белые 8-15-суточные мыши линии ICR массой 9-11 г, а в качестве штамма вируса оспы обезьян используют штамм вируса оспы обезьян V79-1-005, депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером №V-309.
Обоснование изобретательского уровня заявляемого способа. В результате экспериментальных исследований получен высоковирулентный штамм V79-1-005 BOO путем пассирования исходного изолята на хорио-алантоисной оболочке развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ), патогенность которого изучена на разных моделях животных. В результате исследований было обнаружено, что наибольшую вирулентность штамм V79-1-005 BOO проявляет при заражении беспородных разнополых белых 8-15-суточных мышей аутбредной линии ICR (массой 9-11 г), обладающих генетической разнородностью вследствие чего обеспечивается более адекватная оценка эффективности лечебного и профилактического действия препаратов против BOO. Причем обнаружено сходство первичных органов-мишеней и входящих в их состав клеток для BOO у человека и мыши линии ICR, а также способность штамма V79-1-005 BOO эффективно размножаться в легких мышей линии ICR, вызывая, в т.ч., клинические признаки заболевания, позволяет использовать мышей линии ICR в качестве модельных животных для изучения эффективности лечебных и профилактических препаратов против оспы обезьян.
Характеристика используемого штамма BOO. Штамм V79-1-005 BOO получен путем пассирования выделенного изолята от человека в 1979 году. Штамм прошел 2 пассажа на хорио-алантоисной оболочке развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) и депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационным номером №V-309, дата регистрации май 2005 г.(справка о депонировании штамма прилагается).
Подлинность штамма. Подлинность штамма была подтверждена ПЦР и секвенированием. Штамм V79-1-005 BOO относится к кладе центрально-африканских штаммов BOO (Congo Basin MPXV).
Культуральные свойства. Штамм V79-1-005 BOO при культивировании на монослое клеток Vero вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-4 сут (температура культивирования 370С, в атмосфере 5% СО2). Максимальные титры вируса регистрировали на 4-6 сутки после заражения монослоя клеток Vero, их величина составляла 5,0×106 БОЕ/мл.
Продуктивность штамма. При культивировании на клетках Vero урожай вируса достигает биологической концентрации 5,0×106 бляшкообразующих единиц в мл (БОЕ/мл). Штамм вызывает заболевание у мышей при аэрозольном, интраназальном, подкожном заражении. Наблюдаются следующие видимые клиничекие признаки заболевания у мышей после их инфицирования: взъерошенность шерсти, снижение двигательной активности, блефарит и гнойный конъюнктивит.Штамм патогенен для мышей: при интраназальном заражении (ИД50=2,35 lg БОЕ) штамм размножается в легких у мышей, накапливаясь через 7 суток п/з до 4,5 1g БОЕ/лег.
Патогенность для человека. Вирус оспы обезьян относится к 1 группе патогенности по классификации МЗ РФ. Штамм V79-1-005 BOO является патогенным для человека: летальность составляет около 10%.
Патогенность для животных. Штамм V79-1-005 BOO является патогенным для обезьян: летальность составляет около 90%. Штамм V79-1-005 BOO вызывает нелетальную инфекцию у беспородных мышей: при аэрозольном заражении дозами более 0,85 1g БОЕ/легкое или при и/н заражении дозами более 2,35 1g БОЕ/легкое BOO эффективно размножается в альвеолоцитах мыши; при и/н заражении дозами BOO более 5,0 1g БОЕ/легкое у мышей регистрируются клинические проявления заболевания, а именно, взъерошенность шерсти, гнойный конъюнктивит и блефарит.
Для длительного хранения штамм лиофилизируют с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение 5 и более лет при температуре хранения -70°C.
Для размножения штамма используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ х 2АВК, среда 199, ДМЭМ, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.
Способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов осуществляют следующим образом
Формируют контрольную и испытуемую группы модельных животных. В качестве модельных животных используют беспородные разнополые белые 8-15-суточные мыши линии ICR массой 9-11 г., в организм которых вводят по заданной схеме суспензию исследуемого противовирусного препарата и осуществляют интраназальное заражение их субстанцией штамма вируса оспы обезьян, в качестве которого используют штамм вируса оспы обезьян V79-1-005, депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером №V-309. Для оценки лечебно-профилактического действия исследуемого препарата его вводят в организм мышей за сутки до заражения, в день заражения и ежедневно в течение времени инкубации вируса
Вирус инкубируют в организме животных и определяют концентрацию вируса в легких животных.
