Способ обнаружения микроорганизма вида vibrio parahaemolyticus

Авторы патента:

Кудрякова Татьяна Александровна (RU)

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

C12R1/63 - Схема кодирования для подклассов C12C-C12Q или C12S, относящаяся к микроорганизмам

C12N7/00 - Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их (лекарственные препараты, содержащие вирусы A61K 35/76; получение лекарственных составов, содержащих вирусные антигены или антитела, например вакцин из вирусов A61K 39/00)

Владельцы патента RU 2531236:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Представленное изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа обнаружения микроорганизма вида Vibrio parahaemolyticus. Способ включает посев исследуемого штамма на газон культуры, нанесение капли диагностического препарата фага в центр чашки, выдерживание при температуре 37°С в течение 20-24 часов и подтверждение его принадлежности к микроорганизмам вида V. parahaemolyticus по присутствию лизиса. При этом диагностический препарат фага готовят путем смешивания фагов ФК-44 и ФК-46, приготовленных на основе штамма Vibrio parahaemolyticus КМ-97, в соотношении 1:1 в титре n·10⁸БОЕ/мл. Представленное изобретение позволяет ускорить идентификацию штаммов V. parahaemolyticus и может быть использовано в лабораторной диагностике острых кишечных инфекций, вызываемых этим микроорганизмом.1 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности, лабораторной диагностике острых кишечных заболеваний, вызываемых Vibrio parahaemolyticus.

В настоящее время в лабораторной диагностике большинства бактериальных кишечных инфекций используются специфические бактериофаги, позволяющие идентифицировать выделенные микробные штаммы с высокой степенью достоверности.

В связи с возрастающей заболеваемостью пищевыми отравлениями, обусловленными Vibrio parahaemolyticus, значение фагодиагностики галофильных микроорганизмов усиливается и актуально в осуществлении поиска новых, простых и эффективных методов их детекции, так как позволяет выделить специфические свойства определенного вида вибрионов при взаимодействии с фагами, осуществить дифференциацию от микроорганизмов близкородственных родов, семейств, а отсутствие специфического препарата фага для диагностики Vibrio parahaemolyticus снижает эффективность противоэпидемических и лечебно-профилактических мероприятий. Известны способы диагностики заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами (см. Методические указания МУК 4.2.1793-03, Москва, 2004 г. стр.23), заключающиеся в серологическом типировании парагемолитических вибрионов, которое проводят по схеме. Набор агглютинирующих О и К-сывороток для серологического типирования на стекле выпускает японская фирма Toschiba Kazaki Co. Ltd.

Недостатком такого способа является то, что проведение серологического типирования является трудоемким процессом, так как для каждого серотипируемого штамма необходима индивидуальная агглютинирующая сыворотка, а это обстоятельство значительно увеличивает время проведения одного лабораторного анализа и, кроме того, агглютинирующие сыворотки (Япония), недоступны и дорогостоящи.

За прототип выбран способ фагодиагностики парагемолитических вибрионов серотипа O5:К15 (см. а.с. СССР №1671690, кл. С12 №7/00, 23.08.91 г.), заключающийся в том, что используют штамм фага V. parahaemolytici Ф-139, который размножают с помощью метода Грациа на щелочных средах, содержащих 3% NaCl, и индикаторной культуре, внесенной в агар.

Однако использовать фаг Ф-139 для идентификации V. parahaemolyticus других О и К-сероваров не представляется возможным из-за ограниченных литических свойств фага в пределах штаммов серогруппы O5:К15 V. parahaemolyticus.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке эффективного способа, позволяющего ускорять идентификацию штаммов V. parahaemolyticus различных сероваров, расширяя спектр его действия.

