Способ воздействия на клетки гепатокарциномы в зависимости от стадии их дифференцировки нанопрепаратами лития

Изобретение относится к области разработки таргетной терапии опухолевого роста. Раскрыт способ воздействия на клетки гепатокарциномы различными нанопрепаратами лития в зависимости от стадии дифференцировки клеток гепатокарциномы: наноразмерной формой карбоната лития с размером частиц 10 нм в виде суспензии в физиологическом растворе, вводимой внутримышечно, для цитотоксического эффекта на опухолевые клетки 4 и 5 стадии дифференцировки, и наноразмерной формой цитрата лития с размером частиц 10 нм, растворенной в физиологическом растворе, вводимой внутрибрюшинно, для цитостатического эффекта на опухолевые клетки 1 - 3 стадий дифференцировки. Стадии дифференцировки определяют методом световой микроскопии по величине ядерно-цитоплазматического соотношения. Заявленный способ воздействия на клетки гепатокарциномы обеспечивает прицельное воздействие на клетки-мишени гепатокарциномы определенной стадии дифференцировки. 1 ил., 7 пр.

 

Изобретение относится к области разработки таргетных препаратов для терапии онкологических заболеваний. Разрабатываемые в последнее время противоопухолевые препараты в онкологии направлены на различные звенья опухолевого роста - некроз, апоптоз раковой клетки, блокирование пролиферации, воздействие на микроокружение, блокирование ангио-лимфангиогенеза и др. [3]. Однако, несмотря на достигнутые успехи в лечении онкологических заболеваний, уровень смертности от них в мире возрастает. Одной из причин сложности терапии является высокая степень гетерогенности популяции опухолевых клеток [1]. Для опухолевой ткани в последнее время стали применять термин - раковые стволовые клетки, полагая, что эти клетки способны к длительному выживанию при различных терапевтических воздействиях и что именно они должны быть мишенями лекарственных препаратов [22]. В то же время, согласно стохастической гипотезе развития рака, большую роль в прогрессии опухоли играют микроокружение и опухолевые клетки, не обладающие свойствами стволовых, но модулирующих кинетику стволовых опухолевых клеток и динамику развития опухоли [18]. В связи с этим, важным является не только выявление стволовых раковых клеток, но и фенотипирование всех опухолевых клеток популяции, для выявления морфологических маркеров, позволяющих судить об эффектах терапевтических воздействий. Одной из наиболее агрессивных опухолей человека является гепатокарцинома, которая остается пятой по распространенности и третьей по уровню смертности опухолью в мире, обусловленной наличием резистентности к проводимой полихимиотерапии [28, 29]. Подобно другим солидным опухолям гепатокарцинома характеризуется гетерогенностью популяции опухолевых клеток [11]. Известно, что раковые клетки в пределах одной опухоли характеризуются общими генетическими нарушениями, отражающими их происхождение из общего предшественника [6]. В свою очередь, генетические изменения обусловливают фенотипическую и функциональную гетерогенность опухоли, что затрудняет ее лечение [24].

Стандартными методами лечения гепатоцеллюлярного рака являются хирургическая резекция, этаноловая или радиочастотная аблация [35]. Радиочастотная аблация и этаноловая аблация признаны эффективными для лечения небольших инкапсулированных гепатокарцином менее 3 см в диаметре. Однако большинство пациентов на момент выявления имеют опухоль больших размеров. Резекция опухолей, расположенных рядом с магистральными сосудами и желчными протоками, не проводится. Эти опухоли, не зависимо от размера, трудно поддаются лечению с помощью радиочастотной или химической аблации, а в случаях крупных опухолей добиться полной аблации с помощью этих методов практически не возможно. На более поздней стадии заболевания может быть применена эмболизация (Transcatheter arterial chemoembolization, ТАСЕ), которая проводится посредством введения химиотерапевтического препарата в печеночную артерию [30]. При этом используются препараты, блокирующие рост кровеносных сосудов (Сорафениб, Авастин) [19], или воздействующие на клеточный цикл и стимулирующие апоптоз раковых клеток (доксорубицин, цисплатин, 5-фторурацил) [17]. Недостатком используемых препаратов является развитие побочных эффектов. Негативные последствия используемых препаратов для блокирования клеточного цикла опухолевой клетки, в частности доксорубицина, обусловливаются цитотоксическим действием препарата и его метаболитов на клеточные популяции печени (прежде всего на гепатоциты), выраженными гемодинамическими нарушениями в большом круге кровообращенения [4], а также значительным токсическим воздействием на другие системы организма, в частности, сердечнососудистую [5].

