Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки



Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки
Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки
Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки
Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки
Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки
Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки
Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки
Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки
Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки
C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2563804:

Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Предложен способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки, предусматривающий трансфекцию методом кальций-фосфатной преципитации в присутствии гистона Н1.3 в эффективном количестве. Способ повышает эффективность трансфекции. 9 ил.

 

Изобретение относится к способу введения рекомбинантных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки in vitro и может быть использовано для получения генетически модифицированных клеток в биологии, биотехнологии, медицине и ветеринарии.

Известен способ генетической модификации эукариотических клеток методом кальций-фосфатной преципитации, при котором нуклеиновая кислота образует с фосфатами комплекс, который затем поглощается клеткой. Кальций-фосфатный метод характеризуется простотой применения и низкой стоимостью, однако эффективность этого способа зависит от образования комплексов нуклеиновых кислот с фосфатом, которые чувствительны к значению pH растворов [1].

Известен способ повышения эффективности кальций-фосфатного метода трансфекции путем использования 2x буфера BBS pH 6,9. Способ повышает эффективность трансфекции от 10 до 50% [2].

Известны способы повышения эффективности кальций-фосфатного метода трансфекции путем физического воздействия на клетки-мишени, например ультразвуком [3]. Ограничение использования физических методов обусловлено наличием специального оборудования.

К физическим методам доставки нуклеиновых относят также микроинъекции[4,5]. Микроинъекция является простым, экономичным, эффективным, воспроизводимым и нетоксичным методом, который подходит для доставки больших по размеру нуклеиновых кислот. Неудобством использования микроинъекций является необходимость манипулирования с каждой отдельной клеткой.

Наиболее близким по сути изобретения является способ доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот методом кальций-фосфатной преципитации с добавлением биоразлагаемого полимера поли(лактид-со-гликолида)[6]. Однако применение биоразлагаемых полимеров в генетической инженерии в настоящее время находится на стадии разработки и требует дополнительных исследований.

Цель изобретения - создание эффективного способа генетической модификации эукариотических клеток, не требующего специального оборудования.

Предложенный нами способ позволяет существенно повысить эффективность кальций-фосфатного метода трансфекции и избежать недостатков аналогов.

Технический результат достигается тем, что трансфекцию эукариотических клеток кальций-фосфатным методом проводят в присутствии гистона в эффективном количестве.

Под определением «гистонный белок (гистон)» подразумевают гистоны различных типов (коровые гистоны Н2А, Н2 В, Н3, Н4 и линкерный гистон H1), включая N-бисметионин-гистона человека Н1.3

Эффективное количество может быть определено специалистом эксперементально, например путем определения соотношений плДНК/ гистон, при которых образуемый комплекс не меняет электрофоретическую подвижность.

Краткое описание рисунков.

Рис. 1. Комплексообразование гистонов/плазмидной ДНК в 150 мМ растворе NaCl. Длительная экспозиция при фотографировании геля, окрашенного бромистым этидием. Диапазон исследуемых количеств гистона Н1.3 (при количестве пазмидной ДНК 1 мкг): от 0,125 до 3,0 мкг. Плазмидная ДНК - pEGFP-N2 (BD Biosciences Clontech, Германия). А - кольцевая релаксированная ДНК, Б - линейная ДНК, В - суперскрученная ДНК, Г - денатурированная ДНК. М - маркер Gene Ruller 1Kb DNA Lader (Thermo Fisher Scientific Inc., США), лунки 1-15 - комплексы с разными соотношениями плазмидной ДНК и гистона Н1.3 (w:w): лунка 1 - 1:3, лунка 2 - 1:2,5, лунка 3 - 1:2, лунка 4 - 1:1,75, лунка 5 - 1:1,5, лунка 6 - 1:1,25, лунка 7 - 1:1, лунка 8 - 1:0,875, лунка 9 - 1:0,75, лунка 10 - 1:0,625, лунка 11 - 1:0,5, лунка 12 - 1:0,375, лунка 13 - 1:0,25, лунка 14 - 1:0,125, лунка 15 - 1:0.