Поставленная задача достигается тем, что в способе обнаружения микроорганизмов вида Vibrio parahaemolyticus, включающем использование индикаторного штамма с последующим лизированием исследуемой культуры фагом, в качестве индикаторного штамма используют Vibrio parahaemolyticus KM-97, из которого перед применением готовят путем смешивания 1,0 мл фага ФК-44 и 1,0 мл фага ФК-46 в соотношении 1:1, в титре n·10⁸ БОЕ/мл, затем проводят посев исследуемого штамма на газон культуры и наносят каплю полученного диагностического препарата фага в центр чашки, посевы выдерживают при температуре 37°C в течение 20-24 часов и по присутствию лизиса фагом исследуемого штамма подтверждают его принадлежность к микроорганизмам вида V. parahaemolyticus.

При этом газон культуры исследуемого штамма готовят с предварительным выращиванием последнего в термостате в течение 4-х часов при 37°C после посева в бульон Мартена с 3% NaCl, затем 0,3 мл выросшей культуры вносят в 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°C 0,7% агара Мартена с 3% NaCl и выливают его вторым слоем на пластинку агара Мартена с 3% NaCl в чашки Петри, посев подсушивают с последующим нанесением препарата фага.

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения способа используют: индикаторный штамм Р-14706, депонированный в ГКПБ «Микроб» г. Саратов, под номером КМ-97, фаг 1154 Vibrio parahaemolyticus, фаг 3256 Vibrio parahaemolyticus.

Фаг 1154 Vibrio parahaemolyticus депонирован и хранится под номером ФК-44 (1154) в коллекции лаборатории бактериофагов ФКУЗ Рост НИПЧИ. При электронно-микроскопическом изучении фаг характеризуется III морфогруппой по классификации А.С. Тихоненко. По серологическим свойствам фаг ФК-44 принадлежит к III серотипу. Диапазон литической активности распространяется на 80,4% штаммов Vibrio parahaemolyticus различных О-сероваров.

Фаг 3256 Vibrio parahaemolyticus депонирован под номером ФК-46 (3256) и хранится в коллекции лаборатории бактериофагов ФКУЗ Рост НИПЧИ. При электронно-микроскопическом изучении установлено, что фаг относится к IV морфологической группе по классификации А.С. Тихоненко. Результаты изучения серологических свойств показали его принадлежность к IV серотипу фагов парагемолитических вибрионов. Важной особенностью фага является специфичность логического действия в отношении 60,1% штаммов V. parahaemolyticus различных О-сероваров.

Для размножения бактериофагов ФК-44 (1154) и ФК-46 (3256) используют индикаторный штамм Vibrio parahaemolyticus КМ-97 (Р-14706). Фаги ФК-44 и ФК-46 сохраняют в ампулах, срок хранения 1 год. Титр фагов составляет n·10⁸-10⁹ БОЕ/мл.

Препарат фага (ДИФ) получают перед непосредственным его использованием для высокой сохранности активных частиц фагов. Готовят бивалентную смесь фагов ФК-44 и ФК-46 в соотношении 1:1 в титре n·10⁸ БОЕ/мл, берут 1,0 мл фага ФК-44 и 1,0 мл фага ФК-46, которые соединяют в пробирке и препарат ДИФ готов к использованию.

Следующим этапом готовят газон культуры исследуемого штамма, который может быть выделен от больного, из пищевых продуктов, пробы воды, рыбы, гидробионтов. По методу Грациа газон выполняют двухслойным. Нижний слой представляет агаровую среду pH 7,6 с добавлением 3% NaCl. Верхний слой получают из 4,0 мл исследуемой пробы, которую выращивают в бульоне Мартена с 3% NaCl при 37°C в течение четырех часов, затем 0,3 мл выросшей культуры вносят в 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°C 0,7% агара Мартена с 3% NaCl и выливают вторым слоем на пластинки агара в чашках Петри. После застывания агар подсушивают. Затем препарат ДИФ наносят каплей в виде дорожки на газон исследуемой культуры и инкубируют при 37°C в течение 20-24 часов.

Учет результатов, а именно идентификацию Vibrio parahaemolyticus, проводят по наличию зоны фаголизиса на выросшей культуре. Прозрачная зона лизиса подтверждает присутствие V. parahaemolyticus, а его отсутствие исключает принадлежность к этому виду микроба.