Известны также способы воздействия на опухолевый рост и других препаратов, включая препараты лития. Например, карбонат лития используется как усилитель традиционной терапии при карциноме щитовидной железы [7, 32]. Как препарат, способствующий восстановлению костного мозга и состава крови после химиотерапии. Показана нормализация содержания нейтрофилов в крови после радиотерапии и химиотерапии [14], восстановление содержания тромбоцитов в крови [15], повышение CD34+ клеток в крови при лейкемии [9], усиление продукции цитокинов при раке молочной железы [25]. Имеются данные об использовании карбоната лития в качестве нейропротективного агента у больных раком с целью повышения качества жизни за счет сохранения когнитивных способностей, улучшения эмоционального состояния [16, 33, 34], для предотвращения развития периферической нейропатии при агрессивных курсах химиотерапии [26].

Известен также способ применения солей лития для воздействии на опухоль при онкопатологии, заключающийся в блокировании пролиферации. Соли лития являются селективными ингибиторами гликоген синтазы киназы-3β или GSK-3β, которая участвует в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Показано, что карбонат лития может вызывать остановку пролиферации за счет ареста клеточного цикла в фазе G2/M в трансформированных опухолевых клетках [31]. Выявлено, что карбонат лития индуцирует апоптоз опухолевых клеток, ингибируя экспрессию антиапоптотического белка bc1-2 [22], подавляет подвижность и инвазивность трансформированных клеток [27].

Известно использование в онкологии и других солей лития. Цитрат лития использовали при лечении рака груди [8]. Имеются данные об использовании хлорида лития при лечении рака желудка [10], низко дифференцированных нейроэндокринных опухолей [20]; глиом [13].

Соединения лития рассматривают как потенциальные агенты таргетной терапии, способные замедлить рост опухоли.

В тоже время с развитием нанотехнологий выявляются новые, более выраженные свойства наноразмерных структур, по сравнению с исходными формами. В настоящее время наночастицы металлов используют для усиления фотодинамической и гипертермической терапии. Площадь свободной поверхности материала в ультрадисперсном состоянии превышает площадь свободной поверхности вещества, сохраняющего высокую степень порядка, и в результате в твердом теле возникают новые физические явления и свойства, которых не было ранее и которые невозможно предсказать, исходя из строения и свойств массивного вещества.

В настоящее время отсутствуют данные о влиянии солей лития на клетки гепатокарциномы, о фенотипировании стадий дифференцировки клеток гепатокарциномы и, по существу, неизвестны клетки - мишени для воздействия. Кроме того, используемые дозы препаратов лития в онкологии могут оказывать негативные эффекты, способствуя развитию почечной недостаточности [12], и даже приводить к внезапной смерти [21].

Технический результат изобретения - прицельное воздействие на клетки-мишени гепатокарциномы определенной стадии дифференцировки.

Стадию дифференцировки опухолевых клеток определяли методами световой, электронной микроскопии, цифровой цитометрии ДНК и проточной цитофлюориметрии. Изменение ультраструктурной организации опухолевых клеток с возрастанием объемной доли цитоплазмы позволяет характеризовать данные клетки как имеющие разные стадии дифференцировки (рис. 1). Распределение по стадиям осуществляется по величине ядерно-цитоплазматического соотношения и по содержанию внутриклеточных органелл. В клетках выделенной нами первой стадии дифференцировки ядерно-цитоплазматическое соотношение составляло 0,797±0,008, второй стадии дифференцировки - 0,681±0,005, 3-й 4-й стадии дифференцировки - соответственно 0,596±0,005 и 0,492±0,004. Клетки, отнесенные к 5-й стадии дифференцировки, имели ядерно-цитоплазматическое соотношение 0,384±0,006.