Рис. 2. Проточная цитофлуориметрия клеток НЕК293Т, трансфицированных с помощью кальций-фосфатного метода в комбинации с гистонофекцией. 48 часов после трансфекции. Клетки трансфицировали плДНК pEGFP-N2. Фоновый уровень флуоресценции составил 0,73% (А). Б - трансфекция с помощью кальций-фосфатного метода. В - трансфекция клеток с помощью комбинированного метода: гистонофекции, соотношение плДНК/Н1.3 - 1:0,1 (w:w), и кальций-фосфата. Г - трансфекция клеток с помощью комбинированного метода: гистонофекции, соотношение плДНК/Н1.3 - 1:3 (w:w), и кальций-фосфата.

Рис. 3. Трансфекция клеток НЕК293Т с помощью кальций-фосфатного метода в комбинации с гистонофекцией. Клетки трансфицировали плДНК pEGFP-N2. Процент EGFP-позитивных клеток подсчитывали через 2 дня после трансфекции с помощью проточной цитофлуориметрии. Фоновый уровень флуоресценции составил 0,73%. Са-Р - трансфекция с помощью кальций-фосфатного метода. Са-Р+плДНК/Н1.3 1:0,1 - трансфекция клеток с помощью комбинированного метода: гистонофекции, соотношение

плДНК/Н1.3 - 1:0,1 (w:w), и кальций-фосфата. Са-Р+плДНК/Н1.3 1:3-трансфекция клеток с помощью комбинированного метода: гистонофекции, соотношение плДНК/Н1.3 - 1:3 (w:w), и кальций-фосфата. Результаты представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (n=3). * - образцы, которые статистически значимо отличались от Са-Р (значение р<0,05).

Рис. 4. Трансфекция клеточной культуры hTGSC комплексами плазмидной ДНК/гистона Н1.3. А, В - флуоресцентная микроскопия, Б, Г - фазово-контрастная световая микроскопия. 24 часа инкубации после трансфекции. Трансфекция с помощью трансфекционного агента TransFast (А, Б) или комплексами плазмидной ДНК/гистона Н1.3 (Б, Г) в соотношении 1:125 (w:w).

Рис. 5. Трансфекция фибробластов человека комплексами плазмидной ДНК/гистона Н 1.3. А, В - флуоресцентная микроскопия, Б, Г - фазово-контрастная световая микроскопия. 24 часа инкубации после трансфекции. Трансфекция с помощью трансфекционного агента TransFast (А, Б) или комплексами плазмидной ДНК/гистона Н1.3 (Б, Г) в соотношении 1:125 (w:w).

Рис. 6. Трансфекция клеточной культуры HeLa комплексами плазмидной ДНК/гистона Н 1.3. А, В - флуоресцентная микроскопия, Б, Г - фазово-контрастная световая микроскопия. 24 часа инкубации после трансфекции. Трансфекция с помощью трансфекционного агента TransFast (А, Б) или комплексами плазмидной ДНК/гистона Н1.3 (Б, Г) в соотношении 1:125 (w:w).

Рис. 7. Трансфекция клеточной культуры MCF7 комплексами плазмидной ДНК/гистона Н 1.3. А, В - флуоресцентная микроскопия, Б, Г - фазово-контрастная световая микроскопия. 24 часа инкубации после трансфекции. Трансфекция с помощью трансфекционного агента TransFast (А, Б) или комплексами плазмидной ДНК/гистона Н1.3 (Б, Г) в соотношении 1:125 (w:w).

Рис. 8. Проточная цитофлуориметрия клеток hTGSC, трансфецированных плазмидной ДНК. Гистограмма распределение флуоресцентности GFP в клеточной популяции. А - нетрансфицированный контроль (0,19% GFP-позитивных клеток - фон флуоресценции); Б - комплексы плазмидной ДНК/гистона Н 1.3 в соотношении 1:125 (w:w) (0,96% GFP-позитивных клеток); В - трансфекционный агент TransFast (11,57% GFP-позитивных клеток - положительный контроль).

Рис. 9. Проточная цитофлуориметрия клеток hTGSC, трансфецированных плазмидной ДНК. Точечная диаграмма размера клеток (англ. forward scatter, прямое рассеивание, FSC) по отношению к их гранулированности (англ. side scatter, боковое рассеивание, SSC). А - нетрансфицированный контроль; Б - комплексы плазмидной ДНК/гистона Н 1.3 в соотношении 1:125 (w:w); В - трансфекционный агент TransFast (положительный контроль). Физические параметры клеток (FSC и SSC) не изменились под действием трансфекционного агента TransFast и комплексов плазмидной ДНК/гистона Н 1.3 по сравнению с нетрансфицированными клетками.

