Способ получения стимулятора роста listeria monocytogenes из активированной эмбрионально-яичной массы перепелок
Владельцы патента RU 2535980:
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Кавказский федеральный университет" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения стимулятора роста Listeria monocytogenes предусматривает инкубацию яйца птицы с последующим охлаждением в течение 6-7 суток при температуре 2-4°C, гомогенизацию, фильтрацию, центрифугирование, фильтрацию, тиндализацию в течение 5-6 суток, фасовку. При этом в качестве яиц птицы используют перепелиные яйца, инкубируют их в течение 8 суток, перед инкубацией, а также на 3, 5, 7 и 8 сутки инкубации осуществляют озонирование яиц в течение 15 минут 2,1 г/м3 озоно-кислородной смеси. После фильтрации полученную массу разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:3 и затем проводят тиндализацию при температуре 55-59°C. Способ позволяет увеличить объем бактериальной массы и повысить качество стимулятора. 2 табл., 4 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов, и может быть использовано при их культивировании, в частности при культивировании штамма АУФ Listeria monocytogenes.
Уровень техники
Известен способ получения стимулятора роста микроорганизмов из чайного гриба, в том числе используемый при культивирования листерий. Способ заключается в том, что культивирование гриба производят в водном экстракте чая с содержанием 10% пищевого сахара с последующим отделением целевого продукта. При этом в воде при температуре кипения экстрагируют в течение 30 мин 1% чая с добавлением пищевого сахара. Затем воду охлаждают до 28-30°C, засевают 10%-ной культуральной жидкостью микробной ассоциации гриба. Культивирование осуществляют в течение 3-4 недель при вышеуказанной температуре. Способ использования стимулятора роста микроорганизмов предусматривает введение его в питательную среду для соответствующего микроорганизма. При этом для роста и размножения возбудителей листериоза стимулятор вводят в дозе 1,5-2% (см. пат. РФ №2115720, кл. C12N 1/14, опубл. 20.07.1998 г.).
Недостатком данного стимулятора роста микроорганизмов является сложность технологического процесса и доступности объекта.
Для стимулирования роста листерий известен способ получения автолизата печени крупного рогатого скота. Его изготавливают из свежемороженой печени крупного рогатого скота путем ее измельчения в мясорубке. На 1 кг фарша добавляют 4 л деионизированной воды и 1,5% химически чистой соляной кислоты. Смесь компонентов перемешивают, добавляют к ней 1-1,5% раствор хлороформа, разливают в баллоны и помещают в термостат при температуре 39-40°C на 7 суток. Смесь перемешивают 3-4 раза в сутки. На 7 сутки готовый гидролизат декантируют, подвергают фильтрации через ватно-марлевый фильтр, разливают в баллоны и добавляют 1% хлороформа (см. техн. регл. 00482861-0061-2009).
Недостатком данного способа получения стимулятора роста является высокая себестоимость конечного продукта.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ приготовления эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов, в том числе для Listeria monocytogenes, включающий инкубацию куриного яйца в течение 9 суток, причем на 5, 6, 7 сутки куриное яйцо облучают в течение 30 секунд при частоте модуляции 9 Гц и мощности излучения 9 мВт и охлаждают в течение 6-7 суток при температуре 2-4°C, гомогенизацию куриного яйца, охлажденного при температуре 2-4°C, центрифугирование при 15000 об/мин, затем полученную массу фильтруют и подвергают тиндализации при температуре 60-65°C в течение 5-6 суток, фасуют и лиофилизируют (патент РФ №2283347, C12N 1/38, A23K 3/00, опубл. 10.09.2006).
Недостатком данного эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов является не до конца раскрытый потенциал сырья.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения стимулятора роста микроорганизмов из активированной эмбрионально-яичной массы перепелок, обладающего высоким качеством и повышающего выход бактериальной массы при культивировании Listeria monocytogenes.
Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к повышению объема бактериальной массы при культивировании Listeria monocytogenes, повышению качества стимулятора.
Технический результат достигается с помощью способа получения стимулятора роста Listeria monocytogenes, включающего инкубацию яйца птицы с последующим охлаждением в течение 6-7 суток при температуре 2-4°C, гомогенизацию, фильтрацию, центрифугирование, фильтрацию, тиндализацию в течение 5-6 суток, фасовку, при этом согласно изобретению в качестве яиц птицы используют перепелиные яйца, инкубируют их в течение 8 суток, перед инкубацией, а также на 3, 5, 7 и 8 сутки инкубации осуществляют озонирование яиц в течение 15 минут (2,1 г/м3 озоно-кислородной смеси), после фильтрации полученную массу разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:3 и затем проводят тиндализацию при температуре 55-59°C.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения способа получения стимулятора роста микроорганизмов из активированной эмбрионально-яичной массы перепелок.
Пример №1. Проводят отбор свежих перепелиных яиц, полученных из благополучного хозяйства, со средней массой 11-14 г, затем их инкубируют в течение 8-9 суток, причем перед инкубацией, а также на 3, 5, 7 и 8 сутки яйца озонируют в течение 15 минут (2,1 г/м3 озоно-кислородной смеси) в полиэтиленовом мешке объемом 35 л, затем яйца охлаждают в течение 6-7 суток при температуре 2-4°C, затем проводят гомогенизацию яиц, гомогенат фильтруют через марлевый фильтр и полученный фильтрат разбавляют дистиллированной водой в соотношение 1:1 (одна часть дистиллированной воды к одной части фильтрата). Затем полученную массу подвергают тиндализации при температуре 55-59°C в течение 5-6 суток и фасуют во флаконы по 250 мл.
