Тест-система для обнаружения рнк вируса блютанга 14-го серотипа методом от-пцр в режиме реального времени

Авторы патента:

C12Q1/68 - использующие нуклеиновые кислоты

Владельцы патента RU 2499054:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Тест-система для обнаружения РНК вируса блютанга 14-го серотипа путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени включает олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'): 14/2/qf GCT GTC GGG TAT AGG TAG GA; 14/2/z FAM - GTG AAC GTG GGG TCA TCT TCA С - BHQ1; 14/2/qr ACG TGT CCG ATG CTG СТА TC. Данная тест-система обладает повышенной специфичностью и чувствительностью при сокращении времени проведения работы по определению серотипа вируса блютанга. 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для генодиагностики, а именно для идентификации вируса блютанга 14-го серотипа.

Блютанг - инфекционная, неконтагиозная вирусная болезнь широкого спектра домашних и диких жвачных, в настоящее время определенная МЭБ как значительная социально-экономическая проблема, создающая большие трудности для международной торговли животными и продуктами животноводства [1].

Заболевание вызывает вирус блютанга, который является одним из видов рода Orbivirus, семейства Reoviridae [2]. Геном вируса состоит из 10-ти сегментов дцРНК, упакованных в икосаэдрический нуклеокапсид, состоящий из семи структурных белков [3]. Внешний слой капсида представлен двумя белками VP2 и VP5, которые имеют высокую степень гетерологии аминокислотной последовательности, одинаково как между, так и внутри каждого серотипа [4]. Серотип вируса детерминирован VP2 белком, который имеет нейтрализующие эпитопы вируса [5].

В настоящее время известно о существовании 26-ти генетических вариантов вируса, 25 из которых в антигенном отношении представляют различные серотипы вируса. Данные молекулярной эпидемиологии говорят о высокой генетической гетерогенности его популяции, которая позволяет разделить вирусы на типы, топотипы, квазитипы. Уже известно более трехсот вариантов вируса, генетически отличающихся друг от друга.

С того момента как обнаружение ПЦР-продуктов стало основано на флюоресцентной интенсивности, это значительно увеличило производительность теста и снизило риск контаминации. В настоящее время широко применяются тесты, основанные на ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения отдельных серотипов, что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае дифференцировать серотип вируса [8; 9]. Все тест-системы были разработаны за рубежом, поэтому существенным недостатком служит их дороговизна и длительный срок поставки в нашу страну.

Целью настоящего изобретения является создание тест-системы для РНК обнаружения вируса блютанга 14-го серотипа в пробах биологического материала.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система для обнаружения генома вируса блютанга 14-го серотипа путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени включает олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):

14/2/qf GCT GTC GGG TAT AGG TAG GA

14/2/z FAM - GTG AAC GTG GGG TCA TCT TCA С - BHQ1

14/2/qr ACG TGT CCG ATG CTG СТА TC

Техническим результатом изобретения является возможность определения серотипа вируса блютанга с помощью ПЦР с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени, а также повышение специфичности и чувствительности, сокращение времени проведения работы по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных серотипспецифических олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зонда проводят ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющую выявить геном вируса блютанга 14-го серотипа. Использование данной методики позволяет повысить специфичность и чувствительность реакции.

В основе используемого способа - ПЦР в режиме реального времени, применение серотипспецифической системы олигонуклеотидов и технологии гибридизационных зондов TaqMan. Для детекции использовали зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента. Выбор и анализ серотипспецифических праймеров и зондов (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента референтных штаммов и изолятов 26 (1-26) серотипов вируса, опубликованных в GenBank. В качестве источника флуоресценции на 5' конце зонда применяли краситель FAM, а для тушения флуоресценции на 3' конце BHQ1.

Таблица 1
Серотипспецифические праймеры и ДНК-зонд для выявления генома вируса блютанга 14-го серотипа
ПЦР- мишень	праймер/ДНК-зонд	нуклеотидная последовательность 5'-3'	локализация (RSArrrr/14 ,AJ585135)
2 сегмент	14/2/qf	gCT gTC ggg TAT Agg TAg gA	854-873
2 сегмент	14/2/z	FAM - gTg AAC gTg ggg TCA TCT TCA С - BHQ1	967-988
14/2/qr	ACg TgT CCg ATg CTg СТА TC	1037-1056

Пример конкретного выполнения

Обнаружение РНК вируса блютанга 14-го серотипа в образцах биологического материала (кровь от инфицированных блютангом животных, культуральный материал вируса, лиофилизированный культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также в образцах интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов).

Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препараты полученных комплементарных ДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР в режиме реального времени (результаты представлены в таблице 2).

Проведение реакции обратной транскрипции

В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата РНК. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°С в течение 5 минут. Далее необходимо заморозить смесь после денатурации, поместив пробирки в штатив с хладагентом.

Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,5 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл (40 ед) MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки после денатурации вносят по 9,7 мкл смеси для обратной транскрипции. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 30 минут. После окончания реакции препарат кДНК используют для постановки ПЦР.

Проведение ПЦР в режиме реального времени

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 8 мкл смеси для ПЦР, 7 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл (1 ед) Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки объемом 0,2 см, на поверхность смеси вносят воск в объеме 15 мкл.

В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК.

Профиль реакции:

1. Удержание температуры 95°С - 3 мин

2. Циклирование 95°С - 10 с

60°С - 20 с

72°С - 15 с

Цикл повторить 5 раз

3. Циклирование с детекцией 2

95°С - 10 с

60°С - 20 с - Детекция

72°С - 15 с

Цикл повторить 40 раз

Флуоресценцию измеряют по каналу Green при температуре 60°С.

Учет и интерпретация результатов амплификации

Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне пороговой линией (Threshold), что соответствует наличию/отсутствию значения Q в соответствующей графе в таблице результатов. Результаты идентификации вируса блютанга 14-го серотипа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанной серотипспецифической системы олигонуклеотидов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты идентификации вируса блютанга 14-го серотипа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанной серотипспецифической системы олигонуклеотидов
№№ проб	Характеристика биоматериала	Результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени
1	культуральный вирус блютанга 1 серотип, RSArrrr/01 (A J5 8 5122) референтный штамм	-
2	культуральный вирус блютанга 2 серотип, RSArrrr/02 (AJ585123) референтный штамм	-
3	культуральный вирус блютанга 3 серотип, RSArrrr/03 (AJ585124) референтный штамм	-
4	культуральный вирус блютанга 4 серотип, RSArrrr/04 (AJ585125) референтный штамм	-
5	культуральный вирус блютанга 5 серотип, RSArrrr/05 (AJ585126) референтный штамм	-
6	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 6 серотип, RSArrrr/06 (AJ585127) референтный штамм	-
7	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 7 серотип, RSArrrr/07 (AJ585128) референтный штамм	-
8	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 8 серотип, RSArrrr/08 (AJ585129) референтный штамм	-
9	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 9 серотип, RSArrrr/09 (AJ585130) референтный штамм	-
10	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 10 серотип, RSArrrr/10 (AJ585131) референтный штамм	-
11	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 11 серотип, RSArrrr/11 (AJ585132) референтный штамм	-
12	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 12 серотип, RSArrrr/12 (AJ585133) референтный штамм	-
13	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 13 серотип, RSArrrr/13 (AJ585134) референтный штамм	-
14	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 14 серотип, RSArrrr/14 (AJ585135) референтный штамм	+
15	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 15 серотип, RSArrrr/15 (AJ5 85136) референтный штамм	-
16	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ5 8 513 7) референтный штамм	-
17	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 17 серотип, RSArrrr/17 (AJ5 85138) референтный штамм	-
18	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 18 серотип, RSArrrr/18 (AJ585139) референтный штамм	-
19	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 19 серотип, RSArrrr/19 (AJ585140) референтный штамм	-
20	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 20 серотип, RSArrrr/20 (A J5 8 5141) референтный штамм	-
21	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 21 серотип, RSArrrr/21 (AJ585142) референтный штамм	-
22	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (AJ585143) референтный штамм	-
23	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 23 серотип, RSArrrr/23 (AJ585144) референтный штамм	-
24	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 24 серотип, RSArrrr/24 (AJ585145) референтный штамм	-
25	культуральный вирус блютанга 26 серотип, KUW2010/02 (НМ590642)	-
26	кровь ягненка, экспериментально инфицированного вирусом блютанга 14-го серотипа, 90-е сутки после заражения	+
27	кровь крупного рогатого скота, инфицированного вирусом блютанга 14-го серотипа	+
28	интактная культура клеток Vero	-
29	интактная культура клеток ВНК-21	-
30	кровь от интактного животного (корова)	-
31	кровь от интактного животного (овца)	-
32	культуральный вирус ЭГБО, штамм «Нью-Джерси», 1 серотип	-