Способ производят последовательно, например, в три этапа.

Первый этап. Культивирование клеток.

Все работы с культурой клеток проводят в стерильном ламинарном боксе согласно общепринятым правилам работы в лаборатории 2-го класса биобезопасности.

Эмбриональные клетки почки человека НЕК-293Т (АТСС, CRL-11268) культивируют в среде среде DMEM (англ. Dulbecco′s modified Eagle′s medium) с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы (англ. Fetal Bovine Serum, FBS), 2 мМ L-глутамина и 1× смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (фирма-производитель - ПанЭко, Россия). Клетки инкубируют при плюс 37°C, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2- Пересев клеток проводят при плотности клеточного монослоя 90% с применением 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (фирма-производитель - Sigma-Aldrich, США).

Таким путем завершают получение клеточных культур НЕК293А и HeLa и приступают ко второму этапу.

Второй этап. Приготовление раствора рекомбинантного гистона Н1.3.

Для приготовления рекомбинантного гистона Н1.3 (гистонного белка) делают навеску гистона Н1.3 «Онкогист» (фирма-производитель - ИБХ РАН, Россия), растворяют в стерильной воде MilliQ до концентрации 50 мкг/мкл. Рабочий раствор гистона Н1.3 хранят при плюс 4°C.

Третий этап. Трансфекция клеток НЕК293Т методом кальций-фосфатной преципитации.

Трансфекцию клеток НЕК293Т проводят комплексами плДНК pEGFP-N2 и гистона Н1.3 в различных комбинациях (соотношения плДНК/Н1.3 (w:w) - 1:0, 1:0,1, 1:3). Плазмидный вектор pEGFP-N2 (фирма-производитель - BD Biosciences Clontech, Германия) кодирует ген улучшенного зеленого флуоресцентного белка EGFP.

Комбинации были выбраны на основе экспериментов по задержке в агарозном геле комплексов плДНК/Н1.3. При соотношении 1:2-1:3 происходило связывание плДНК с гистоном, приводившее к полной потере мобильности комплексов при гель-электрофорезе. Соответственно соотношение 1:0,1 было выбрано как заведомо меньшее, при котором комплекс плДНК/Н1.3 не менял электрофоретической активности (Рис. 1).

Эффективным соотношением в данном случае является массовое соотношение плДНК/Н1.3. 1: (0,1-3).

Клетки НЕК293Т культивируют в 24-луночном планшете до плотности клеточного монослоя 60-70%. Трансфекционную смесь для каждого соотношения готовят в 1,5 мл пробирке: к 50 мкл 0,5 М CaCl2 добавляют 1 мкг плДНК и необходимое количество гистона Н1.3. Смесь перемешивали на вортексе, осаждали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После инкубации смесь по каплям добавляли в 15 мл пробирку, содержащую 50 мкл 2× раствора HBS, одновременно перемешивая содержимое на вортексе. Смесь инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре и добавляют к клеткам (100 мкл на лунку). Через 6-8 часов после трансфекции меняют культуральную среду на свежую.

В качестве контроля проводят трансфекцию клеток НЕК293Т кальций-фосфатным методом без добавления гистона Н1.3.

Эффективность трансфекции определяют по экспрессии репортерного гена egfp (плазмида pEGFP-N2) методом проточной цитофлуориметрии. В связи с тем, что популяция клеток обладает естественной гетерогенностью по уровню автофлуоресценции, пороговое значение флуоресценции было выбрано таким образом, что 99,27% клеток считались не флуоресцирующими, а 0,73% клеток, соответственно, считались ложно-положительными по флуоресценции (Рис. 2А).

Было показано, что добавление гистона Н1.3 в соотношении с плДНК 1:0,1 (w:w) к трансфекционной смеси повысило эффективность трансфекции на 41% (58% EGFP-позитивных клеток) (Рис. 2 В) по сравнению с клетками, трансфицированными кальций-фосфатным методом без добавления гистона H1 (41% EGFP-позитивных клеток) (Рис. 2Б). Добавление гистона H1.3 в соотношении с плДНК 1:3 (w:w) к трансфекционной смеси повысило эффективность трансфекции на 29% (53%) EGFP-позитивных клеток по сравнению с клетками, трансфицированными кальций-фосфатным методом без добавления гистона Н1.3 (Рис. 2Г).