Эффективность противовирусных препаратов оценивают по определению следующих показателей:
- индекс резистентности (ИР), равный отношению показателей ИД50 для опытных (вакцинированных или леченных) и контрольных животных по формуле: ИР=ИД50(опыт) / ИД50(контроль).
- процент защиты от инфицирования (ПЗИ), который вычисляют по формуле: ПЗИ=% не инфицированных животных в опыте - % не инфицированных животных в контроле.
- индекс подавления накопления вируса (ИПНВ) в легких, который вычисляют по формуле: ИПНВ=количество вируса в легких контрольной группы животных / количество вируса в легких опытной группы животных.
Чем выше приведенные индексы, тем выше противооспенная активность исследуемого препарата.
Пример 1. Определение 50% инфицирующей дозы штамма V79-1-005 BOO для мышей линии ICR
Одним из наиболее достоверных показателей инфицирования животных является размножение вируса в клетках органов-мишеней. Размножение BOO в легких интраназально инфицированных мышей было подтверждено электронно-микроскопическими исследованиями и титрованием на культуре клеток Vero.
Электронно-микроскопическое исследование трахеи и бронхов мышей через 7 суток п/з выявило деструктивные изменения реснитчатых эпителиоцитов, в которых зачастую разрушается апикальная плазмалемма, наблюдается нарушение строения и слущивание ресничек. В эпителии воздухоносных путей отмечаются некрозы, в области которых локализуется клеточный детрит, форменные элементы крови и волокна фибрина. Обращает на себя внимание массивная инфильтрация респираторной ткани воспалительно-клеточными элементами, встречаются активированные макрофаги, которые содержат многочисленные псевдоподии и секреторные гранулы в цитоплазме. Морфологические признаки репродукции BOO отмечаются в клетках эпителиальной выстилки трахеи и бронхов, соединительной ткани собственной пластинки слизистой оболочки, в макрофагах и в эндотелиальных клетках сосудов подслизистой основы. Зоны некроза содержат многочисленные «обломки» зараженных клеток, не поддающиеся идентификации. На срезах инфицированных клеток прослеживаются последовательные стадии морфогенеза вируса: полумесяцы, сферические незрелые вирионы и зрелые вирусные частицы кирпичеобразной формы с центрально расположенным нуклеоидом двояковогнутой формы. Морфологические характеристики репродукции BOO в клетках легких мышей соответствуют таковым для ортопоксвирусов, описанных в литературе [Виноградов И.В., Кочнева Г.В., Малкова Е.М., Щелкунов С.Н., Рябчикова Е.И. Интраназальная инфекция у мышей, зараженных штаммом ЕР-2 вируса оспы коров, выделенным от слона. Вопросы вирусологии. 2005 г., Т. 4, стр.37-42; Martinez М. J., Bray М. P., Huggins J. W. A mouse model of aerosol-transmitted orthopoxviral disease: morphology of experimental aerosol-transmitted orthopoxviral disease in a cowpox virus - balb/c mouse system. Arch. Pathol. Lab. Med. 2000, Vol.124(3), pp.362-377]. Некротические изменения слизистой оболочки трахеи и бронхов распространяются до собственной пластинки слизистой. В целом, представленные экспериментальные данные соответствуют описанным патоморфологическим изменениям при и/н инфицировании ортопоксвирусами.