Таким образом, разработана тест-система, позволяющая с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием системы обнаруживать вирус блютанга 14-го серотипа.

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

высокая специфичность и чувствительность тест-системы для идентификации вируса блютанга 14-го серотипа с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности 2-го сегмента генома вируса блютанга 14-го серотипа;

- быстрота проведения анализа благодаря исключению ряда процедур, необходимых для регистрации продуктов амплификации в классической ПЦР;

- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;

- относительная дешевизна метода благодаря использованию ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации серотипа.

Источники информации

1. Clinical aspects linked with the emergence of bluetongue in cattle in northern Europe:

results of a two month longitudinal study/ C.Saegerman, A.Mauroy, H.Guyot// Renc. Rech. Ruminants.-2007.-Vol.l4.-P.215.

2. The dsRNA viruses/ P.P.C. Mertens// Virus Res. - 2004. -Vol.101. - P.3-13.

3. Bluetongue virus assembly and morphogenesis/ P. Roy, R. Noad// Curr Top Microbiol Immunol. - 2006. - Vol.309. - P.87-116.

4. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes / S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, H. Attoui, P.P.C. Mertens// J Gen Virol. - 2007. - Vol.88. - P. 621-630.

5. Assignment of the genome segments of Bluetongue Virus Type-1 to the proteins which they encode/ P. P. C. Mertens, F. Brown, D. V. Sangar// Virology. - 1984. - Vol.135. -P.207-217.

6. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two differ-ent genomic segments/ J. F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq// J. Virol. Methods. - 2007. -Vol.140. -P. 115-123.

7. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment I/ A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A.L. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens// Journal ofVirological Methods. - 2007. -Vol.145. -P. 115-126.

8. Emergence of Bluetongue Serotypes in Europe, Part 1 description and Validation of Four Real-Time RT-PCR Assays for the Serotyping of Bluetongue Viruses BTV-1, BTV-6, BTV-8 and BTV-11/ F. Vandenbussche, I. De Leeuw, E. Vandemeulebroucke and K. De Clercq// Transbound Emerg Dis. - 2009. - Vol,56(9-10). - P.346-54.

9. Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays Specifically Detecting Bluetongue Virus Serotypes 1, 6, and 8/ В. Hoffmann, M. Eschbaumer, and M. Beer// Journal of Clinical Microbiology. - 2009. - Vol.47. - P. 2992-2994.

Тест-система для обнаружения РНК вируса блютанга 14-го серотипа путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'):
14/2/qf GCT GTC GGG TAT AGG TAG GA
14/2/z FAM - GTG AAC GTG GGG TCA TCT TCA С - BHQ1
14/2/qr ACG TGT CCG ATG CTG СТА TC

Изобретение относится к способу скрининга веществ, способных влиять на процесс старения клетки путем использования нуклеосомных матриц. Способ включает в себя сборку нуклеосом из донорного хроматина с использованием очищенных препаратов гистонов Н2А, Н2В, Н3, Н4 натурального происхождения на ДНК-матрицах, где ДНК несет определенные мутации, ассоциированные с различными заболеваниями или со старением, активацию элонгации, внесение различных тестируемых агентов, способных стабилизировать или дестабилизировать компоненты матрицы, проведение транскрипции, оценку продуктов транскрипции.

Способ мультиплексного пцр-анализа и набор для его осуществления // 2496883

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ мультиплексного ПЦР-анализа и набор для его осуществления. Способ включает использование неблокированных прямых и обратных праймеров и гомологичных им блокированных прямых и обратных праймеров.

Способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного подвида средневекового и античного биоваров методом полимеразной цепной реакции // 2496882

Изобретение раскрывает дифференциацию штаммов возбудителя чумы основного подвида античного и средневекового биоваров. Определение проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Набор для многопрофильного иммунологического анализа антител в препаратах крови // 2495434

Изобретение относится к области медицины. Предложен набор для многопрофильного иммунологического анализа антител в препаратах крови.

Способ молекулярно-генетического типирования штаммов bordetella pertussis // 2495132

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу молекулярно-генетического типирования штаммов Bordetella pertussis. Способ включает выделение ДНК из штаммов B.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле.

Реагент и способ предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции, наборы реагентов и олигонуклеотидов для осуществления амплификации посредством полимеразной цепной реакции // 2495046

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к реагенту для предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), способу предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР-амплификация) и наборам, которые включают данный реагент.

Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, кассета экспрессии, клетка, продуцирующая биосенсор, выделенный флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор, оперативно слитая с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнал внутриклеточной локализации // 2493260

Изобретение относится к области молекулярной биологии и химии. Предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, а также соответствующая кассета экспрессии, клетка-продуцент биосенсора и выделенный флуоресцентный биосенсор.

Способы и композиции для иммунизации свиней против свиного цирковируса // 2493254

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие геномы двух новых штаммов свиного цирковируса типа 2В.

Способ оценки степени пролиферации клеток с помощью маркерных генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени // 2492244

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу оценки степени пролиферации лимфоцитов с помощью маркерных генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР РВ).

Способ анализа онкологических заболеваний молочной железы // 2492243

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к способу анализа онкологических заболеваний молочной железы, и может быть использовано в медицине. .

Способ получения терапевтического агента для лечения клещевого энцефалита // 2501862

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения терапевтического агента для лечения клещевого энцефалита людей. Способ включает получение аптамеров, которые способны образовывать комплекс с третичной структурой поверхностного белка вируса. Используют фрагмент поверхностного белка Е вируса клещевого энцефалита, с 50 по 250 аминокислоту от N-конца белка, ген которого амплифицируют и клонируют в плазмидном векторе. Клонированный рекомбинантный белок экспрессируют. Полученный белок очищают и иммобилизуют на планшете. Из первоначального пула вырожденных олигонуклеотидов состава 5'-CTCCTCTGACTGTAACCACG-(N40)-GGCTTCTGGCTACCTATGC-3', где N - любой из нуклеотидов (G, A, T, C), взятых в эквивалентном количестве при синтезе 40-звенных олигонуклеотидов, содержащих на 5'- конце флуоресцентный краситель FAM с помощью 15 циклов экспоненциального обогащения, SELEX, проводят отбор специфично связывающихся с вирусным белком аптамеров. На каждом этапе сорбции проводят денатурацию 25 рМ одноцепочечного олигонуклеотида. Наносят денатурированный пул аптамеров в лунку с иммобилизованным белком, инкубируют и отмывают от несвязавшихся олигонуклеотидов. Связанные с белком аптамеры снимают с поверхности буфером с низкой ионной силой и высоким pH. Пул аптамеров, после каждого этапа сорбции, амплифицируют. Полученные ампликоны двуцепочечной библиотеки аптамеров очищают и проводят реакцию ассиметричной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукт очищают с помощью сорбции с получением целевого продукта в виде аптамеров. Предложенное изобретение позволяет получить аптамеры, которые используют для предотвращения заболевания клещевым энцефалитом. 4 з.п. ф-лы, 1 пр.

Способы выявления воспалительного заболевания кишечника // 2502806

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложен способ выявления воспалительного заболевания кишечника млекопитающего посредством детекции повышенной экспрессии генов LY6 в желудочно-кишечных тканях или клетках по сравнению с контролем. Изобретение может быть использовано в медицине для диагностики воспалительных заболеваний кишечника. 3 н. и 52 з.п. ф-лы, 36 ил., 9 табл.