Стоит отметить, что максимальная эффективность достигалась при добавлении небольшой концентрации гистона, что не приводило к полному связыванию плДНК, таким образом, ДНК продолжала нести суммарный отрицательный заряд (соотношение плДНК/Н1.3 (w:w) 1:0,1), необходимый для комплексообразования с фосфатом. В то же время наличие единичных молекул гистона Н1.3 на плДНК, возможно, повышало эффективность ядерного транспорта после проникновения комплексов в клетку.

Обобщенные результаты исследования приведены на рисунке 3.

Поскольку с помощью кальций фосфатного метода эффективно трасфицируется широкий спектр клеток млекомпитающих, включая (но не ограничено) СНО, 293, COS, HeLa и др[1], а механизм комплексообразования плДНК/H1.3 и плДНК/Н1.3 с фосфатами является универсальным, то предложенный способ введения нуклеиновых с применением гистона будет также эффективен для трансфекции других культур клеток.

Определение эффективности трансфекции клеток-мишеней HeLa, MCF7, hTGSC (МСК) и фибробластов человека с помощью комплексов плазмидной ДНК/гистона Н1.3.

В качестве репортерного применялся ген gfp, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок GFP (плазмида pEGFP-N2). Анализ экспрессии GFP проводился с помощью стандартных методов флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии.

Трансфекция культур клеток HeLa, MCF7, hTGSC (МСК) и фибробластов человека проводили комплексами плазмидной ДНК/гистона Н 1.3 в различных комбинациях. В качестве положительного контроля использовали трансфекционный агент TransFast (Promega, США) согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Приготовление комплексов плазмидной ДНК/гистона Н1.3 для трансфекции.

Комплексы плазмидной ДНК и гистона Н 1.3 готовили в 150 мМ физрастворе. Для этого в пробирку, содержащую 1 мкг плазмидной ДНК (pEGFP-N2) в 95 мкл физраствора, добавляли 5 мкл раствора гистона H1.3 (в разных концентрациях). Смесь перемешивали на вортексе, осаждали и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего использовали для трансфекции культур клеток.

Трансфекция культур клеток HeLa, MCF7, hTGSC (МСК) и фибробластов человека комплексами плазмидной ДНК/гистона Н1.3.

Для трансфекции применяли 24-луночные культуральные планшеты. Использовалась культура клеток с плотностью монослоя 60-70%.

В лунках культурального планшета меняли среду на свежую DMEM (500 мл на лунку), содержащую 10% FBS и 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина. К среде добавляли по 100 мкл комплексов плазмидной ДНК/гистона Н 1.3. Анализ экспрессии проводили через 24 часа после трансфекции.

Трансфекция клеточных культур с помощью трансфекционного агента TransFast.

TransFast (Promega, США) трансфекционный агент - представитель липосомного метода трансфекции, при котором молекулы плазмидной ДНК упаковываются в липидные визикулы [7-8]. При контакте ДНК-содержащих липосом с клеточной мембраной происходит слияние липидных слоев и внедрение генетического материала внутрь клетки.

Для трансфекции применяли 24-луночные культуральные планшеты. Использовалась культура клеток с плотностью монослоя 60-70%.

К 200 мкл культуральной среды без сыворотки DMEM добавляли 6 мкл трансфекционного агента TransFast, смесь тщательно перемешали на вортексе. В смесь добавляли 1 мкг плазмидной ДНК, смесь тщательно перемешивали, осаждали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем культуральную среду удаляли с клеток аспирированием и трансфекционную смесь наносили на клетки. Планшеты инкубировали 1 час в инкубаторе при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, после чего в каждую лунку добавляли 1 мл полноценной культуральной среды DMEM, содержащую 10% FBS и 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина. Анализ экспрессии проводили через 24 часа после трансфекции.