Таким образом, электронно-микроскопическим исследованием показано, что первичное размножение вируса у мышей и человека наблюдается в органах дыхательного тракта; виды первичных клеток-мишеней для BOO у мышей и морфологические характеристики его репродукции в клетках легких этих животных характерны для ортопоксвирусных инфекций. В литературе не представлено данных прямых исследований таких клеток при ортопоксвирусных инфекциях у людей. У лабораторных животных в экспериментах показано, что первичными клетками-мишенями у мышей для вирусов эктромелии [Kochneva G.V., Urmanov I.H., Ryabchikova E.I., Streltsov V.V., Serpintsky O.I. Fine mechanisms of ectromelia virus thymidine kinase-negative mutants avirulence. Virus Research. 1994, Vol.34, 1, pp.49-61] и оспы коров [Виноградов И.В., Кочнева Г.В., Малкова Е.М., Щелкунов С.Н., Рябчикова Е.И. Интраназальная инфекция у мышей, зараженных штаммом ЕР-2 вируса оспы коров, выделенным от слона. Вопросы вирусологии. 2005 г., Т. 4, стр.37-42; Martinez М.J., Bray М.P., Huggins J.W. A mouse model of aerosol-transmitted orthopoxviral disease: morphology of experimental aerosol-transmitted orthopoxviral disease in a cowpox virus - b alb/c mouse system. Arch. Pathol. Lab. Med. 2000, Vol.124 (3), pp.362-377] являются макрофаги. Для BOO при аэрозольном заражении обезьян первичными клетками-мишенями служат макрофаги и дендритные клетки [Zaucha G., Jahrling P., Geisbert Т., Swearengen J., Hensley L. The pathology of experimental aerosolized monkeypox virus infection in cynomolgus monkeys (macaca fascicularis). Lab Invest 2001. 2001, 81, pp.1581-1600]. Вирус оспы коров реплицируется в респираторном эпителии носа, поддерживающих и базальных клетках обонятельного эпителия, эпителии и гладкомышечных клетках бронхиол, фибробластах, перинейральных фибробластах, периостеальных фибробластах, сосудистых гладкомышечных клетках, макрофагах [Martinez М.J., Bray М.Р., Huggins J.W. A mouse model of aerosol-transmitted orthopoxviral disease: morphology of experimental aerosol-transmitted orthopoxviral disease in a cowpox virus - balb/c mouse system. Arch. Pathol. Lab. Med. 2000, Vol.124 (3), pp.362-377]. Аналогичный набор клеток-мишеней выявлен нами у мышей, инфицированных BOO.
Для определения показателя ИД50 была изучена динамика накопления вируса в легких у интраназально инфицированных мышей 5,0 1g БОЕ/ гол. штамма V79-1-005 BOO. В результате этого исследования было определено, что максимальное накопление вируса в этом органе у животных происходит через 7 суток п/з (более 4,5 1g БОЕ/лег.). После этого в прямых экспериментах по и/н заражению мышей линии ICR разными дозами BOO была определена ИД50 по накоплению вируса в легких через 7 суток п/з. С этой целью 5 групп мышей по 6 голов интраназально инфицировали пятью разными дозами штамма V79-1-005 BOO с десятикратным шагом: 1-5 1g БОЕ в объеме 30 мкл на каждую голову. В результате 1 ИД50 составила 2,35 1g БОЕ. Этот показатель (ИД50) оказался на 2,45 1g БОЕ ниже, чем полученный по данным вероятности появления внешних клинических признаков заболевания у мышей, инфицированных разными дозами BOO.
Таким образом, сходство первичных органов-мишеней и входящих в их состав клеток для BOO у человека и мыши линии ICR, а также способность штамма V79-1-005 BOO эффективно размножаться в легких мышей линии ICR, вызывая, в т.ч., клинические признаки заболевания, позволяет использовать мышей линии ICR в качестве модельных животных для изучения эффективности лечебных и профилактических препаратов против оспы обезьян и натуральной оспы.
Пример 2. Способ оценки противооспенной активности конкретных лечебно-профилактических препаратов НИОХ-14, НИОХ-32 и ST-246
В качестве штамма оспы обезьян использовали штамм V79-1-005 BOO, а в качестве модели животных использовали беспородных разнополых белых 8-15-суточных мышей линии ICR массой 9-11 г.В качестве препаратов для оценки их противооспенного лечебно-профилактического действия использовали препараты НИОХ-14 (патент РФ №2412160), НИОХ-32 (патент РФ №2412168) и ST-246 (заявка США №20060235051) являются химическими синтезированными соединения производные полициклических гидрированных функциональных производных изоиндола.