Пример 1, подтверждающий специфичность действия фага ДИФ в отношении вибрионов и других близкородственных организмов.

При создании препарата ДИФ были выбраны 9 различных типов фагов с учетом их биологических особенностей (фаги 109, 123, 154, 616, 124, 175, 227, 1154, 3256). Диапазон действия этих фагов (по лизису штаммов) составил от 7,0 до 34,7%. Затем комбинируют 3 варианта смесей: 1) 1154+3256; 2) 1154+227; 3) 3256+154. Проводят испытания этих смесей на 184 штаммах парагемолитических вибрионов различных серотипов (см. таблицу 1). Первая смесь лизировала 92,5% изученных штаммов, вторая - 72,09%; третья - 41,39%. Из таблицы видно, что первый вариант смеси, препарат фага ДИФ, обладает высоким специфическим действием в отношении вибрионов и других близкородственных организмов. Титр фага составил n·10⁸ БОЕ/мл.

Фаг ДИФ лизирует 92,5% штаммов Vibrio parahaemolyticus и не оказывает литического действия в отношении бактерий семейств Vibrionaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae.

Пример 2. Использование препарата фага ДИФ для идентификации V. parahaemolyticus.

Из испражнений больного (48 лет) с признаками пищевой токсикоинфекции выделяют культуру, подозрительную по морфологическим признакам на V. parahaemolyticus. Фагодиагностику этой культуры проводят следующим образом: первоначально исследуемую культуру в количестве 4,0 мл выращивают в бульоне Мартена с 3% NaCl в течение 4-х часов при 37°C. После этого 0,3 мл выросшей культуры смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°C 0,7% агара Мартена с 3% NaCl и выливают вторым слоем на пластину застывшего 1,5% агара Мартена (pH 7,6) с 3% NaCl в чашки Петри. После застывания агар подсушивают и в центр чашки наносят пипеткой каплю фага ДИФ. Посевы оставляют при 37°C на 20-24 часа и на месте нанесения фага ДИФ обнаруживают зону просветления. В результате исследуемую культуру классифицируют как V. parahaemolyticus.

Пример 3. Культуру, выделенную из проб морской воды (проба из воды Черного моря по мониторингу на вибриофлору, август 2012 года), подозрительную на V. parahaemolyticus, изучали по методике, описанной в примере 1. После лизирования исследуемой культуры фагом ДИФ в течение суток диагностировали присутствие в пробах галофильных вибрионов V. parahaemolyticus.

Использование предложенного способа позволяет эффективно применять его в лабораторной диагностике, так как выраженная чувствительность к фагу ДИФ у Vibrio parahaemolyticus, условия выращивания в присутствии NaCl в среде позволяет использовать его в качестве дополнительного теста дифференциации возбудителей пищевой токсикоинфекции, гастроэнтеритов, который может быть применен в лабораторной диагностике для того, чтобы:

- использовать при проведении эпиданализа острых кишечных заболеваний с пищевыми токсикоинфекциями;

- применять в лабораторной диагностике штаммов V. parahaemolyticus, выделенных от больных и из внешней среды (из морской воды, гидробионтов и др.);

- проводить типирование фагом ДИФ штаммов V. parahaemolyticus различных К и О-сероваров;

- дифференцировать фагочувствительные штаммы V. parahaemolyticus от резистентных к фагу бактерий;

- экономичность и простота выполнения анализа, ускоренное получение результатов, доступность любой лаборатории позволяют рекомендовать ДИФ для широкого применения, особенно при массовых исследованиях и чрезвычайных эпидемиологических обстоятельствах. При этом эффективность диагностических мероприятий может быть существенно повышена за счет использования диагностического фага.