Эффективность трансфекции с помощью гистоновых и других ядерных белков зависит от типа белка и условий трансфекции. Например, было показано, что экстракт гистонов из тимуса теленка и из куриных эритроцитов способен связывать ДНК и трансфицировать различные культуры клеток. Однако исследователи наблюдали лишь незначительную экспрессию репортерных генов (Schneeweiss, Buyens et al.). В экспериментах in vitro гистоны H1 и H2A показали низкую эффективность трансфекции как первичных, так и трансформированных культур клеток (Tomita, Higaki et al. 1992; Demirhan, Hasselmayer et al. 1998). Weng с соавторами показали, что гистон из Pyrococcus horikoshii не эффективен для доставки рекомбинантного генетического материала в культуры клеток различных линий (NIH 3Т3, НЕК293, HL-7702, HepG2, COS7, HeLa и др.), даже в присутствии Са2+ (Weng, Liu et al. 2004). Аналогичные результаты получила группа Lucius с соавторами и Balicki с соавторами при трансфекции клеток с помощью гистона H1 без ко-фактора и в присутствии Са2+ (Balicki and Beutler 1997; Lucius, Haberland et al. 2001). Из описанных экспериментальных данных можно сделать вывод, что эффективность трансфекции зависит от типа гистонового белка, не все гистоны способны эффективно опосредовать трансфекцию клеток. Другие ядерные и гистоноподобные белки также могут быть низкоэффективными для трансфекции клеток как in vitro, так и invivo (Bottger, Vogel et al. 1988; Sawa, Suzuki et al. 1995; Namiki, Takahashi et al. 1998; Haberland, Dalluge et al. 1999).

Результаты эффективности трансфекции клеток-мишеней HeLa, MCF7, hTGSC (МСК) и фибробластов человека с помощью комплексов плазмидной ДНК/гистона Н1.3.

Для исследования эффективности трансфекции с помощью гистона Н1.3 в качестве репортерного применяли ген gfp, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок GFP (плазмида pEGFP-N2, 1 мкг на лунку). Анализ экспрессии белка GFP проводили с помощью стандартных методов флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Трансфекцию культур клеток HeLa, MCF7, hTGSC (МСК) и фибробластов человека проводили комплексами плазмидной ДНК/гистон Н1.3 в различных соотношениях - 1:2,5, 1:25, 1:125 и 1:250 (w:w). В качестве положительного контроля использовали реагент TransFast (Promega, США). Через 24 часа после инкубации с комплексами плазмидной ДНК/гистона Н 1.3 оценивали степень зеленой флуоресценции клеток-мишеней. Зеленую флуоресценцию наблюдали только при использовании для трансфекции комплексов плазмидной ДНК/гистона Н 1.3 при соотношении 1:125 (Рис. 4, Рис. 5, Рис. 6, Рис. 7,). По сравнению с трансфекционным агентом TransFast, эффективность трансфекции гистоном Н1.3 всех исследуемых клеточных культур была значительно ниже. Проточная цитофлуометрия трансфицированных клеточных культур подтвердила низкую эффективность трансфекции с помощью гистона Н1.3: при трансфекции культуры клеток hTGSC гистоном Н1:3 процент GFP-позитивных клеток составил 0,96% при фоновом уровне флуоресценции 0,19% (Рис. 8, Таблица 1). Для трансфекционного агента TransFast (положительный контроль) процент GFP-позитивных клеток составил 11,57% (Рис. 8). При трансфекции как с помощью гистона Н1.3, так и агента TransFast, физические параметры клеточной культуры не изменились (Рис. 9).

Приведенные примеры показывают полезность изобретения для генетической инженерии, в частности, для введения рекомбинантных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки in vitro. Способ введения рекомбинантных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки может найти применение в получении генетически модифицированных клеток в биологии, биотехнологии, медицине и ветеринарии.

Источники информации

1. Jordan, М., A. Schallhorn, et al. (1996). "Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation." Nucleic Acids Res 24(4):596-601.

2. Chen, C. and H. Okayama (1987). "High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA." Mol Cell Biol 7(8):2745-2752.

3. Hassan, M.A., I.S. Ahmed, et al. (2012). "Enhanced gene transfection using calcium phosphate co-precipitates and low-intensity pulsed ultrasound." Eur J Pharm Sci 47(4):768-773.

4. Wolf, D.P., J.A. Thomson, et al. (1990). "In vitro fertilization-embryo transfer in nonhuman primates: the technique and its applications." Mol Reprod Dev 27(3):261-280.

5. Davis, H.L., R.G. Whalen, et al. (1993). "Direct gene transfer into skeletal muscle in vivo: factors affecting efficiency of transfer and stability of expression." Hum Gene Ther 4(2):151-159.

6. Kofron, M.D. and С.T. Laurencin (2004). "Development of a calcium phosphate co-precipitate/poly(lactide-co-glycolide) DNA delivery system: release kinetics and cellular transfection studies." Biomaterials 25(13):2637-2643.

7. Balicki, D. and E. Beutler (1997). "Histone H2A significantly enhances in vitro DNA transfection." Mol Med 3(11):782-787.