Оценку эффективности лечебно-профилактического действия препаратов (НИОХ-14, ST-246) проводили по вероятности накопления BOO в легких через 7 суток п/з, используя для интраназального инфицирования этих животных 10 ИД50 вируса в объеме 30 мкл на голову: 3,35 1g БОЕ.
Интраназальное инфицирование животных проводили с применением седативных средств. Животному, фиксированному на доске, прикладывают к носу кусочек ваты, смоченной эфиром или хлороформом. К заражению приступают после того, как у животного появится состояние легкого наркоза. Материал вводят с помощью шприца или автоматической пипетки в нос небольшими каплями на глубину 1,0-1,5 мм. Объем вводимого материала - 30-50 мкл. Чтобы не поранить слизистые оболочки, для введения материала берут абсолютно тупую иглу. Животных содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды согласно ветеринарному законодательству и в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях [Национальный научно-исследовательский совет, 1996].
Исследуемые противовирусные препараты в виде суспензии вводили перорально в соотвествии с лечебно-профилактической схемой: однократно в дозе 60 мкг/ г массы тела мыши за день до заражения, в день заражения и в течение 6 дней после заражения.
У интраназально зараженных штаммом V79-1-005 BOO определяют концентрацию вируса в легких и рассчитывают количество вируса, соответствующее одной 50% инфицирующей дозе (ИД50) для мыши. При проведении экспериментов по изучению специфической активности противовирусных (противооспенных) препаратов и эффективности вакцин в экспериментах in vivo на модели беспородных разнополых белых 8-15-суточных мышей ICR (массой 9-11 г), интраназально зараженных штаммом V79-1-005 BOO, эффективность препаратов оценивали по нескольким показателям.
Оценивали индекс резистентности (ИР), суть которого заключается в отношении показателей ИД50 для опытных (вакцинированных или леченных) и контрольных животных по формуле: ИР=ИД50(опыт) / ИД50(контроль).
Оценивали также процент защиты от инфицирования (ПЗИ), который вычисляли по формуле: ПЗИ=% не инфицированных животных в опыте - % не инфицированных животных в контроле.
Кроме того, проводили оценку индекса подавления накопления вируса (ИПНВ) в легких, который вычисляли по формуле: ИПНВ=количество вируса в легких контрольной группы животных / количество вируса в легких опытной группы животных.
Для суждения о значимости вычисляемых показателей (ИР, ИПНВ, ПЗИ) на 5% уровне надежности, предварительно проводили статистическое сравнение данных, полученных в ходе экспериментов, с использованием следующих статистических методов:
- показатели ИД50 для контроля и опыта сранивали при использовании метода Спирмена Кербера (Закс Л.Статистическое оценивание.);
- показатели долей инфицированных животных в контрольной и опытной группах сравнивали с использованием точного теста Фишера и X2 критерия (Закс Л. Статистическое оценивание.);
- сравнение уровней накопления вируса в легких у инраназально инфицированных мышей проводили при использовании непараметрического метода Манна Уитни (Закс Л. Статистическое оценивание.).
Результаты этих исследований представлены в таблице.
По данным, приведенным в таблице, видно, что концентрация вируса в легких мышей при введении препаратов ST-246, НИОХ-14 достоверно ниже, чем в контроле. Кроме того, показатели ИР мышей, ИПНВ в легких у мышей, а также ПЗИ мышей для 10 ИД50 BOO свидетельствуют о достоверной лечебно-профилактической эффективности исследуемых препаратов в отношении оспы обезьян у мышей (p<0,05).
