Способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1

Авторы патента:

Тюлькин Сергей Владимирович (RU)

Вафин Рамиль Ришадович (RU)

Валиуллина Эльвира Фанилевна (RU)

Муратова Александра Владимировна (RU)

Ахметов Тахир Мунавирович (RU)

Калашникова Любовь Александровна (RU)

C12Q1/68 - использующие нуклеиновые кислоты

C12N15/06 - клетки животных

Владельцы патента RU 2528743:

Вафин Рамиль Ришадович (RU)

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по DGAT1-гену на основе ПЦР-ПДРФ-анализа. Разработанный способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1, отличающийся от ближайшего прототипа [1] тем, что на этапе ПЦР используются другие последовательности олигонуклеотидных праймеров:

DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTCGAAGGTAACGC-3' (SEQ ID NO:1)

DGAT1-2: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' (SEQ ID NO:2)

DGAT1-3: 5'-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3' (SEQ ID NO:3),

а на этапе ПДРФ применяется другая эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип АА=82/18 bp, генотип КК=100 bp и генотип АК=100/82/18 bp (фиг.1 и 2). 2 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена DGAT1 (дкацилглицерол O-ацилтрансфераза 1) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.

Существуют различные способы проведения ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1.

Так, в способе, предложенном J. Komisarek (2008) [1], используются праймеры F: 5^/-TGCCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCC-3^/ и R: 5^/-ACCTGGAGCTGGGTGAGGAACAGC-3^/, инициирующие амплификацию локуса DGAT1-гена длиной 378 bp, с последующим его эндонуклеазным расщеплением рестриктазой BglI для генерации и интерпретации образующихся генотип-специфичных фрагментов (генотип AA=254/96/28 bp, генотип KK=282/96 bp и генотип AK=282/254/96/28 bp).

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по гену DGAT1 на основе ПЦР-ПДРФ-анализа.

Нами разработан способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, отличающийся от ближайшего прототипа [1] тем, что на этапе ПЦР используются праймеры:

а на этапе ПДРФ применяется эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип AA=82/18 bp, генотип KK=100 bp и генотип AK=100/82/18 bp (фиг.1 и 2).

Условия проведения реакции

Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-Na2, осуществлялась сорбционным способом («ДНК-сорб Б», ЦНИИЭМ, Россия).

ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколу, представленному в табл.1.

Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ осуществляли методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере ТВЕ (pH 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ=310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации искомых генотипов (AA, KK, AK) ввиду корректной интерпретации генерируемых генотип-специфичных фрагментов (AA=82/18 bp, KK=100 bp и AK=100/82/18 bp), где ПЦР-ПДРФ-фрагменты с длинами 100 bp и 82 bp являются идентификационными, а минорный ПДРФ-фрагмент длиной 18 bp - неинформативным, из-за его малого размера, что существенно не снижает точность ДНК-анализа.

Источники информации

1. Komisarek, J.A relationship between DGAT1 K232A polymporphism and selected reproductive traits in Polish Holstein-Friesian cattle / J. Komisarek, A, Michalak // Animal Science Papers and Reports. - 2008. - V.26. - N.2. - P.89-95.

Таблица 1
Протокол ПЦР-ПДРФ для генотипирования кр.рог.ск. по аллелям A и K гена DGAT1
Протокол ПЦР
Реагенты	Исходная кон центрация	Рабочая концентрация	1 проба (мкл)	10 проб (мкл)
dH₂O			13.4	134
ДМСО	100%	5%	1	10
dNTP	2,5 мМ	0,25 мМ	2	20
Буфер	10×	1×	2	20
Таq ДНК Полимераза	5 ед	1 ед	0,2	2
SEQ ID NO: 1	50 мкМ	0,25 мкМ	0,1	1
SEQ ID NO: 2	50 мкМ	0,25 мкМ	0,1	1
SEQ ID NO: 3	50 мкМ	0,5 мкМ	0,2	2
Проба ДНК			1
ВСЕГО			20

Праймеры:

Режим амплификации

×1:94°C - 4 мин

×40:94°C - 10 сек, 72°C - 10 сек

×1:72°C - 5 мин

ХРАНЕНИЕ +10°C

ПЦР-продукт = 100 bp

Протокол ПДРФ

Реагенты	Исходная концентрация	Рабочая концентрация	1 проба	10 проб
dH₂O			1,25	12,5
BSA	10 мг/мл	0,1 мг/мл	0,25	2,5
SE-буфер Y	10×	1×	2,5	25
TaqI	20 U	20 U	1	10
ПЦР-проба			20
ВСЕГО			25

Инкубация при 65°C в течение ночи

ПЦР-ПДФР-фрагменты:

Генотип AA=82/18 bp

Генотип KK=100 bp

Генотип AK=100/82/18 bp

Электрофорез в 3% агарозе

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг.1 - Фланкируемые участки праймеров, используемые для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1 предложенным способом проведения ПЦР-ПДРФ.

Пояснение к фиг.2 - Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1.

Обозначения:

M) ДНК-маркеры 100 bp+50 bp (СибЭнзим).

1-4, 6, 8-11, 13, 15, 17-18) генотип АК гена DGAT1 кр.рог.ск.

5, 16) генотип AA гена DGAT1 кр.рог.ск.

7, 12. 14) генотип КК гена DGAT1 кр.рог.ск.

Способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, отличающийся тем, что на этапе ПЦР используются праймеры:

а на этапе ПДРФ применяется эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип AA=82/18 bp, генотип KK=100 bp и генотип AK=100/82/18 bp.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к набору синтетических олигонуклеотидных пар праймеров, и может быть использовано в судебно-медицинской идентификационной экспертизе.

Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления // 2528247

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину (IC50), а также набор для осуществления данного способа.

Биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител // 2528099

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике. Предложен биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител в сыворотке крови человека, содержащий массив дискретно нанесенных и иммобилизованных на поверхности подложки O-антигенов V.

Набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования its1-5.8s-its2 сосудистых растений // 2528063

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для амплификации и последующего секвенирования ITS1-5.8S-ITS2 сосудистых растений, включающего проведение полимеразой цепной реакции с помощью универсальных праймеров со следующим нуклеотидным составом: primer ITS-for CGTAACAAGGTTTCCGTAG, primer ITS-rew GGAATCCTTGTAAGTTTCTTT.

Способ и набор для детекции микроорганизмов // 2527897

Группа изобретений относится к области микробиологии и биотехнологии. Способ детекции живых клеток микроорганизма в тестируемом образце путем отличия живых клеток от мертвых клеток или поврежденных клеток предусматривает добавление в тестируемый образец средства, способного к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм; облучение тестируемого образца; амплификацию мишеневой области ДНК или РНК микроорганизма, содержащегося в тестируемом образце, способом амплификации нуклеиновых кислот в присутствии средства подавления действия вещества, ингибирующего амплификацию нуклеиновых кислот, соли магния, соли органической кислоты или соли фосфорной кислоты, без выделения нуклеиновых кислот из клеток и анализа продукта амплификации.

Синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов и изолятов бактерии pasteurella multocida серогруппы а у крупного рогатого скота и способ их применения // 2527153

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы A у крупного рогатого скота и способ их применения.

Способ видовой и штаммовой идентификации бифидобактерий филотипа bifidobacterium longum // 2527069

Изобретение относится к области биотехнологии и касается видовой и штаммовой идентификации бифидобактерий филотипа Bifidobacterium longum. Представленный способ основан на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин суперсемейства RelBE и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора видо- и штаммоспецифичных олигонуклеотидов, ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, а размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера.

Фармакодинамические маркеры, индуцированные интерфероном альфа // 2527068

Изобретение относится к иммунологии. Предложены варианты применения вариантов набора генов (фармакодинамических (ФД) маркеров) с повышенной регуляцией экспрессии или действия, индуцируемых интерфероном альфа (ИФНα).

Способ идентификации лактобацилл // 2526576

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа идентификации лактобацилл. Представленный способ основан на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин суперсемейств RelBE и MazEF и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию геномных ДНК с использованием набора олегонуклеотидов определенной структуры, ПЦР-продукты анализируют в агарозном геле, а размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера.