Предлагаемое изобретение позволяет элиминировать из популяции опухолевых клеток гепатокарциномы клетки определенной стадии дифференцировки путем воздействия наноразмерными формами карбоната лития и цитрата лития.

Наноразмерные частицы солей лития были получены путем механоактивации образцов в мельнице-активаторе планетарного типа АГО-2С по описанной в литературе методике [2]. Размер частиц солей лития определяли под электронным микроскопом с помощью компьютерной программы Image Tool и он составлял 10 нм.

В опытах in vitro было показано, что наноразмерные формы цитрата лития и карбоната лития проявляют антипролиферативный эффект в отношении клеток гепатокарциномы 29 в более узком диапазоне доз и при более низких концентрациях, чем их аналоги цитрат лития и карбонат лития в исходной форме.

В опытах in vivo было показано, что внутрибрюшинное введение цитрата лития в наноразмерной форме (по 0,1 мл взвеси наноразмерных частиц карбоната лития, приготовленных на стерильном 0,85% водном растворе хлорида натрия в дозе 0,92 мг на животное в течение 5 дней) животным после индукции опухолевого процесса приводит к блокированию пролиферации клеток ГК-29 1-3 стадии дифференцировки и снижению количества высокодифференцированных клеток 4-5 стадии дифференцировки.

Выявлено, что внутримышечное введение карбоната лития в наноразмерной форме (по 0,1 мл взвеси наноразмерных частиц карбоната лития, приготовленных на стерильном 0,85% водном растворе хлорида натрия в дозе 0,037 мг на животное в течение 5 дней) животным, после индукции опухолевого процесса, приводит к гибели более дифференцированных клеток 4 и 5-й стадии дифференцировки и снижению количества клеток 3-й стадии дифференцировки.

Показано, что совместное внутрибрюшинное введение наноразмерной формы цитрата лития (в дозе 0,92 мг на животное в течение 5 дней) и внутримышечное введение наноразмерной формы карбоната лития (в дозе 0,037 мг на животное в течение 5), приводит к блокированию пролиферации и гибели клеток 3-й, 4-й и 5-й стадий дифференцировки.

Таким образом, нанопрепараты лития действуют прицельно. Цитрат лития блокирует пролиферацию клеток 1 -3 стадий дифференцировки, что приводит к снижению количества более дифференцированных клеток 4 и 5 стадий дифференцировки. Введение наноразмерного карбоната лития оказывает цитотоксический эффект на более дифференцированные клетки 4 и 5-ой стадий дифференцировки.

Отличительным признаком способа воздействия является прицельное воздействие на определенные клетки-мишени гепатокарциномы наноразмерными формами цитрата лития и карбоната лития.

Предлагаемый способ воздействия позволяет блокировать пролиферацию наиболее активных опухолевых клеток гепатокарциномы 1-3 стадий дифференцировки за счет применения наноразмерной формы цитрата лития и элиминировать из популяции более дифференцированные клетки 4-5 стадии дифференцировки при использовании наноразмерной формы карбоната лития.

Отработку наиболее эффективной дозы применения наноразмерных форм цитрата лития и карбоната лития проводили in vitro на культуре клеток гепатокарциномы-29. Для исследования in vitro использовали карбонат лития (Li₂CO₃) и цитрат лития (Li₃C₆H₅O₇×4H₂O) в обычной и наноразмерной форме в концентрациях 10^-7, 10^-6, 10^-5, 10^-4, 5×10^-3, 25×10^-3, 50×10^-3 М в физиологическом растворе. В контроле в культуральную среду вносили физиологический раствор в аналогичном объеме. Антипролиферативные и цитотоксические свойства данных препаратов оценивали с помощью МТТ-теста. МТТ-метод определения жизнеспособности клеточных культур и их способности к пролиферации заключается в способности живых клеток превращать растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) в нерастворимые пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана. Нежизнеспособные мертвые клетки такой способностью не обладают.