| Результаты изучения эффективности лечебно-профилактической схемы применения препаратов по подавлению накопления вируса оспы обезьян в легких мышей на 7-е сутки после интраназального инфицирования 10 ИД50 | ||||
| Номер инфицированного BOO животного | Концентрация BOO в легких инфицированных мышей (1g БОЕ/лег.), которым перорально в лечебно-профилактической схеме вводили исследуемые препараты | |||
| НИОХ-14 (60 мкг/г) | НИОХ-32 (60 мкг/г) | ST-246 (60 мкг/г) | Контроль1 | |
| 1 | <1,70 | 3,52 | 3,00 | 4,90 |
| 2 | <1,70 | 4,90 | <1,70 | 4,90 |
| 3 | <1,70 | 3,64 | <1,70 | 4,90 |
| 4 | <1,70 | 4,90 | <1,70 | 4,90 |
| 5 | <1,70 | 4,90 | <1,70 | 4,60 |
| 6 | <1,70 | 4,90 | <1,70 | 4,90 |
| Средняя концентрация вируса в легких, lg БОЕ/лег., [М±I95]2 | 1,70±0,00* | 4,46±0,72 | 1,92±0,56* | 4,85±0,13 |
| ИПНВ в легких мышей, lg БОЕ/лег., Δ | >3,15 | 0,39 | 2,93 | |
| ПЗИ мышей вирусом, % | 100∗∗ | 0 | 83∗∗ | |
| ИР в lg | >1,5∗∗∗ | 0,0 | 1,3∗∗∗ |
Примечание:1 - контрольной группе мышей вводили перорально раствор метилцеллюлозы с твином - 80, который использовали для растворения препаратов НИОХ и ST-246; 2 - в случаях, когда в гомогенатах легких инфицированных BOO мышей титр вируса не был определен из-за существующего порога чувствительности метода титрования, с целью вычисления среднего значения тира вируса в легких у мышей из экспериментальных групп за титр вируса принимали минимально определяемую данным методом титрования концентрацию вируса (1,7 1g БОЕ/лег.); «М» -средняя величина концентрации вируса; «I95» - доверительный интервал для М с вероятностью 95%; ИПНВ - индекс подавления накопления вируса; ПЗИ - процент защиты от инфицирования мышей BOO; ИР - индекс резистентности мышей к инфицрованию BOO; »∗» - концентрация вируса в легких достоверно ниже, чем в контроле (р<0,05) «∗∗» - вероятность инфицирования животных в группе достоверно ниже чем в контроле (р<0,05) т.е. препарат достоверно защищает мышей от инфицирования 10 ИД50 BOO; ∗∗∗- препарат значимо повышает резистентность животных к 10 ИД50 BOO.
Было так же установлено, что НИОХ-32 незначительно снижал накопление вируса в легких и достоверно не отличался по этому признаку от контроля. Подобного рода эксперименты по оценки эффективности действия ST-246 на различных видах животных были проведены зарубежными исследователями. В их экспериментах также отмечался выраженный противовирусный эффект данного препарата [Jordan R., Goff A., Frimm A., Corrado М. L., Hensley L. Е., Byrd С.М. et al. ST-246 Antiviral Efficacy in a Nonhuman Primate Monkeypox Model: Determination of the Minimal Effective Dose and Human Dose Justification. J. Antimicrobial agents and chemotherapy 2009; 53 (5): 1817-1822; Stabenow J., Buller R.M., Schriewer J., West C, Sagartz J.E., Parker S.A Mouse Model of Lethal Infection for Evaluating Prophylactics and Therapeutics against Monkeypox Virus. J. Virology 2010; 84 (8): 3909-3920].
Таким образом, в рамках полученных результатов показано, что заявляемый способ может быть успешно использован для изучения активности противовирусных препаратов против оспы обезьян, а в качестве модельных животных могут быть использованы 8-15-суточные мыши линии ICR (массой 9-11 г).
Способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов, включающий введение в организм модельных животных мышей контрольной и испытуемой группы по заданной схеме суспензии исследуемого противовирусного препарата, интраназальное заражение их штаммом вируса оспы обезьян, инкубацию вируса в организме животных и определение концентрации вируса в легких животных с последующим вычислением оценочных показателей, по величине которых судят о противовирусной активности препарата, причем для оценки лечебно-профилактического действия исследуемого препарата его вводят в организм мышей за сутки до заражения, в день заражения и ежедневно в течение времени инкубации вируса, отличающийся тем, что в качестве модели мышей используют беспородных разнополых белых 8-15-суточных мышей линии ICR массой 9-11 г, а в качестве штамма вируса оспы обезьян используют штамм вируса оспы обезьян V79-1-005, депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером №V-309.