Способ оценки состояния гиперпролиферативных заболеваний шейки матки // 2503960

Изобретение относится к области медицины, в частности к применению молекулярных маркеров ВПЧ ВКР и их качественных и количественных характеристик для прогнозирования течения гиперпролиферативных заболеваний ШМ. Способ осуществляется поэтапно: 1) из соскобов из цервикального канала и биоптатов ШМ выделяют ДНК ВПЧ; 2) определяют генотип вируса; 3) отбирают пациенток с ВПЧ16-позитивной CIN; 4) методом ПНР в реальном времени определяют число копий ДНК вируса и степень интеграции ее в хозяйский геном (физический статус); 5) устанавливают пороговый уровень вирусной нагрузки с учетом физического статуса вируса (6,5 lg копий ДНК ВПЧ 16 на клетку); 6) классифицируют пациенток в зависимости от установленного порогового уровня вирусной нагрузки и физического статуса вируса (эписомальная или интегрированная форма); 7) выявляют пациенток с неблагоприятным прогнозом, имеющих высокую вирусную нагрузку (>6.5 lg копий ДНК на клетку) при эписомальной форме вируса или низкую нагрузку (<6.5 lg копий ДНК на клетку) при интегрированной форме вируса. Способ позволяет провести раннее прогнозирование неблагоприятного течения цервикальных интраэпителиальных неоплазий и возможного перехода их в рак ШМ. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 4 пр.

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации рнк коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом // 2504585

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для выявления генетического материала (РНК) коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом (ТОРС). Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного ДНК-зонда для идентификации коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом, содержит пару внутренних и один внешний олигонуклеотиды, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченный ДНК-зонд, имеющие следующую структуру: внешний обратный праймер NR: 5`-CTTTTGGCAATGTTGTK(G/T)CCTT-3`; внутренние прямой (F) и обратный (R) праймеры 5`→3` F: 5`-AAAATGTCTGATAATGGACCCC-3` и R: 5`-ACCACCACGAR(A/G)CTCGTCG-3`; флуоресцентно-меченный ДНК-зонд Z: 5`-TY(C/T)CACCAAATGTAATGCGGGG-3`. Набор праймеров и зонд позволяют идентифицировать коронавирус человека, ассоциированный с ТОРС, а также коронавирусы, подобные ТОРС-коронавирусу человека, выделенные от пальмовых циветт, енотовых собак и плодоядных летучих мышей методом ПЦР в реальном времени с получением более продолжительного амплифицированного фрагмента NP-гена коронавируса (513 п.н.). 2 ил., 5 табл., 2 пр.

Способы и композиции для диагностики остеоартрита у животного семейства кошачьих // 2504586

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыты способы, композиции и наборы для диагностики остеоартрита у животных семейства кошачьих. Способы по изобретению включают детектирование дифференциальной экспрессии, по меньшей мере, одного маркера в образце из организма, предпочтительно в образце крови, где биомаркер дифференциально экспрессируется при остеоартрите. 6 н. и 17 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 3 пр.

Способ выявления мутации с.-53-2а>g в гене престина (slc26a5), вызывающей развитие несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты // 2505608

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ выявления мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5, сопровождающийся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты. Способ включает выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Проводят полимеразную цепную реакцию с возможностью проведения анализа флуоресценции по конечной точке. Амплифицируют одновременно два участка гена SLC26A5 в смеси двух пар последовательностей олигонуклеотидов с флуоресцентной меткой: CACCACAAAGAAGAGATG, TCAGCATGATCCATAGTAC, FAM-agtgtCacTagGggaaaa-BHQ-1, VIC-agtgtCacCagGggaaaa-BHQ-2, фланкирующих область с возможным содержанием мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5. Предложенное изобретение позволяет получить точный, объективный клинический диагноз наследственной аутосомно-рецессивной потери слуха. 1 ил., 2 табл., 2 пр.

Композиции и способы гибридизации // 2505609

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложены способ, композиция и применение полярного апротонного растворителя с циклической основной структурой для гибридизации последовательностей нуклеиновых кислот. Изобретение может быть использовано в гибридизационных анализах. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 25 табл., 2 ил., 22 пр.