Клетки гепатокарциномы 29 вносили в низкой плотности (5×10³ клеток/мл) в лунки 96-луночного планшета в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, инактивированной в течение 1 ч при 56°C, 300 мкг/мл глутамина, 16 мкг/мл гентамицина и 15 мМ HEPES. Спустя 24 ч вносили препарат в различных концентрациях. Инкубацию с препаратом проводили 3 дня при 37°C, 5% CO₂, затем добавляли МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали 4 ч, затем среду отбирали и клетки растворяли в ДМСО. Оптическую плотность оценивали на анализаторе иммуноферментных реакций «Stat Fax 2100» США при 540 нм, используя DMSO как нулевой контроль.

В опытах in vitro было показано, что препараты цитрата лития и карбоната лития в наноразмерной форме проявляют значимый противоопухолевый эффект в более низких концентрациях и в более узком диапазоне - 10^-5-10^-3 М, чем их аналоги цитрат лития и карбонат лития в исходной форме.

Полученные значения наиболее эффективных доз наноразмерных форм цитрата и карбоната лития пересчитывали для эксперимента in vivo, учитывая способ введения препарата и вес экспериментальных животных. Проводили эксперименты in vivo с введением определенных in vitro доз наноразмерных форм цитрата и карбоната лития животным, с привитой в область бедра гепатокарциномой-29 в целях выявления клеток-мишеней гепатокарциномы для данных папопрепаратов лития и стадий их клеточной дифференцировки.

В результате получены следующие данные.

Эксперимент 1. Добавление наноразмерной формы карбоната лития в концентрациях 10^-3 М в культуру клеток гепатокарциномы-29 приводило к подавлению жизнеспособности опухолевых клеток на 29±0,6%.

Эксперимент 2. Добавление исходной формы карбоната лития в концентрациях 10^-3 М в культуру клеток гепатокарциномы-29 не оказывало токсического действия на опухолевые клетки.

Эксперимент 3. Добавление наноразмерной формы цитрата лития в концентрациях 10^-3 М в культуру клеток гепатокарциномы-29 приводило к подавлению жизнеспособности опухолевых клеток на 30±0,8%.

Эксперимент 4. Добавление исходной формы цитрата лития в концентрациях 10^-3 М в культуру клеток гепатокарциномы-29 не оказывало токсического действия на опухолевые клетки.

Эксперимент 5. Мышам самцам линии СВА (n=10), после индукции опухолевого процесса (через 20 суток после введения опухолевых клеток из асцитической жидкости), внутрибрюшинно по 0,1 мл в физиологическом растворе вводили цитрат лития в наноразмерной форме в дозе 0,92 мг на животное в течение 5 дней. Внутрибрюшинное введение наноразмерной формы цитрата лития было принято для моделирования процесса внутривенного введения препарата. Исследование структуры опухоли выявило снижение на 30% числа клеток 4-й стадии дифференцировки и на 84% уменьшалось количество клеток 5-й стадии дифференцировки, по сравнению с их содержанием в опухоли без воздействия лития.

Эксперимент 6. Экспериментальное исследование было проведено на мышах-самцах линии СВА, которые получали пятикратно внутримышечные инъекции по периферии опухолевого роста в правое бедро в объеме 0,1 мл взвеси наноразмерных частиц карбоната лития, приготовленных на стерильном 0,85% водном растворе хлорида натрия в дозе 0,037 мг на животное. Внутримышечное введение наноразмерной формы карбоната лития было принято для моделирования процесса доставки препарата к месту имплантации опухолевых клеток. Через 20 суток эксперимента в опухоли на 45% уменьшилось количество клеток 4-й и на 60% снизилось количество клеток 5-й стадии дифференцировки, по сравнению с опухолью бедра без введения нанопрепарата лития. Сравнение эффектов 2-х наноразмерных форм лития показало, что при введении наноразмерного цитрата лития, по сравнению с карбонатом лития, на 64% было снижено количество клеток 5-й стадии дифференцировки.