8. Bottger, M., F. Vogel, et al. (1988). "Condensation of vector DNA by the chromosomal protein HMG1 results in efficient transfection." Biochim Biophys Acta 950(2):221-228.

9. Demirhan, I., O. Hasselmayer, et al. (1998). "Histone-mediated transfer and expression of the HIV- tat gene in Jurkat cells." J Hum Virol 1(7):430-440.

10. Haberland, A., R. Dalluge, et al. (1999). "Ligand-histone H1 conjugates: increased solubility of DNA complexes, but no enhanced transfection activity." Somat Cell Mol Genet 25(4):237-245.

11. Lucius, H., A. Haberland, et al. (2001). "Structure of transfection-active histone Hl/DNA complexes." Mol Biol Rep 28(3):157-165.

12. Namiki, Y., T. Takahashi, et al. (1998). "Gene transduction for disseminated intraperitoneal tumor using cationic liposomes containing non-histone chromatin proteins: cationic liposomal gene therapy of carcinomatosa." Gene Ther 5(2):240-246.

13. Sawa, Y., K. Suzuki, et al. (1995). "Efficiency of in vivo gene transfection into transplanted rat heart by coronary infusion of HVJ liposome." Circulation 92(9 Suppl):11479-482

14. Schneeweiss, A., K. Buyens, et al. "Synergistic effects between natural histone mixtures and polyethylenimine in non-viral gene delivery in vitro." Int J Pharm 400(1-2):86-95.

15. Tomita, N., J. Higaki, et al. (1992). "Direct in vivo gene introduction into rat kidney." Biochem Biophys Res Commun 186(1):129-134.

16. Weng, L., D. Liu, et al. (2004). "An archaeal histone-like protein as an efficient DNA carrier in gene transfer." Biochim Biophys Acta 1702(2):209-216.

Способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки, предусматривающий трансфекцию методом кальций-фосфатной преципитации в присутствии гистона Н1.3 в эффективном количестве.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области генной инженерии и генной терапии и может быть использовано для стимуляции роста и регенерации нервов и восстановления иннервации ишемизированных тканей.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии. Предложен способ получения представляющего интерес белка, включающему введение вектора экспрессии белка, который включает генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные Tol1 или Tol2 последовательности на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего СНО, адаптированную к суспензионному культивированию, или клетку PER.C6, клетки крысиной миеломы YB2/3HL.Р2.G11.16Ag.20 (или также называемой YB2/0), или клетку мышиной миеломы NS0, адаптированную к суспензионному культивированию; интегрирование генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего для получения клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок; и суспензионное культивирование клетки млекопитающего; при этом суспензионная клетка млекопитающего способна экспрессировать представляющий интерес белок, а также предложены способ получения клетки млекопитающего, соответствующая рекомбинантная клетка и применение вектора экспрессии.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к соединениям и композициям для ослабления экспрессии гентингтина. Заявлены варианты одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида, ингибирующего экспрессию гентингтина.

Изобретение относится к биохимии. Представлен набор олигонуклеотидных праймеров, инициирующий амплификацию полной нуклеотидной последовательности СР-гена PVY методом ОТ-ПЦР.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой дипептид-продуцирующую бактерию рода Escherichia, которая модифицирована таким образом, что она содержит ДНК, кодирующую белок с дипептид-синтезирующей активностью.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный вариант субтилизина Bacillus, где указанный вариант субтилизина является зрелой формой, обладающей активностью субтилизина и содержащий замену в положениях 118 и 213, где нумерация положений соответствует аминокислотной последовательности субтилизина BPN′ В.

Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии. Описано получение синтетических генов D3S, D3E и D3D, оптимизированных для гетерологичной экспрессии в непатогенных лабораторных штаммах Escherichia coli.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен выделенный пептид, обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) в присутствии антигенпредставляющих клеток (АПК), несущих HLA-A*2402, и представляющий собой фрагмент белка FOXM1.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, молекулярной генетики и клеточной биологии, в частности к применению ДНК-конструкции для индуцирования в мезенхимных стволовых клетках выраженного адаптивного ответа.