Таблица
Семейство	Род	Вид	Кол-во штаммов	Из них чувствительны к ДИФ (%)
Vibrionaceae	Vibrio	V. parahaemolyticus	184	92,5
		V. cholerae cholerae	56	0
		V. cholerae eltor	252	0
		V. cholerae non O1/non O139	57	0
		V. cholerae O139	36	0
		V. metschnikovii	7	0
		V. mimicus	5	0
		V. fluvialis	1	0
		V. vulnificus	4	0
		V. furnissii	5	0
		V. diazotrophicus	2	0
		V. splendidus	2	0
		V. cambellii	2	0
		V. pelagius	1	0
		V. orientalis	1	0
Aeromonas		13	0
Pseudomonadaceae	Pseudomonas		19	0
Enterobacteriaceae	Escherihia		5	0
	Schigella		5	0
	Salmonella		12	0

1. Способ обнаружения микроорганизма вида Vibrio parahaemolyticus, включающий использование индикаторного штамма с последующим лизированием исследуемой культуры фагом, отличающийся тем, что в качестве индикаторного штамма используют Vibrio parahaemolyticus КМ-97, из которого перед применением готовят диагностический фаг путем смешивания 1,0 мл фага ФК-44 и 1,0 мл фага ФК-46 в соотношении 1:1, в титре n·10⁸ БОЕ/мл, затем проводят посев исследуемого штамма на газон культуры и наносят каплю полученного диагностического препарата фага в центр чашки, посевы выдерживают при температуре 37°C в течение 20-24 часов и по присутствию лизиса фагом исследуемого штамма подтверждают его принадлежность к микроорганизмам вида V. parahaemolyticus.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что газон культуры исследуемого штамма готовят с предварительным выращиванием последнего в термостате в течение 4-х часов при 37°C после посева в бульон Мартена с 3% NaCl, затем 0,3 мл выросшей культуры вносят в 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°C 0,7% агара Мартена с 3% NaCl и выливают его вторым слоем на пластинку агара Мартена с 3% NaCl в чашки Петри, посев подсушивают с последующим нанесением препарата фага.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования неразвивающейся беременности (НБ). Сущность способа: в супернатанте аспирационной жидкости из полости матки или менструальной крови определяют одномоментно содержание карбонильных групп белков и малонового диальдегида.

Способ определения риска развития сердечно-сосудистых осложнений у женщин с гипертонической болезнью // 2530621

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ определения риска развития сердечно-сосудистых осложнений у женщин с гипертонической болезнью путем забора крови у больных, определения в крови уровня интерлейкина-1α, рецепторного антагониста интерлейкина-1 иммуноферментным методом, отличающийся тем, что определяют показатель, равный отношению рецепторного антагониста интерлейкина-1 к интерлейкину-1α, фактор ингибирования лейкозных клеток в крови и количество CD34 клеток с последующим диагностированием развития сердечно-сосудистых осложнений в течение 5 лет, при этом устанавливают высокий, средний или низкий риски развития осложнений.

Способ прогнозирования общей выживаемости у больных с метастазами колоректального рака в печени после ее резекции // 2530610

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования общей выживаемости у больных с метастазами колоректального рака в печени после ее резекции, включающий определение клинико-патологических (морфологических), гистологических и молекулярных факторов прогноза, отличающийся тем, что с помощью иммуногистохимического метода проводят исследование молекулярных характеристик микроокружения опухоли, а именно наличие и количество сосудов с гладкомышечным актином в их стенке для стромы метастаза печени в трех полях зрения микроскопа, при этом поля зрения выбирают по максимальной выраженной иммуногистохимической реакции с каждого среза биоптата печени с метастатической опухолью и при наличии в каждом из трех полей зрения сосудов с наличием гладкомышечного актина в их стенке, пациента определяют в группу благоприятного прогноза (дожитие после резекции печени три года и более), при отсутствии сосудов с наличием в стенке гладкой мускулатуры во всех трех полях зрения, пациента включают в группу неблагоприятного прогноза (с продолжительностью жизни меньше двух лет).

Способ прогнозирования риска прогрессирования глаукомной оптической нейропатии // 2530588

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может использоваться для прогнозирования риска прогрессирования глаукомной оптической нейропатии (ГОН).