Эксперимент 7. В эксперименте исследовали совместное внутрибрюшинное введение наноразмерной формы цитрата лития (в физиологическом растворе в дозе 0,92 мг на животное в течение 5 дней) и внутримышечное ведение наноразмерной формы карбоната лития (в физиологическом растворе в дозе 0,037 мг на животное) мышам самцам линии СВА (n=20), после индукции опухолевого процесса. Было выявлено, что при совместном введении наноразмерных форм цитрата и карбоната лития на 35% снизилось количество клеток третьей стадии, на 63% уменьшилось количество клеток 4-й стадии и на 90% клеток 5-й стадии дифференцировки, по сравнению с гепатокарциномой бедра без воздействия.

Таким образом, определенные нами морфологические критерии стадий дифференцировки клеток ГК-29 позволили выявить различия в направленности воздействия и клетки-мишени использованных нами доз нанопрепаратов лития - наноразмерной формы цитрата лития и наноразмерной формы карбоната лития. Введение наноразмерной формы карбоната лития оказывает цитотоксический эффект на более дифференцированные клетки гепатокарциномы 4 и 5-й стадий дифференцировки, а наноразмерная форма цитрата лития обладает цитостатическим эффектом, блокируя пролиферацию клеток 1-3 стадий дифференцировки, что приводит к снижению количества более дифференцированных клеток 4 и 5 стадий дифференцировки. Совместное использование нанопрепаратов лития способствует большему проценту гибели клеток 3-й стадии дифференцировки и снижению высокодифференцированных клеток 4 и 5 стадии клеточной дифференцировки. Использование наноразмерных форм лития позволяет более эффективно использовать низкие дозы препаратов, что исключает развитие побочных эффектов.

Литературные источники

1. Геращенко Т.С., Денисов Е.В, Литвяков Н.В., Завьялова М.В., Вторушин С.В., Цыганов М.М., Перельмутер В.М., Чердынцева Н.В. Внутриопухолевая гетерогенность: природа и биологическое значение. Биохимия. 2013. т. 78, №11, с. 1531-1549.

2. Исупов В.П., Еремина Н.В., Булина Н.В. Механическая активация карбоната лития. Известия Томского политехнического университета. 2013. Т. 322. Т 3. С. 29-31.

3. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С., Овчинникова Л.К., Дигаева М.А. Молекулярные маркеры опухолей. Бюлл. Эксперим. Биол. Мед. 2009. Т. 148. №8. С. 199-208.

4. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Молодых О.П., Калинникова М.Г. Структурная реорганизация печени крыс при цитотоксическом действии доксорубицина. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. - № 5. - С. 579-585.

5. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Молодых О.П., Клинникова М.Г. Ультраструктурные проявления нарушения регенерации кардиомиоцитов при действии доксорубицина // Морфология, 2005. - № 4. - С. 81-84.

6. Тюряева И.И., Филатова Н.А., Розанов Ю.М., Демин С.Ю., Блинова Г.И., Иванов В.А. Морфологическая и функциональная гетерогенность клеток асцитной гепатомы Зайдена крысы. Цитология. 2010. т. 52, №10, с. 817-826.

7. Ang E.S., Teh H.S., Sundram F.X., Lee K.O. Effect of lithium and oral thyrotrophin-releasing hormone (TRH) on serum thyrotrophin (TSH) and radioiodine uptake in patients with well differentiated thyroid carcinoma // Singapore Med J. 1995. Vol. 36. № 6. P. 606-608.

8. Brand T.M., Wheeler D.L. Treating PIK3CA and EGFR overexpressing breast cancer with lithium citrate // Cancer biology & therapy. - 2011.-Vol. 11, №3. - P. 368-370.

9. Canales М.А., Arrieta R., Hernndez-Garcна C., Bustos J.G., Aguado M.J., Hernndez-Navarro F. A single apheresis to achieve a high number of peripheral blood CD34+ cells in a lithium-treated patient with acute myeloid leukaemia. // Bone Marrow Transplant. 1999. Vol 23. №3. P. 305.