Соединения-диады, содержащие в молекуле азогруппы и ядра ферроцена, и их использование в качестве тушителей флуоресценции // 2506293

Изобретение относится к способу получения новых соединений-диад (I) с двумя разными, не сопряженными друг с другом, хромофорными фрагментами, содержащими азогруппы и остатки ферроцена, и их использованию для тушения флуоресценции флуорофоров. где Fc - ферроценил; R1 - Н или Fc; R2 - H или орто- или пара-гидрокси-; R3 - орто- или мета-, или пара-нитро-, или орто- или мета-, или пара-нитрофенилазо-, или пара-N,N-диметиламино-, или пара-карбокси-; L - группа пара-карбамоилвинилиденацетофенона или пара-карбоксамидовинилиденацетофенона, или пара-N-(2-карбамоилэтил)-карбоксамидовинилиденацетофенона, или пара-(4-[метиламино]бутокси)-винилиденацетофенона, или N,N-ди[4{1-(пара-винилиденацетофениламино)-метил-1,2,3-триазолил}бутил]аминогруппа. Способ получения (I) включает альдольно-кротоновую конденсацию ферроценальдегида с пара-замещенным ацетофеноном и взаимодействие полученного ферроценилиденацетофенона (2) с азосоединением, или введение в (2) реакционноспособных групп и азосочетание с диазосолью. Соединения-диады (I) имеют высокие коэффициенты молярной экстинкции, широкий спектр поглощения и электроактивность. Описан также способ тушения флуоресценции флуорофоров в двуцепочечных структурах нуклеиновых кислот с использованием (I). Показана эффективность (I) для тушения флуорофоров в растворе и в составе нуклеиновых кислот в широком спектральном диапазоне, что позволяет использовать (I) для мечения биологических макромолекул и создания олигонуклеотидных гибридизационных зондов для молекулярных методов диагностики. 2 н.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 8 пр.

Способ диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя и диагностический набор // 2506316

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу и диагностическому набору для диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя коклюша. Способ предусматривает осуществление полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и регистрацию продуктов амплификации с помощью гибридизации с флюоресцентными специфическими ДНК-зондами. Осуществляют полимеразную цепную реакцию с использованием ПЦР реакционной смеси, которая включает две пары праймеров, подходящих для амплификации фрагментов последовательностей IS481 и IS 1002, пару праймеров для амплификации последовательности, сформированной в результате инсерции IS481 и IS 1002 в cctagg сайт оперона bvgAS В.pertussis, два флуоресцентных зонда, специфичных к последовательностям IS481, IS 1002 и последовательностям, сформированным в результате инсерции IS481 и IS 1002 в cctagg сайт оперона bvgAS B.pertussis. Определяют количество бактериальных геномов в образце по наличию последовательностей IS481 и IS 1002 в хромосоме бактерий B.pertussis и определяют количество авирулентных мутантов возбудителя по наличию инсерции IS481 или IS 1002 в cctagg сайте оперона bvgAS B.pertussis. Диагностический набор содержит ПЦР-реакционную смесь, включающую две пары праймеров, подходящих для амплификации фрагментов последовательностей IS481 и IS 1002, пару праймеров для амплификации последовательности, сформированной в результате инсерции IS481 и IS 1002 в cctagg сайт оперона bvgAS, два флуоресцентных зонда, специфичных к последовательностям IS481, IS 1002 и последовательностям, сформированным в результате инсерции IS481 и IS 1002 в cctagg сайт оперона bvg. Предложенное изобретение позволяет диагностировать коклюш и определять авирулентные мутанты возбудителя коклюша. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ выявления кишечных вирусов в клинических образцах и воде методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления // 2506317

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской вирусологии, молекулярной биологии и эпидемиологии. Изобретение предназначено для выявления и идентификации в клинических образцах и элюатах, полученных в результате концентрирования из воды, одиннадцати групп кишечных вирусов (энтеровирусов (ЭВ), полиовирусов (ПВ), ротавирусов А и С (РВА и РВС соответственно), аденовирусов (АДВ), норовирусов (НВ), саповирусов (СВ), вирусов гепатита А и Е (ВГА и ВГЕ соответственно), астровирусов (АВ), ортореовирусов (ОРВ) в присутствии внутреннего положительного контроля (ВПК) посредством мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Данный подход позволяет усовершенствовать технику ПЦР-анализа для диагностики острых кишечных инфекций (ОКИ) и может найти применение в эпидемиологических службах для мониторинга эпидемиологической обстановки и быстрой расшифровки вспышек ОКИ. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 табл., 6 пр.