Способ исследования всасывания аминокислот в пищеварительном тракте // 2530581

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии, и описывает способ исследования всасывания аминокислот в желудочно-кишечном тракте. Способ заключается в том, что производят исследование крови после приема аминокислотной смеси для определения всасывания аминокислот.

Способ выбора лечения акне у женщин // 2529789

Изобретение относится к медицине, а именно дерматологии, и может быть использовано для выбора лечения акне у женщин путем исследования биологических жидкостей и назначения препаратов в зависимости от результатов обследования.

Способ определения структурного состояния мембраны эритроцитов // 2528909

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии. Способ осуществляют следующим образом.

Способ определения показаний к операции программированной санационной релапаротомии при перитоните // 2528880

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано при лечении больных с разлитым перитонитом. Сущность изобретения заключается в том, что выполняют лапаротомию при перитоните, берут экссудат из брюшной полости, определяют pH этого экссудата.

Способ лечения больных с синдромом диспепсии в сочетании с избыточной массой тела // 2528641

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано для повышения эффективности лечения пациентов с синдромом диспепсии в сочетании с избыточной массой тела.

Способ диагностики острого токсического повреждения печени // 2527770

Изобретение относится к медицине и касается диагностики острого токсического повреждения печени крыс. Способ заключается в выделении липидов, а именно в том, что добавляют 25 мкг 10% раствора тезита при одновременном перемешивании смеси с помощью шейкера при 20°C и частоте колебаний 120 в минуту в течение 30 минут с последующим определением в растворе общих фосфолипидов и триглицеридов.

Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - деструктор нефтяных углеводородов // 2531232

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН под регистрационным номером ВКМ Ас-2018 Д.

Штамм бактерий gordona sp. - деструктор нефтяных углеводородов // 2531231

Изобретение относится к микробиологии. Штамм Gordona sp.

Штамм bacillus lentus - продуцент бактериоциноподобной субстанции антимикробного действия и способ получения бактериоциноподобной субстанции // 2530552

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм Bacillus lentus «ГКПМ - Оболенск» B-7150 - продуцент бактериоциноподобной субстанции широкого спектра антимикробного действия, имеющей молекулярную массу по данным SDS-PAGE около 4 кДа.

Селективная питательная среда для выделения псевдомонад, сухая // 2530549

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии. Питательная среда содержит панкреатический гидролизат казеина, пептон мясной, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, цетримид, агар бактериологический, натрий углекислый, налидиксовую кислоту, глицерин и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.

Пробиотические микроорганизмы, обогащенные органическим селеном на базе соединений гидроксикислот селена, и их применение в питании, косметике и фармации // 2529956

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ обогащения пробиотических микроорганизмов, выбранных из дрожжей и бактерий, органическим селеном.

Pseudomonas stutzeri bacteria strain - decomposer of aliphatic and aromatic petroleum hydrocarbons and plant growth stimulant and use thereof // 2529948

Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Pseudomonas stutzeri ВКПМ B-11230 - деструктор нефтяных алифатических и ароматических углеводородов, стимулятор роста растений в ассоциации с растениями.

Биосорбент для ликвидации нефти с поверхности водоемов // 2529771

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биосорбент для ликвидации нефти с поверхности водоемов.

Способ повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам // 2529367

Изобретение относится к области микробиологии. Готовят две взвеси.

Бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба // 2529364

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для выделения и выращивания бруцеллезного микроба.

Рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa // 2529359

Группа изобретений относится к биотехнологии. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRF-ETA размером 8007 пар оснований кодирует синтез рекомбинантного белка OprF-ETA Pseudomonas aeruginosa.

Синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа с (6, 14 и 21 серотипы) методом от-пцр // 2529955

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов. Охарактеризованные праймеры комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа С (6, 14 и 21 серотипы) используются в ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов и имеют следующий состав (5'-3'): Прямой: GRAYATGRTGGATATWCCG Обратный: GGCTGCACRTCCAYYGARTC Представленное изобретение позволяет определить генетическую группу нуклеотипа C вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала с помощью ОТ-ПЦР в короткие сроки.