Настоящее изобретение относится к миметикам ПАР и способу их получения для создания новых медицинских препаратов общей формулы где Y - остаток нуклеозида, аминопроизводного алифатического соединения, флуоресцентного красителя; Z - остаток нуклеозида, (k+1)·m=1-200; X является О или S; R1 и R2 являются остатком дисахаридного нуклеозида или остаток формул где n=2-6; 2-6 или 1-4 соответственно, N=остаток нуклеозида, или -((CH2)nO)m-(P=X(OH))O-N-, где n=2-6, m=1-6, R3 представляет собой разветвитель формулы где N′- остаток дисахаридного нуклеозида, n число до 100, или остаток формул n=2-6; или n=2-6; или n=1-4 где В=аденин-9-ил, урацил-1-ил, цитозин-1-ил или гуанин-9-ил.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к антисмысловым олигомерам, используемым в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях для лечения мышечной дистрофии. Антисмысловой олигомер состоит из нуклеотидной последовательности, 100% комплементарной нуклеотидной последовательности-мишени или нуклеотидной последовательности, в которой 1 или 2 нуклеотида, не комплементарные нуклеотидной последовательности-мишени, содержатся в нуклеотидной последовательности, 100% комплементарной нуклеотидной последовательности-мишени. Нуклеотидная последовательность-мишень представляет собой любую из последовательностей, состоящую из нуклеотидов с 32-го по 56-й или с 36-го по 56-й с 5′-конца 53-го экзона в гене дистрофина человека. При этом 53-й экзон в гене дистрофина человека обладает нуклеотидной последовательностью, выбранной из (a) и (b): (a) нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 и (b) нуклеотидная последовательность, обладающая по меньшей мере 90% идентичностью с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. Данный олигомер эффективно обеспечивает вызов пропуска 53-го экзона в гене дистрофина человека. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 19 ил., 7 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлен лиганд гликопротеина VI (GPVI), представляющий собой нуклеиновую кислоту, который взаимодействует с гликопротеином тромбоцитов GPVI и модулирует его активность с регуляцией функции тромбоцитов. Лиганд имеет вторичную структуру, содержащую в направлении от 5′ к 3′ первый стебель, первую петлю, второй стебель, вторую петлю, третью петлю, третий стебель и четвертую петлю. Четвертая петля содержит UAA. Последовательность лиганда модифицирована для увеличения устойчивости к нуклеазам. Лиганд может применяться для ингибирования агрегации тромбоцитов. Также представлены модуляторы, ингибирующие активность лиганда, с восстановлением функции GPVI. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим лиганд или модулятор, предназначенным для лечения опосредуемых тромбоцитами нарушений. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 39 ил., 7 табл., 8 пр.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии. Сущность изобретения состоит в подавлении активности активированного онкогена AML-ETO методом РНК-интерференции в злокачественных кроветворных клетках, полученных от больных лейкозом, с использованием конструкции малой шпилечной РНК, встроенной в лентивирусный вектор pLSLP-AML-ETO-shRNA, кодируемой нуклеотидной последовательностью двухцепочечной ДНК, представляющей собой: 5′-р-gatccgCCTCGAAATCGTACTGAGActtcctgcaa TCTCAGTACGATTTCGAGGtttttg-3′ (смысловая цепь), 5′-р-aattcaaaaaCCTCGAAATCGTACT GAGAttgcaggaagTCTCAGTACGATTTCGAGGcg-3′ (антисмысловая цепь). Ингибирование активности конкретного онкогена посредством малой шпилечной РНК позволяет определить спектр изменения экспрессии генов, ответственных за рост и дифференцировку кроветворных клеток, и обнаружить те из них, изменение активности которых напрямую связано с активацией данного онкогена, и определить, в какой мере воздействие на такие гены - потенциальные мишени оказывает влияние на способность злокачественных клеток к неконтролируемому росту. 2 н.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл. 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекулам нуклеиновой кислоты для модуляции экспрессии генов-мишеней. Заявлена двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии гена белка теплового шока 47 (hsp47). Также представлены композиция, включающая указанную молекулу нуклеиновой кислоты, и способ лечения пациента, страдающего от заболевания, связанного с hsp47. Изобретение может быть использовано для лечения ассоциированных с hsp47 состояний и нарушений, таких как фиброз печени, фиброз легких, фиброз брюшины и фиброз почек. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 27 ил., 31 табл., 10 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный вариант субтилизина Bacillus. Изобретение относится также к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вариант субтилизина, вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту, клетке-хозяину, способной экспрессировать вариант субтилизина, а также к чистящей композиции, содержащей вариант субтилизина и способу очистки. Изобретение позволяет получать вариант субтилизина с улучшенными моющими свойствами. 7 н. и 8 з.п. ф-лы, 17 табл., 17 пр.