10. Cho Y.J., Kim J.H., Yoon J., Cho S.J., Ko Y.S., Park J.W., et al. Constitutive activation of glycogen synthase kinase-3beta correlates with better prognosis and cyclin-dependent kinase inhibitors in human gastric cancer. BMC Gastroenterol. 2010. P. 10:91.

11. Colombo F., Baldan F., Mazzucchelli S., Martin-Padura I., Marighetti P., Cattaneo A., Foglieni В., Spreafico M., Guerneri S, Baccarin M., Bertolini F., Rossi G., Mazzaferro V., Cadamuro M., Maggioni M., Agnelli L., Rebulla P., Prati D., Porretti L. Evidence of distinct tumour-propagating cell populations with different properties in primary human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 2011. v. 6, №6, р. е21369.

12. Di Salvo D.N., Park J., Laing F.C. J Lithium nephropathy: unique sonographic findings. // Ultrasound Med. 2012. Vol. 31. № 4. P. 637-644.

13. Fu Y., Zheng S., Huang R., An N., Zheng Y., Zhang Z., Liang A. A potential strategy for high-grade gliomas: combination treatment with lithium chloride and BmK CT // Biotechnol Lett. 2012. Vol.34. № 1. P. 9-17.

14. Hager ED, Dziambor H, Нöhmann D, Winkler P, Strama H. Effects of lithium on thrombopoiesis in patients with low platelet cell counts following chemotherapy or radiotherapy. // Biol Trace Elem Res. 2001 Nov; 83(2): 139-48.

15. Hager E.D., Dziambor H., Winkler P., Нöhmann D., Macholdt K. Effects of lithium carbonate on hematopoietic cells in patients with persistent neutropenia following chemotherapy or radiotherapy. // J Trace Elem Med Biol. 2002. Vol. 16. № 2. P. 91-97.

16. Khasraw M., Ashley D., Wheeler G. and Berk M. Using lithium as a neuroprotective agent in patients with cancer // BMC Medicine 2012, 10:131 http://www.biomedcentral.com/1741-7015/10/131.

17. Kudo M. Treatment of Advanced Hepatocellular Carcinoma with Emphasis on Hepatic Arterial Infusion Chemotherapy and Molecular Targeted Therapy // Liver Cancer. 2012. Vol. 1. № 2. P. 62-70.

18. Kusumbe A.P., Bapat S.A. Cancer Stem Cells and Aneuploid Populations within Developing Tumors Are the Major Determinants of Tumor Dormancy. Cancer Res. 2009. v. 69, №24. P. 9245-9253.

19. Lee J.E., Bae S.H., Choi J.Y., Yoon S.K., You Y.K., Lee M.A. Epirubicin, Cisplatin, 5-FU combination chemotherapy in sorafenib-refractory metastatic hepatocellular carcinoma // World J Gastroenterol. 2014. Vol. 20. № 1. P. 235-241.

20. Lubner S.J., Kunnimalaiyaan M., Holen K.D., Ning L., Ndiaye M., Loconte N.K., Mulkerin D.L., Schelman W.R., Chen H. A preclinical and clinical study of lithium in low-grade neuroendocrine tumors // Oncologist. 2011. Vol. 16. № 4. P. 452-457.

21. Lyman G.H., Williams C.C., Dinwoodie W.R., Schocken D.D. Sudden death in cancer patients receiving lithium. J Clin Oncol. 1984. Vol. 2. № 11. P. 1270-1276.

22. Marjanovic N.D., Weinberg R.A., Chaffer C.L. Cell plasticity and heterogeneity in cancer. Clin Chem. 2013. v. 59, №1. p. 168-179.

23. Matsebatlela Т, Gallicchio V., Becker R. Lithium modulates cancer cell growth, apoptosis, gene expression and cytokine production in HL-60 promyelocytic leukaemia cells and their drug-resistant sub-clones // Biol Trace Elem Res. 2012. Vol 149. № 3. P. 323-330.

24. Meacham C.E., Morrison S.J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 2013. v. 501, №7467, p. 328-337.

25. Merendino R.A., Mancuso G., Tomasello F., Gazzara D., Cusumano V., Chillemi S., Spadaro P., Mesiti M. Effects of lithium carbonate on cytokine production in patients affected by breast cancer. // J Biol Regul Homeost Agents. 1994. Vol. 8. № 3. P. 88-91.