Полученный стимулятор обладает недостатками: препарат при применении не дает эффекта повышения объема бактериальной массы и при добавлении вызывает сильное помутнение среды, при тиндализации происходит свертывание препарата.
Пример №2. Проводят аналогично примеру №1, но после фильтрации проводят центрифугирование при 8000 об/мин, затем полученную массу вновь фильтруют, разбавляют дистиллированной водой, тиндализуют и фасуют.
Полученный стимулятор не дает эффекта повышения бактериальной массы и сворачивается при тиндализации.
Пример №3. Проводят аналогично примеру №2, но полученную массу разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:3. Стимулятор при данных параметрах обладает высоким эффектом повышения активности прироста бактериальной массы и не сворачивается при тиндализации.
Пример №4. Проводят аналогично примеру №3, но препарат подвергают тиндализации при температуре 70°C в течение 3 суток.
Полученный стимулятор содержит слишком много балластных частиц и при добавлении вызывает помутнение питательной среды.
Таким образом, наиболее оптимальным и соответствующим требованиям роста и размножения Listeria monocytogenes является способ получения эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов по примеру №3.
Для подтверждения качества стимулятора роста, полученного предлагаемым способом, было проведено исследование его химического состава, испытание на активность способом К. Бакирджиева (Калашник, И.А. Стимулирующая терапия в ветеринарии / И.А. Калашник. - 2-е изд., перераб. и доп. - К.: Урожай. - 1990. - 160 с), а также его испытание при культивировании штамма АУФ Listeria monocytogenes.
Было проведено химическое исследование полученного стимулятора роста на наличие аминокислот, микро- и макроэлементов. На основании проведенных исследований получены результаты, представленные в таблице 1.
| Таблица 1 | |
| Некоторые химические компоненты стимулятора роста микроорганизмов из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов, приготовленного по примеру №3 | |
| Химические компоненты/качественные показатели | Количественные показатели |
| 1. Аминокислоты:* | |
| треонин | количество не рассчитывали |
| цистин | количество не рассчитывали |
| изолейцин | количество не рассчитывали |
| аспарагин | количество не рассчитывали |
| аспарагиновая кислота | количество не рассчитывали |
| валин | количество не рассчитывали |
| лизин | количество не рассчитывали |
| аргинин | количество не рассчитывали |
| метионин | количество не рассчитывали |
| 2. Микро- и макроэлементы** | мкг/мл: |
| цинк | 0,20±0,09 |
| железо | 1,60±0,11 |
| натрий | 353,0±4,2 |
| калии | 516,0±5,4 |
| магний | 16,0±0,5 |
| кальций | 20,50±0,30 |
| марганец | отсутствует |
| медь | отсутствует |
| *Анализ свободных аминокислот осуществляли методом тонкослойной хроматографии (Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ц., 1980). | |
| **Анализ микро- и макроэлементов проводили методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на приборе ААС марки Perkin Elmer 2280 (производство США) (Ягодин Б.А., Дерюгин И.П., Жуков Ю.П., и др., 1987). |
При исследовании биологической активности способом К. Бакирджиева активность пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae при добавлении к среде выращивания препарата, приготовленного по примеру №3, увеличилась на 62% по сравнению с контролем.
Таким образом, разработанный способ получения стимулятора роста Listeria monocytogenes из активированной эмбрионально-яичной массы перепелок позволяет получить продукт с высокой биологической активностью, а также сохранить в нем широкий набор биологических компонентов, что указывает на его высокое качество.
Культивирование штамма АУФ Listeria monocytogenes производилось на бульоне Хоттингера с добавлением препарата, приготовленного по примеру №3 (в концентрации 1%). Через сутки был произведен посев культуры на агар Хоттингера для определения количества живых микробных клеток в суточной культуре бульона Хоттингера путем подсчета колоний. При подсчете колоний на агаре их количество увеличилось по сравнению с контролем в 1,5 раза (таблица 2), что говорит о повышении роста и размножения Listeria monocytogenes, а следовательно, и повышении выхода бактериальной массы при использовании способа согласно изобретению.
| Таблица 2 | |
| Культуральные свойства Listeria monocytogenes | |
| № примера | Количество колоний Listeria monocytogenes (M±m) |
| №1 Опыт | 50,3±0,88 |
| №2 Контроль | 33,3±0,86 |
| Результаты, приведенные в таблице, статистически достоверны(P<0,05) №1 Количество живых микробных клеток в суточной культуре бульона Хоттингера с добавлением предлагаемого стимулятора роста. №2 Количество живых микробных клеток в суточной культуре бульона Хоттингера без добавления предлагаемого стимулятора роста. |
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- стимулятор, полученный с помощью предлагаемого изобретения, обладает значительной эффективностью повышения роста и размножения Listeria monocytogenes, повышает выход бактериальной массы;
- имеет богатый химический состав, включает большое количество высокоактивных низкомолекулярных азотистых соединений, содержит разнообразные макро- и микроэлементы;
- имеет высокую биологическую активность.
Способ получения стимулятора роста Listeria monocytogenes, включающий инкубацию яйца птицы с последующим охлаждением в течение 6-7 суток при температуре 2-4°C, гомогенизацию, фильтрацию, центрифугирование, фильтрацию, тиндализацию в течение 5-6 суток, фасовку, отличающийся тем, что в качестве яиц птицы используют перепелиные яйца, инкубируют их в течение 8 суток, перед инкубацией, а также на 3, 5, 7 и 8 сутки инкубации осуществляют озонирование яиц в течение 15 минут 2,1 г/м3 озоно-кислородной смеси, после фильтрации полученную массу разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:3 и затем проводят тиндализацию при температуре 55-59°C.