Набор синтетических олигонуклеитидов для выявления видовой принадлежности родиолы четырехнадрезной (rhodiola quadrifida (pall.) fisch. et mey.) // 2526499

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности родиолы четырехнадрезной {Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch.

Экспрессионная генетическая конструкция poptivec/f8bdd, кодирующая рекомбинантный фактор свертываемости крови viii человека с делецией в-домена, и клеточная линия dg-ov-f8bdd-18, продуцирующая рекомбинантный фактор свертываемости крови viii человека с делецией в-домена // 2429294

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII, и может быть использовано в медицине. .

Способ создания трансгенных линий клеток млекопитающего со стабильным и высоким уровнем экспрессии трансгенного белка // 2425882

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Способ селекции клеток in vivo с помощью лизомустина // 2425149

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано для селекции генетически модифицированных клеток. .

Способ снятия барьера гистонесовместимости при ксеногенной клеточной терапии // 2308278

Изобретение относится к клеточной инженерии, медицине, в частности к способам преодоления барьера гистонесовместимости при клеточной терапии. .

Гибридная клеточная линия (варианты), препарат антител (варианты), способ диагностики рассеянного склероза у человека (варианты), способ лечения человека, полипептид // 2137131

Изобретение относится к медицине, точнее к нейроиммунологии, а именно к тесту на антигены, ассоциированные с рассеянным склерозом. .

Способ повышения продукции протеина с (варианты) // 2110574

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам продуцирования высоких уровней функционального рекомбинантного протеина C в клеточных линиях млекопитающих.

Способ введения чужеродной днк в сперматозоиды // 2081914

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано для получения трансформированных сперматозоидов. .

Способ слияния клеток // 2032746

Изобретение относится к биологии, в частности к биотехнологии, и может быть использован для получения гибридных клеток. .

Способ получения рекомбинантной плазмидной днк рсдус 2.27, кодирующей гликопротеин межклеточной адгезии // 1809837

Экспрессионный плазмидный вектор моноцистронной экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, линия клеток млекопитающих-продуцентов рекомбинантного белка, способ получения рекомбинантного белка // 2552170

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Предложен экспрессионный плазмидный вектор для моноцистронной гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков в клетках яичника китайского хомячка (СНО), обладающий свойством высокочастотной интеграции экспрессионной кассеты в указанных клетках, в следующей последовательности содержащий область начала репликации плазмиды pUC с функциональным геном устойчивости к ампициллину; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR); функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5′ нетранслируемой областью этого гена; участок для клонирования открытой рамки считывания рекомбинантного белка (полилинкер); функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3′ нетранслируемой областью этого гена; промотор, функционирующий в клетках млекопитающих; ген устойчивости к антибиотику; и функциональный терминатор гена устойчивости к антибиотику. Также предложена линия клеток - продуцентов рекомбинантного белка и способ получения рекомбинантного белка с использованием указанных клеток. Изобретение позволяет увеличить стабильность и продуктивность систем экспрессии рекомбинантных белков. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 табл., 8 пр.

Гуманизированные моноклональные антитела к сеа с созревшей аффинностью // 2570554

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антигенсвязывающей молекуле (АСМ), которая специфически связывает связанный с мембраной человеческий карциноэмбриональный антиген (CEA). Также раскрыты полинуклеотид, кодирующий АСМ, вектор для экспрессии закодированной АСМ, клетка-хозяин для экспрессии АСМ и композиция для лечения рака, для которого характерна аномальная экспрессия CEA. Раскрыты способ индукции клеточного лизиса опухолевой ткани, способ диагностики заболевания, способ увеличения времени выживания, способ индукции регресса опухоли, способ лечения и способ ингибирования опосредуемой CEA клеточной адгезии опухолевой клетки. Изобретение обладает способностью специфически связывать связанный с мембраной человеческий карциноэмбриональный антиген (CEA), что позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с экспрессией полипептида CEA. 12 н. и 19 з.п. ф-лы, 16 ил., 11 табл., 2 пр.