26. Mo M., Erdelyi I., Szigeti-Buck K., Benbow J.H., Ehrlich B.E. Prevention of paclitaxel-induced peripheral neuropathy by lithium pretreatment // FASEB J. 2012. Vol. 26. № 11. P. 4696-4709.

27. Néel B.D., Lopez J., Chabadel A., Gillet G. Lithium suppresses motility and invasivity of v-src-transformed cells by glutathione-dependent activation of phosphotyrosine phosphatases. // Oncogene.2009. Vol. 28. № 36. P. 3246-3260.

28. Pang R.W., Poon R.T. Cancer stem cell as a potential therapeutic target in hepatocellular carcinoma. Curr Cancer Drug Targets. 2012. v. 1, №12(9), p. 1081-1094.

29. Shen Y., Cao D. Hepatocellular carcinoma stem cells: origins and roles in hepatocarcinogenesis and disease progression. Front Biosci (Elite Ed). 2012. v. 1, №4, p. 1157-1169.

30. Tono Т., Hashimoto K., Yamada Y., Nishida K., Yanagawa Т., Danno K., Fujie Y., Fujita S., Fujita J., Yoshida Т., Onishi Т., Imaoka S., Monden T. Efficacy of stereotactic radiotherapy for primary and metastatic liver cancer // Gan To Kagaku Ryoho. 2013. Vol. 40. №12. P. 1853-1855.

31. Tsui M.M., Tai W.C., Wong W.Y., Hsiao W.L. Selective G2/M arrest in a p53(Val135)-transformed cell line induced by lithium is mediated through an intricate network of MAPK and β-catenin signaling pathways // Life Sci. 2012. Vol. 24; 91. № 9-10. P. 312-321.

32. Wolff E.F., Hughes M., Merino M.J., Reynolds J.C., Davis J.L., Cochran C.S., Celi F.S. Expression of Benign and Malignant Thyroid Tissue in Ovarian Teratomas and the Importance of Multimodal Management as Illustrated by a BRAF-Positive Follicular Variant of Papillary Thyroid Cancer // THYROID Volume 20, Number 9, 2010 P. 981-987.

33. Xia F, Yang E, Hallahan D, Lu B: Lithium-mediated neuroprotection during cranial irradiation: a phase I trial. Neuro-oncology 2008, 10(5):887-887.

34. Yang E.S., Lu, В., Hallahan D.E.: Lithium-mediated neuroprotection during cranial irradiation: A phase 1 trial. ASTRO (American Society for Therapeutic Radiology and Oncology) - 49th annual Conference Los Angeles CA; 2007.

35. Zhang L., Zhu H., Jin Ch., Zhou K., Li L, Su H., Chen W., Bai J., Wang Zh. High-intensity focused ultrasound (HIFU): effective and safe therapy for hepatocellular carcinoma adjacent to major hepatic veins // Eur Radiol. 2009. Vol. 19. № 2. P. 437-445.

Способ воздействия на клетки гепатокарциномы, отличающийся тем, что в качестве противоопухолевых агентов применяют нанопрепараты лития в зависимости от стадии дифференцировки клеток гепатокарциномы: наноразмерную форму карбоната лития с размером частиц 10 нм в виде суспензии в физиологическом растворе, вводимую внутримышечно, применяют для цитотоксического эффекта на опухолевые клетки 4 и 5 стадии дифференцировки, а наноразмерную форму цитрата лития с размером частиц 10 нм, растворенную в физиологическом растворе, вводимую внутрибрюшинно - для цитостатического эффекта на опухолевые клетки 1 - 3 стадий дифференцировки, при этом стадии дифференцировки клеток определяют методом световой микроскопии по величине ядерно-цитоплазматического соотношения: 0,797±0,008 - первая стадия дифференцировки, 0,681±0,005 - вторая стадия, 0,596±0,005 - третья стадия, 0,492±0,004 - четвертая стадия, 0,384±0,006 - пятая стадия дифференцировки.