Изобретение относится к биохимии. Раскрыты способы повышения экспрессии полинуклеотида PAR4, включающие осуществление контакта с по меньшей мере одним олигонуклеотидом длиной от 15 до 30 нуклеотидов, который нацелен на природную антисмысловую последовательность для полинуклеотида PAR4, и при этом указанная природная антисмысловая последовательность имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Представлен синтетический модифицированный олигонуклеотид длиной от 15 до 30 нуклеотидов и фармацевтическая композиция, содержащая указанный олигонуклеотид. Раскрыт способ индукции апоптоза в биологической системе, экспрессирующей или с приобретенной способностью экспрессировать продукты генов PAR4, включающий введение олигонуклеотида длиной от 15 до 30 нуклеотидов в указанную систему, который нацелен на природную антисмысловую последовательность SEQ ID NO: 2 полинуклеотида PAR4 и повышает экспрессию указанного полинуклеотида PAR4. Изобретение позволяет повышать экспрессию полинуклеотида PAR4. 6 н. и 22 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 3 пр.

Группа изобретений относится к обоасти биохимии и биотехнологии. Представлены аптамер, связывающийся с химазой и ингибирующий активность химазы, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную как X1GAUAGAN1N2UAAX2, где X1 и X2 идентичны или не идентичны друг другу и каждый означает A или G, а N1 и N2 идентичны или не идентичны друг другу и каждый означает A, G, C, U или T; комплекс, включающий аптамер и функциональное вещество, например вещество, обладающее сродством, вещество для мечения, фермент, средство доставки лекарственного средства, лекарственное средство; лекарственное средство или реагент, содержащее аптамер или комплекс; способы детекции и очистки химазы с использованием аптамера или комплекса. 9 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 9 табл., 9 пр.

Штаммы spnk // 2580015
Изобретения относятся к области молекулярной генетики и касаются способов преобразования продуцирующего спиносад штамма Saccharopolyspora spinosa в штамм, продуцирующий предшественника спинеторама (варианты), и генетически модифицированной клетки-хозяина Saccharopolyspora spinosa. Охарактеризованные способы включают внесение модификации в ген spnK или выключение гена spnK при сохранении продуцирования спинозина J и L для устранения активности 3′-O-метилтрансферазы с получением генетически модифицированной клетки-хозяина Saccharopolyspora spinosa, продуцирующей предшественник спинеторама. Причем указанная модификация является точковой мутацией, находящейся в положении пары оснований, выбранном из группы, состоящей из положений 528, 589, 602, 668, 721, 794, 862, 895, 908, 937 и 1131. Изобретения позволяют продуцировать спинозин с большей эффективностью. 3 н. и 2 з.п.ф-лы, 6 ил., 6 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлен набор дифференцирующих олигонуклеотидов для анализа полиморфизма в генах АВ0, HLA-DQA1, AMEL, DARC, NAT2 с помощью технологии гидрогелевых ДНК-микрочипов (биочипов). Биочип обеспечивает возможность определить нуклеотидный состав в четырнадцати полиморфных позициях, что, в свою очередь, позволяет установить генотип в вышеуказанных генах. Также представлен набор ПЦР-праймеров для амплификации вышеуказанных локусов. Изобретение позволяет повысить дискриминационный потенциал биочипа (36450 генотипичеких групп). 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 4 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к миРНК и ее применениям для лечения легочного фиброза и рака легких. миРНК имеет полную длину от 17 до 23 нуклеотидов и нацелена на последовательность, содержащую от 17 до 23 идущих подряд оснований, выбранных из группы, состоящей из оснований в положениях с 1285 по 1318, оснований в положениях с 1398 по 1418, оснований в положениях с 1434 по 1463, оснований в положениях с 1548 по 1579, оснований в положениях с 1608 по 1628, оснований в положениях с 1700 по 1726, оснований в положениях с 1778 по 1798, оснований в положениях с 1806 по 1826 и оснований в положениях с 1887 по 1907 последовательности SEQ ID NO: 1, для использования в эффективном ингибировании и подавлении экспрессии гена TGF-β1, при гибридизации. 13 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 ил., 10 табл., 9 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2015-09-20 2015-09-19T15:47:33
Наверх